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Artigo de método

Síntese de Bioconjugados de proteínas

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DOI:

10.3791/54157

⸱

20 de julho de 2016

 , 
1School of Chemistry, The Australian Centre for Nanomedicine and the ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, The University of New South Wales

Neste artigo

Resumo

Detalhes do presente Protocolo, os passos importantes necessários para a bioconjugação de uma cisteína contendo proteína para uma maleimida, incluindo a purificação de reagentes, condições de reacção, purificação e caracterização de bioconjugados bioconjugado.

Resumo

A ligação química ou bioconjugação de proteínas a corantes fluorescentes, drogas, polímeros e outras proteínas tem uma ampla gama de aplicações, como o desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga (ADCs) e nanomedicina, microscopia fluorescente e química de sistemas. Para muitas dessas aplicações, a especificidade do método de bioconjugação usado é a principal preocupação. A adição de Michael de maleimidas com cisteína(s) nas proteínas-alvo é altamente seletiva e ocorre rapidamente em condições amenas, tornando-se um dos métodos mais populares para bioconjugação de proteínas.

Demonstramos aqui a modificação do único resíduo de cisteína acessível à superfície no citocromo c de levedura com uma maleimida de biterpiridina de rutênio (II). A bioconjugação proteica é verificada por eletroforese em gel e purificada por cromatografia líquida de proteína rápida de base aquosa em 27% de rendimento de material proteico isolado. A caracterização estrutural com MALDI-TOF MS e UV-Vis é então usada para verificar se a bioconjugação é bem-sucedida. O protocolo mostrado aqui é facilmente aplicável a outro acoplamento de proteínas cisteína - maleimida a outras proteínas, corantes, drogas ou polímeros.

Introdução

Bioconjugação envolve a ligação covalente de biomoléculas com um outro ou com uma molécula sintética, tal como um corante, ou um polímero de drogas. Métodos bioconjugação proteína são agora amplamente utilizados em muitos grupos de pesquisa química, biologia e nanotecnologia, com aplicações que vão desde a rotulagem corante fluorescente 1,2, fazendo de proteínas (anticorpos) -prodrugs 3 (conjugados de medicamentos com anticorpos - ADCs) síntese de dímeros da proteína de 4,5 , por meio de híbridos de proteína-polímero de auto-montagem 6,7 utilizados em nanomedicina 8 e sistemas química 9.

Especificidade da química utilizada para bioconjugação, embora nem sempre seja crítica, é de extrema importância para bioconjugados proteína mais funcionais, de modo a não interferir com o local activo da proteína alvo. A reação bioconjugação ideal precisa cumprir vários critérios, incluindo: i) segmentação locais raras ou únicas sobre a proteína de interesse,ii) ser selectivo em relação a este alvo, iii) prosseguir sob condições não desnaturantes para evitar a proteína se desdobrar e iv) ser de alto rendimento como a proteína alvo está geralmente disponível apenas em concentração sub-milimolar. A maleimida - cisteína Michael disso vem perto de cumprir todos estes critérios, e tem por essa razão muito reivindicada um estatuto especial no campo da química bioconjugado 10. Isto é porque i) muitas proteínas que contenham resíduos apenas uma cisteína na sua superfície podem ser geneticamente manipulados há, ii) ao valor de pH correcto a reacção é altamente selectiva para com a cisteína, iii) prossegue suavemente em tampões aquosos e IV) é muito rápido com a segunda constante de velocidade a fim de maleimidas a proteínas contendo cisteína relatados para exceder 5000 M-1 s-1, em alguns casos 11. Desde que a proteína de interesse pode tolerar uma quantidade pequena (≈ 5-10%) de co-solvente orgânico 12, quase todo o corante funcionalizado com maleimida, poLymer, ou outra proteína de superfície pode ser ligada a proteínas. Além disso, as maleimidas são específicas para mais cisteínas em proteínas do que iodoacetamidas, que são mais propensos a reagir com outros nucleófilos a pH elevado; e mais estável do que conjugações à base de dissulfureto, que devem ser mantidos a pH ácido para impedir a permuta de dissulfureto 13.

Aqui relatamos um protocolo genérico para a conjugação de moléculas funcionalizado com maleimida para uma proteína que contém um único resíduo de cisteína utilizando a reacção entre um de Ru (II), com base na cromóforo e a proteína redox citocromo C como um exemplo. Este protocolo é igualmente aplicável para a maioria das outras proteínas contendo um resíduo de cisteína superfície acessível e o alvo funcionalizado com maleimida correspondente, seja uma outra proteína, um corante fluorescente, um cromóforo ou um polímero sintético.

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Protocolo

Nota: O seguinte protocolo é concebido para a síntese de um bioconjugado de proteína-corante, como mostrado na Figura 1 É um protocolo geral para a reacção de uma maleimida com cisteína superfície livre que contêm proteínas, com as notas inseridas onde aplicável para ajudar com a proteína de membrana. bioconjugados, bioconjugados de proteína-polímero, e dímero de proteína sintética (proteína-proteína) bioconjugados. Neste caso particular, a proteína 1 de iso-citocromo C tem um resíduo de cisteína disponível para reagir superfície que permite uma marcação altamente específico para ocorrer. Se uma proteína de interesse tem múltiplos resíduos de cisteína, o mesmo protocolo aplicável, embora com a perda de especificidade e homogeneidade do produto. Resíduos de lisina superfície Química segmentação, usando n hidroxissuccinimidilo ésteres ou isotiocianatos, pode ser uma abordagem mais simples se a especificidade não é necessária.

figure-protocol-1
Figura 1. Esquema de Reacção bioconjugação. Como um exemplo de caso, uma colheita de luz, molécula antena baseada em ruténio vai ser ligado a citocromo C por meio de adição de Michael de um pingente maleimida na molécula antena baseada em ruténio e um resíduo de cisteína exposto (CYS102) na proteína. A área vermelha da superfície do cit c indica o grupo heme. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. A purificação do citocromo C

Nota: Este passo não é aplicável para todas as proteínas. No entanto, é importante saber que uma proteína obtida a partir de um fornecedor comercial, pode conter outras isoformas de proteínas não desejadas que podem necessitar de ser removido por purificação adicional 13.

  1. Dissolve-se 2,4 g de di-hidrogenofosfato de sódio (M w = 120 g mol-1) em 1 L de água ultrapura ao PRepare uma solução tampão contendo 20 mM de NaH 2 PO 4. Ajustar o pH com NaOH 1 M para pH 7.
    Nota: Os tampões de fosfato utilizados no presente protocolo deve ser preparado de fresco numa base diária, e filtrada através de um filtro de membrana de celulose de 0,2 um antes da utilização.
  2. Dissolve-se 29,22 g de cloreto de sódio (M w = 58,44 g mol-1) em 500 ml de tampão de NaH 2 PO 4 20 mM para fazer uma mM de NaH 2 PO 4 20 e tampão de NaCl 1 M. Este é o tampão de eluição para a purificação no passo 1.6).
  3. Dissolve-se 12,0 mg de liofilizado de citocromo C (cyt C) em 6 ml de pH 7 a 20 mM de tampão de fosfato.
  4. Separadamente dissolver 14,7 mg de ditiotreitol (DTT, M w = 154,25 g / mol) em 95,3 ul de água ultrapura para preparar uma solução de reserva 1 M.
    Nota: A solução de estoque de DTT deve ser preparado de fresco, quando o reagente é susceptível a desactivação oxidativa em solução aquosa.
  5. Pipette 60 ul de solução de 1 M DTT para a solução de proteína para reduzir o citocromo c. A cor da solução muda de vermelho escuro para vermelho claro após a mistura.
  6. Filtrar a solução de proteína reduzida através de um filtro de seringa PVDF de ligação 0,22 baixa proteína antes de injetar em qualquer mídia cromatográfica.
  7. Anexar uma coluna de troca catiônica 3,3 ml forte entre o septo de injecção e detector UV-Vis de um Cromatografia Líquida (FPLC) instrumento rápido Protein.
  8. Equilibrar a coluna com 3 volumes de coluna de água ultrapura, seguido por 3 volumes de tampão fosfato pH 7 a 20 mM de coluna, utilizando uma taxa de fluxo de 1 ml / min.
  9. Carga 1 ml de reduzida cit bruto c para o ciclo de injeção, e iniciar um método de gradiente de 328-450 mM de NaCl, ao longo de 5 volumes de coluna. Monitorar os 280 nm e 410 nm canais do detector UV-Vis, e recolher o maior pico.
  10. Aumentar a concentração de sal a 1 M para 2 volumes de coluna para eluir iso-2 citocromoe C, e depois a coluna foi lavada, re-equilibrar a coluna com 2 volumes de tampão fosfato 20 mM de coluna antes de injectar o próximo aliquota em bruto.
  11. Repita os passos 1,9-1,10 até que toda a proteína em bruto foi purificado.
  12. Reunir as fracções contendo iso-1 e concentrá-los usando um 3,5 kDa de peso molecular de corte (MWCO) filtro de centrifugação e centrifugação a 3.000 x g.
  13. Carregar a proteína concentrada em 3,5 cassetes de diálise kDa MWCO e diálise contra ultrapura água durante a noite, com 2 mudanças de água.
  14. Determinar a concentração da solução de proteína pura, concentrou-se, tendo de 10 ul, diluindo-a com 100 ul de água ultrapura, e tendo um espectro de absorvância. Use um volume baixo, 100 ul cuvette de quartzo para obter espectros absorção de proteínas. Tipicamente, a concentração de proteína não diluído é da ordem de 50 - 100 pM.
    1. Use a característica de pico 410 nm de cit c quantificar o Concentraçãn usando a lei de Beer-Lambert com um valor de absortividade molar de 97,6 cm -1 mM -1:
      A = ε × c × ι
      em que A é a absorvância, ε é a absortividade molar, c é a concentração de mM, e ι é o comprimento do percurso da tina em 13 cm.
  15. Neste ponto, a proteína dividir em alíquotas de 1 ml e manter congelados a -20 ° C até serem necessárias. Cit c podem ser congeladas e descongeladas sem perda da estrutura ou função, mas os ciclos de repetição irá começar a desnaturar a proteína.
    Nota: Proteínas tolerar o congelamento em graus diferentes. Por exemplo, proteínas fluorescentes verdes 5,9 não deve ser congelado, em vez armazenada no frigorífico.

2. Síntese de citocromo c bioconjugados

  1. Dissolve-se 0,9 mg de ruténio (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) 2 -maleimida, 0,975 mol, 6 equivalentes) em 600 ul de acetonitrilo.
    Nota: Se a maleimida usado é solúvel em água, preparar uma solução de reserva em água em vez de acetonitrilo. É importante para a maleimida para ser solúvel no tampão de reacção. Dimetilsulfóxido, N, N-dimetilformamida, acetonitrilo e são comumente utilizados adjuvantes para auxiliar na dissolução de baixo peso molecular de 12, muitas vezes os reagentes de maleimida hidrofóbicos.
  2. Prepara-se uma solução tampão contendo tampão fosfato 100 mM e 100 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, M w = 292,24 g / mol), que, quando diluídas para 20 mM a pH 7. Adiciona-se hidróxido de sódio sólido até que o EDTA é dissolvido (tipicamente vários gramas ) e ajustar o pH a 7.
  3. Dissolve-se 2,87 mg de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) em 1 ml de água ultrapura para preparar uma solução stock de 10 mM. Esta etapa é a importaçãoformiga para assegurar que a cisteína na proteína é completamente reduzido antes da maleimida acoplamento 15.
    Nota: A solução stock de TCEP deve ser preparada de fresco para cada reacção, quando o reagente é susceptível a desactivação oxidativa em solução aquosa.
  4. Combine 11,4 ml de água ultrapura com 3 ml de solução de partida de fosfato / EDTA 100 mM num tubo de plástico de 50 ml. Quando diluída ainda mais com soluções de proteína e banco de maleimida a concentração do tampão será de 20 mM.
    Nota: Se a proteína a ser marcado é uma proteína transmembranar, assegurar que um detergente adequado é adicionado ao tampão para solubilizar a proteína. Se um detergente não é utilizada a proteína de membrana pode-se lentamente precipitar, o que terá um impacto negativo rendimentos da reacção. Usar o detergente em todos os passos de purificação subsequentes.
  5. Adicionar 0,15 umol (3 ml de uma solução a 50 ^ M, 1 equivalente) de purificado cit c para o tampão de fosfato-EDTA.
  6. Adicionar 7,5 mL do estoque solut TCEPde iões (0,075 mol, 0,5 equivalentes) à solução de proteína e deixar de se agitar durante 5 minutos para reduzir qualquer proteína que pode ter dimerizado devido à oxidação de cisteína.
    Nota: Não adicione TCEP se a proteína de interesse não dimerize prontamente. Verifique isto executando um gel de proteína, sob condições não redutoras.
  7. Adicionar 600 ul da solução de acetonitrilo de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida para a solução reduzida, tamponada de citocromo C, e deixar a mistura reaccional sob agitação, no escuro, à TA, durante 24 h.
  8. Concentra-se a mistura de reacção usando filtros de spin 3,5 kDa MWCO, centrifugação a 3000 xg, repetindo-se 2-3 vezes com tampão fosfato 20 mM fresco até que o filtrado corre claro. Remover o máximo de maleimida que não reagiu a partir da mistura reaccional quanto possível antes que a próxima etapa de purificação.
    Nota: Neste ponto, a mistura de bioconjugação em bruto pode ser armazenado no frigorífico, no escuro. É importante remover a tintura maleimida que não reagiu por centrifuge diálise antes da armazenagem como a maleimida pode-se lentamente e de forma não específica reagir com resíduos de lisina na superfície da proteína.

3. Purificação de citocromo c bioconjugados

  1. Dissolve-se 2,4 g de di-hidrogenofosfato de sódio e 29,22 g de cloreto de sódio em 1 L de água ultrapura para preparar uma solução tampão contendo 20 mM de NaH 2 PO 4 e NaCl 0,5 M. Este é o tampão de corrida para a purificação por cromatografia de afinidade de metal-imobilizado (IMAC).
  2. Dissolve-se 17 g de imidazol (M w = 68,077 g mol-1) em 500 ml de 20 mM de NaH 2 PO 4 e tampão de 0,5 M de NaCl. Este é o tampão de eluição para a purificação IMAC.
  3. Ajustar o pH de ambas as memórias intermédias para pH 7 utilizando 1 M de NaOH ou HCl, e filtrá-los através de membranas de 0,22 um antes da utilização de celulose regenerada na FPLC.
  4. Como as colunas IMAC comprados são enviados sem quaisquer iões metálicos carregados no colUMN, preparar a coluna para um de Ni 2+ com base na purificação por lavagem da coluna com 3 ml de água ultrapura, 3 ml de solução de acetato de níquel de 100 mM, e 6 ml de água ultrapura. Se a coluna não é para ser utilizada imediatamente através de lavar 3 ml de etanol a 20% e armazenar a coluna no frigorífico para prevenir o crescimento bacteriano.
  5. Anexar uma Ni 2+ -loaded 1 ml coluna IMAC ao FPLC entre o septo de injecção e detector UV-Vis.
  6. Equilibrar a coluna com 3 volumes de coluna de fosfato de 20 mM, tampão de NaCl 0,5 M utilizando uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min.
  7. Carga de 100 ul de mistura de reacção em bruto (filtrado através de um filtro de seringa de 0,22? M) na coluna de Ni 2+ IMAC. Lavar a coluna com 3 volumes de coluna de tampão de corrida para eluir não reagiu cyt C, seguido por um gradiente de imidazole 0-125 mM ao longo de 3 volumes de coluna para eluir o ruténio bisterpyridine-citocromo c bioconjugado (Ru (II) -CYT c) .
  8. Lavou-se a column com tampão de imidazole 250 mM para 5 volumes de coluna, em seguida, re-equilibrar a coluna com fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M e repetir o passo 3.7 até que todo o bioconjugado em bruto foi purificado.
  9. Reunir as fracções Bioconjugate e concentrá-los usando um kDa MWCO filtro de rotação 3.5, centrifugação a 3.000 x g.
  10. Carregar o bioconjugado concentrado em 3,5 cassetes de diálise kDa MWCO e diálise contra ultrapura água durante a noite, com 2 mudanças de água.
  11. Determinar a concentração da solução bioconjugado puro, concentrou-se por UV-Vis, utilizando o mesmo valor de absortividade molar de iso-1 citocromo C (97,6 mM -1 cm -1) a 410 nm. Tipicamente, a concentração bioconjugado é da ordem de 50 - 100 pM.
  12. Divida bioconjugado em 25 mL alíquotas e mantenha congelado a -20 ° C até serem necessárias.

4. Caracterização do citocromo C bioconjugados

  1. dissuadirminação da massa bioconjugado por MALDI-TOF MS
    1. Dissolve-se 10 mg de ácido cafeico, em 1 ml de uma solução de acetonitrilo / água / ácido trifluoroacético (80: 20: 0,1, v / v / v).
    2. Dilui-se 5 ul de solução de proteína concentrada com 5 ul de solução de ácido cafeico.
    3. Ponto de 0,5 uL de solução de ácido cafeico na placa alvo de MALDI e permitir que a solução seque.
    4. Ponto de 0,5 ul da solução da amostra / matriz em cima deste local ácido cafeico, permitir que o local para secar. Manchar mais 0,5 ul de matriz da amostra no topo desta para "sanduíche" a amostra entre as camadas de matriz e deixar secar.
    5. Adquirir espectros de massa no modo linear usando as configurações de instrumento adequado para proteínas 16.
  2. Investigação de bioconjugados por electroforese em gel
    1. Preparar 10 ul de cada amostra de proteína para ser executado por diluição de amostras de proteína pré-misturados com sulfato de dodecilo de lítio (LDS, pH 8,4) tampão (4x) tOA concentração final de aproximadamente 20 ug por poço. Para poços que requerem condições de redução, adicionar 1 ul de ditiotreitol 500 mM (DTT) agente (10x) de redução.
    2. amostras de calor a 70 ° C durante 10 min.
    3. Adicionar 50 ml da pré-mistura 1 M de MES, 1 de base Tris, 2% de SDS, 20 mM de EDTA (pH 7,7) executando mistura tampão (20x) de uma fonte comercial e 950 ml de água ultrapura para preparar o tampão de gel de escoamento.
    4. Remover o pente de plástico a partir do gel e colocar o gel no tanque de gel de corrida. Encher o tanque com tampão de gel de corrida de modo que as cavidades são cobertas com tampão.
    5. amostras de carga com cuidado sobre a pré-moldado 12% Bis-Tris, de 1 mm, gel de 10 poços utilizando pontas de pipeta longos para ajudar no carregamento. Carregar o prestained 10 proteína marcador de peso molecular (3-188 kDa) num poço de meio do gel para auxiliar a análise.
    6. Submeter o gel a 200 V de voltagem constante durante 35 min.
    7. Corar o gel com uma solução de azul de Coomassie comercial durante 2 horas, e lava-se com ultrapágua ure por 48 hr.
  3. Determinação da pureza bioconjugado por espectroscopia UV-Vis
    1. Prepare a 120 ul de 5 uM soluções de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida, iso-cit c 1, e Ru (II) -CYT C.
    2. Medir o espectro de linha de base da cuvete de quartzo contendo apenas água ultrapura, de 250 nm a 650 nm.
    3. Medir o espectro de cada componente, garantindo a cuvete é enxaguado e seco entre cada medição.
    4. Traça-se a absorvância de cada componente como uma função do comprimento de onda, e comparar a soma linear dos materiais de partida com o produto final para determinar se uma proporção de 1: 1 de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida para cit c reagiu.

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Resultados

A sintese de bioconjugados é confirmada por três métodos principais: laser assistida por matriz de Dessorção Ionização Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), electroforese em gel de poliacrilamida, e no ultravioleta-visível de espectroscopia (UV-VIS), como mostrado nas Figuras 2, 3 e 4. Um aumento de massa correspondente à massa da molécula pequena anexado, e a falta de uma proteína que não reagiu demonstra o êxito da ligação covalente de Ru (I...

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Discussão

Purificação das matérias-primas antes de uma bioconjugação é de extrema importância. As proteínas obtidas a partir de fontes recombinantes comerciais muitas vezes contêm outros isoformas da proteína de interesse, que pode ter a química de superfície e reactividade diferente. Por exemplo, no bioconjugação descrito, o cit disponível comercialmente c contém uma mistura de ambos iso-1 e iso-2 cit c 12,14,17. Iso-2 e as formas de citocromo c 1 iso-são em grande parte homóloga, com a prin...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Australian Research Council (ARC) pelas doações da ARC Future Fellowship (FT120100101) e do ARC Centre of Excellence CE140100036) ao P.T. e ao Mark Wainwright Analytical Center da UNSW pelo acesso às instalações de espectrometria de massa e RMN.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
di-hidrogenofosfato de sódioSigma-Aldrich71496
hidróxido de sódioSigma-Aldrich71691
cloreto de sódioSigma-Aldrich73575
citocromo c, de saccaromyces cerevisiaeSigma-AldrichC2436
ditiotreitolSigma-Aldrich43819
TSKgel SP-5PWSigma-AldrichTosoh SP-5PW, 07161Coluna de troca catiônica forte de 3,3 ml
Amicon Ultra-15 Merck-MilliporeUFC900308filtro de rotação de 3,5
kDa mini unidades de diálise Slide-A-LyzerThermo Scientific663333,5 kDa de diálise
Ru(II) maleimida bisterpiridinaLab madever ref (14)
acetonitrilaSigma-AldrichA3396
ácido etilenodiaminotetracéticoSigma-Aldrich03609
cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina Sigma-Aldrich93284
imidazolSigma-Aldrich56749
acetato de níquelSigma-Aldrich244066
AcroSep IMAC Hypercell columnPallvia VWR: 569-1008coluna IMAC de 1 ml
filtro de membrana de celulose de 0,2 mícronWhatmanZ697958filtro de 47 mm para tampões
filtro de membrana PVDF de 0,2 mícrondeseringaMerck-Millipore
ácido clorídricoSigma-Aldrich84426Extremamente corrosivo! Tenha cuidado.
ácido cafeicoSigma-Aldrich60018Ácido
trifluoroacéticoSigma-Aldrich91707extremamente corrosivo! Tenha cuidado
SimplyBlue SafeStainThermo ScientificLC6060Solução azul Coomassie
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris GelThermo ScientificNP0342BOXgéis de proteína pré-moldados
SeeBlue Plus2 Proteína pré-corada PadrãoThermo ScientificLC5925escada de proteína pré-fabricada
Tampão de amostra NuPAGE LDS (4x)Thermo ScientificNP0008tampão de amostra de gel pré-fabricado
Agente Redutor de Amostra NuPAGE (10x)redutor de gel pré-fabricadoThermo ScientificNP0004
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Thermo ScientificNP0002buffer de execução de gel pré-fabricado
Voyager DE STR MALDI refletron TOF MSApplied Biosystems
Acta FPLCGEFast Protein Liquid Chromatography
Varian-AgilentUV-Vis
Milli-Q Dispensador de água ultrapuraMerck-Millipore
Cubeta UV-Vis de baixo volumeHellma105-201-15-40Cubeta de 100 microlitros
Filtros SLGV013SL para proteínas da matriz MALDI Agente Dispensador de água ultrapura

Referências

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