Wir haben eine Methode zur Nervenverletzung entwickelt, um die Muskelreinnervation und damit die Regeneration neuromuskulärer Verbindungen bei Mäusen zuverlässig zu untersuchen. Bei dieser Technik wird der Nervus fibularis communis durch eine einfache und hochgradig reproduzierbare Operation verletzt. Die Muskelreinnervation wird dann durch Ganzmontage des Musculus extensor digitorum longus beurteilt.
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Methodenartikel
Die Fibula Nervenverletzung Methode: Ein zuverlässiger Test zur Identifizierung und Test Faktoren, die Reparatur neuromuskulären Synapsen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die neuromuskulären Synapse (NMJ) erfährt schädliche strukturelle und funktionelle Veränderungen als Folge des Alterns, Verletzungen und Krankheiten. Daher ist es zwingend notwendig, um die zellulären und molekularen Veränderungen bei der Aufrechterhaltung und der Reparatur NMJs beteiligt zu verstehen. Zu diesem Zweck haben wir eine Methode entwickelt, um zuverlässig und konsistent untersuchen NMJs in Mäusen zu regenerieren. Diese Nervenverletzung Verfahren umfasst das Zerkleinern des N. fibularis communis, wie es der lateralen Kopf des M. gastrocnemius Sehne in der Nähe des Knies verläuft. vorherige postsynaptischen Ziele innerhalb von 7 Tagen nach reinnervate Post-crush unter Verwendung von 70 Tage alten weiblichen Mäusen zeigen wir, dass Motoraxonen beginnen. Sie reoccupy vollständig ihre vorherigen synaptischen Bereiche von 12 Tagen. Um die Zuverlässigkeit dieser Verletzung Methode bestimmen, verglichen wir reinnervation Raten zwischen den einzelnen 70 Tage alten weiblichen Mäusen. Wir fanden, dass die Anzahl der postsynaptischen reinnervated Stellen zwischen Mäusen ähnlich war bei 7, 9 und 12 Tage nach-crush. Um festzustellen, obDiese Verletzungs Assay kann auch zum Vergleich molekularen Veränderungen in Muskeln verwendet werden, untersuchten wir Ebenen der gamma-Untereinheit des nikotinischen Rezeptors Muskel (gamma-AChR) und der muskelspezifische Kinase (MuSK). Die Gamma-AChR-Untereinheit und MuSK zu folgen Denervierung hoch oben reguliert und zurück auf ein normales Niveau folgende reinnervation von NMJs. Wir fanden eine enge Beziehung zwischen Transkriptniveaus für diese Gene und Innervation Zustand der Muskeln. Wir glauben, dass diese Methode das Verständnis der zellulären und molekularen Veränderungen bei der Reparatur der NMJ und anderen Synapsen beteiligt beschleunigen wird.
Einleitung
Bei jungen erwachsenen und gesunden Tieren ist die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) eine sehr stabile Verbindung zwischen der Präsynapse, der Nervenendigung eines α-motorischen Axons, und der Postsynapse, der spezialisierten Region einer extrafusalen Muskelfaser, in der nikotinische Acetylcholinrezeptoren (AChRs) selektiv aggregieren1. Die nahezu perfekte Apposition der prä- und postsynaptischen Apparate ist notwendig für die korrekte Neurotransmission, das Überleben der α-motorischen Neuronen und Muskelfasern sowie die motorische Funktion. Leider wird die Funktion des NMJ durch das Altern, Krankheiten wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Autoimmunerkrank....
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Protokoll
Alle Experimente wurden unter NIH-Richtlinien und Tier Protokolle, die von der Virginia Tech Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt.
1. Vorbereiten Tiere für Chirurgie
- Anästhesieren Mäuse mit einem Gemisch aus Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) über eine subkutane Injektion inguinal mit einer sterilen 1 ml Insulinspritze. Trägerlösung enthält eine Mischung aus 0,9% Kochsalzlösung, 17,4 mg / ml Ketamin und 2,6 mg / ml Xylazin. Legen Sie Tiere zurück in Käfigen, während für Medikamente warten zu übernehmen.
HINWEIS: Wenn die Ladungsdosis nicht ausreichend Anästhesie für die Dauer des ....
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Ergebnisse
Der N. fibularis communis, auch genannt der N. peronaeus, ergibt sich aus dem Ischiasnerv oberhalb der Kniekehle, wo es um den Kopf der Fibula zur Vorderseite des Beins (1A) schwingt. Dort zweigt in die oberflächlichen und tiefen fibular Nerven, zusammen, um die Dorsalflexoren des Fußes und der Zehen Versorgung (Tibialis anterior, extensor digitorum longus und brevis und extensor Zehen longus) und die everters des Fußes (Peronaeus Muskeln). Dieser Nerv trägt auch sensori.......
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Diskussion
Das Verfahren in diesem Manuskript präsentiert bietet einzigartige Möglichkeiten Mechanismen bei der Reparatur von neuromuskulären Verbindungen (NMJ) beteiligt zu identifizieren. Dieses Verfahren beinhaltet das Brechen des N. fibularis communis, wie es gastrocnemius Sehne in der Nähe des Knies verläuft. Wir zeigen, dass nach nur 5 Sekunden von Nervenkompression mit einer Zange, vollständige Degeneration um 4 Tage nach der Verletzung festgestellt wird. Bei jungen erwachsenen Mäusen, beginnen alpha-Motoraxonen vorherigen .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken den Mitgliedern des Valdez-Labors für ihren intellektuellen Input zu Experimenten und Kommentaren zum Manuskript.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ketamin | VetOne | 501072 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | 003437 | |
| Buprenorphin | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes | Kimtech | 34155 | |
| Elektrorasierer | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% Proviod | |||
| 1 ml Insulinspritze | |||
| Federschere | Vannas | 91500-09 | |
| Nr. 15 Skalpell | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 Pinzette | Dumont | 11252-00 | |
| 6-0 Seidennaht auf umgekehrter Schnittnadel | nbsp; Naht Express | 752B | |
| Nagetier-Heizkissen | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 konjugierte alpha-BTX | Molekularsonden | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus Stereo Zoom Mikroskop | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 Konfokalmikroskop | Zeiss | ||
| Perfusionspumpe mit variablem Durchfluss | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet Salbe | Puralube | 1621 | |
| Synaptotagmin-2 | Antikörper-Antikörper-Online | ABIN401605 | |
| Neurofilament | Antikörper-Antikörper-Online | ABIN2475842 |
Referenzen
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
