Intracerebroventricular und intravaskuläre Injektion von Viruspartikeln und Fluorescent Microbeads in die neonatale Gehirn

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur intrazerebroventrikulären und intravaskulären Injektion von Viruspartikeln oder fluoreszierenden Mikrokügelchen in das Gehirn von Neugeborenen. Das Lokalisationsmuster des Virus und der Nanopartikel konnte durch mikroskopische Auswertung oder durch in situ Hybridisierung nachgewiesen werden.

Zusammenfassung

In der Studie über die Pathogenese von Virusenzephalitis, ist die Infektion Methode kritisch. Die erste der beiden Hauptinfektionswege zum Gehirn ist die hämatogene Route, die Infektion der Endothelzellen und Perizyten des Gehirns beinhaltet. Die zweite ist die intracerebroventricular (ICV) Route. Einmal innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS), ausbreiten können Viren auf den Subarachnoidalraum, Meningen und Plexus über den Liquor. In experimentellen Modellen werden die frühesten Stadien der ZNS-viralen Verbreitung nicht gut charakterisiert, und es ist unklar, ob nur bestimmte Zellen zunächst infiziert sind. Hier haben wir die Verteilung von Cytomegalovirus (CMV) Teilchen während der akuten Phase der Infektion untersucht, bezeichnet als primäre Virämie nach ICV oder intravaskulären (IV) Injektion in den neonatalen Mäusegehirn. Im ICV-Injektion-Modell, 5 ul murinen CMV (MCMV) oder fluoreszierenden Mikrokugeln wurden in den lateralen Ventrikel injiziert am midpoint zwischen dem Ohr und Auge, die eine 10-ul-Spritze mit einer Nadel 27 G verwendet wird. In der IV-Injektion-Modell, eine 1-ml-Spritze mit einer 35 G-Nadel verwendet wurde. Ein Durchleuchtungs wurde verwendet, um die oberflächliche zeitliche (facial) Vene des Neugeborenen Maus sichtbar zu machen. Wir infundiert 50 ul MCMV oder fluoreszierende Mikrokügelchen in die oberflächliche zeitliche Vene. Gehirne wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion geerntet. MCMV - Genome wurden unter Verwendung der in situ - Hybridisierungsverfahren nachgewiesen. Fluoreszierende Mikrokügelchen oder grün fluoreszierendes Protein exprimierenden rekombinanten MCMV Partikel wurden durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Diese Techniken können auf viele andere Pathogene angewendet werden, um die Pathogenese von Encephalitis zu untersuchen.

Einleitung

Wenn virale Enzephalitis zu studieren, ist die initiale Verteilung viraler Partikel sehr wichtig Krankheitsentstehung zu verstehen und virale Targets im Gehirn zu identifizieren. Die meisten Viren im Bereich von 20 bis 300 nm in der Größe, obwohl die Pandoraviren mehr als 700 nm ¹ groß ist. Die Verteilung der viralen Partikel in der akuten Phase der Infektion kann auf die Größe der Partikel abhängen, die Verteilung von zellulären Rezeptoren oder die Affinität der zellulären Rezeptoren für Viren. In Tiermodellen intracerebroventricular (ICV), intraperitoneale, direkte Plazenta und intravenöse (IV) Infektionen verwendet wurden, um die Pathogenese von Virusen....

Protokoll

Alle experimentellen Protokolle wurden von der Animal Care Committee von Hamamatsu Universität School of Medicine zugelassen.

1. Herstellung von MCMV (Smith-Stamm) und rekombinante M32-enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) -MCMV

1. Erzeugen rekombinante M32-EGFP-MCMV gemäß dem Verfahren wie folgt (1,2-1,9) und wie zuvor ⁸ beschrieben.
2. Verwenden Sie abgeleitete rekombinante Viren aus dem Smith-Stamm von Wildtyp MCMV (Zugangsnummer: U68299). Insert EGFP (4361 Basenpaare; bp) zwischen 37.089 und 41.450 bp (M32 - M31 Locus) im MCMV Genom durch homologe Rekombination.
3. Amplify durch Polymerase....

Ergebnisse

In Untersuchungen zur Pathogenese von viralen Enzephalitis, ist die Infektion Verfahren wichtig. Die hämatogenen Weg stellt eine akute Infektion der Endothelzellen und Perizyten des Gehirns, während der ICV Route eine akute Infektion stellt über das CSF durch den Subarachnoidalraum ausbreitet, bis zu den Meningen und Plexus choroideus. Um die erste Verteilung der Partikel in akuten Enzephalitis analysieren, in - situ - Hybridisierung der MCMV Genome und die direkte Beob.......

Diskussion

In Tiermodellen, ICV, intraperitoneale, direkte Plazenta und IV-Infektionen verwendet wurden, die Pathogenese von Virusenzephalitis zu studieren. Wir konzentrierten uns auf die ICV und IV-Injektion Modelle von neugeborenen Mäusen für die Einfachheit der Verfahren und der Nutzen der direkten Injektion von Partikeln in den Zielbereich. Obwohl intraperitoneale Infektion ist eine einfache Methode, verteilt Viruspartikel systemisch über einen indirekten Prozess ^5,24. Direkte plazentaren Infektion ist eine gute Met.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tris; Tris(hydroxymethyl)- Aminomethan	Sigma-Aldrich	T-6791
HCl	Sigma-Aldrich	H-1758
pEGFP-N1 Vektor	Clontech	#6085-1
D-Sorbit	Sigma-Aldrich	S-1876
SPHERO TM Fluoreszierendes Polystyrol Nilrot 0.04 - 0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Fluoreszierendes Polystyrol Nilrot 0,1 - 0,3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Fluoreszierendes Polystyrol Nilrot 1.7 - 2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% Mausserum	DAKO	X0910
C57BL/6 Maus	SLC, Inc.
ICR-Maus	SLC, Inc.
Modifizierte Mikroliter-Spritzen (Serie 7000)	Hamilton Company
35-Gauge-Nadel	Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator	Phillips Healthcare	1017920
O.C.T.Compound	Sakura Finetek	4583
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Nonidet(R) P-40	Nacalai	25223-04
Citratpuffer (pH 6) x 10	Sigma-Aldrich	C9999-100ml
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887
EDTA	dojindo	N001
Formamid	TCI	F0045
Dextransulfat Natriumsalz	Sigma-Aldrich	42867-5G
Denhardt's Lösung (50x)	ThermoFishcer sceintific	750018
Hefe tRNA (10 mg/ml)	ThermoFishcer sceintific	AM7119
SSC 20x	Sigma-Aldrich	S6639
DAPI	ThermoFishcer sceintific	D1306
n-Hexan	Sigma-Aldrich	296090
superfrost plus Glas	ThermoFishcer sceintific	12-55-18
Cytokeep II	Nippon Shoji Co.
FITC-konjugiertes Griffonia simplicifolia Isolektin B4	Vector Laboratories, Inc.	L1104
Anti-Maus CD31 (PECAM-1) PE	ebioscience	12-0311
ProLong  Gold	ThermoFishcer sceintific	P36934
BIOREVO	KEYENCE	BZ-9000E