Introduction
骨髓是参与造血和免疫调节的重要器官。它由含有造血干细胞和祖细胞（骨髓干细胞）造血成分和包含于间充质细胞1产生非造血祖细胞的基质组分。造血活动的三分之二是专门为骨髓细胞2的产生。特别是，在骨髓中产生了大量的中性粒细胞，以在正常的成人每天2生成1-2×10 11个细胞。中性粒细胞是抗微生物感染的防御的第一线，在骨髓大多保留，直到触发器压力的动员，以补充外周血中性1,3。除了它们的抗微生物作用，最近的研究表明在癌症生物学中性粒细胞的重要作用，同时具有亲和抗肿瘤发生的表型取决于转化生长因子β（TGF-β）在肿瘤微环境4,5-信令。此外，研究表明，在原发肿瘤积聚的中性粒细胞产生通过抑制T细胞6,7-的细胞毒性作用的亲致瘤性和转移性的效果，而在循环嗜中性粒细胞产生细胞毒性，抗转移效应8。因此，造血细胞在骨髓中，特别是嗜中性粒细胞，调查是在免疫和肿瘤调节阐明它们的作用是至关重要的。
组织病理学和完整的外周血计数通常用于在骨髓9来评估细胞和结构改变。然而，这些方法仅提供了不同的细胞群或组织中微观结构的静态信息。纵向的体内成像可在结合使用的标准方法来评估多个蜂窝，血管和基质组分的动力学以及细胞到CELL相互作用以纵向方式。活体显微镜（IVM），定义为在显微镜的分辨率10活体动物成像，是对于相同的试样中随时间评估动态的细胞过程，减少了所需的实验动物的数量是特别有用的。 IVM通常与慢性移植窗口室（WC）数周的持续时间，以访问感兴趣的器官成像到几个月组合。颅骨和背皮褶WC车型有使用可以追溯到20世纪90年代中期的历史最长。最近，其他器官特异性厕所模型，例如那些乳腺脂肪垫和各种腹部器官已经开发11。
用于体内成像骨髓典型的方法有小鼠的颅盖，其中所述变薄的骨能以最少的手术干预12-14单个细胞的直接可视化的主要涉及曝光。然而，颅骨骨髓可以bE从其他骨骼，如长骨的不同，这表现在在颅盖的下数骨髓干细胞和缺氧细胞的，这表示降低骨髓干细胞15的维护和发展。因此，评估在长骨细胞成分的替代方法进行了研究。这些措施包括股骨骨髓16的直接暴露和在背皮褶WC 17分股骨移植异位。然而，前者是不允许蜂窝，结构和功能的改变的跟踪在更长的时间段的终端程序，后者可能是由于股骨移植向背侧皮褶厕所内异位位点扰乱正常骨髓的功能。使股骨骨髓原位串行成像随时间的另一种方法是在股骨骨使用WC的。一前一报告显示微循环的长期成像在股骨骨髓使用在小鼠18股骨WC。此外，作者证明肿瘤细胞在股骨的可视化，这表明它在监测骨髓转移工具。然而，这种厕所设计是由它的大尺寸（1.2厘米直径的）和相对小的成像区域（4毫米直径的），这是仅适用于大鼠（26-34克，3-6个月的年龄）的限制，从而使方法不切实际常规使用。
因此，一个新的WC具有较小的整体尺寸，以及较大的内部成像区域被设计为这项研究的目的。本研究的目标是提供用于在股骨骨髓成像各种细胞类型的方法。股骨WC模型内部开发的，并用于在3D血管网内可视化和跟踪中性粒细胞。利用该模型，骨髓IVM可以连续40天进行。这种方法可以适用于各种领域的阐明造血的方法中，免疫调节第二肿瘤的发展。
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Protocol
注：所有动物的工作是在协议＃2615由大学健康网络机构动物护理和使用委员会批准进行。
1.手术鼠的制备
- 在手术前，消毒所有手术器械和窗口室（WC）通过高压灭菌。用50毫克/公斤体手术前2天重量阿莫西林补充饮用水。注入小鼠与手术前腹膜内4小时0.1毫克/千克体重丁丙诺啡。
- 麻醉由350-400微升生理盐水腹腔注射无胸腺裸鼠含80毫克/千克氯胺酮和13毫克/公斤甲苯噻嗪（注：这是由机构动物护理委员会批准，我们还没有与不利影响的任何经验）。通过测试足部反射确认适当的麻醉。继续观察的过程中呼吸模式，粘膜颜色和足部反射。
- 执行手术PR生物安全柜下ocedures保持手术过程中无菌条件。将鼠标上覆盖有外科被单的手术过程中，保持体温的电加热垫。在立体显微镜下进行所有的外科手术。
- 应用眼膏在手术过程中，保持眼睛湿润。必要时重复进行的外科手术过程中。通过用7.5％聚维酮 - 碘，70％异丙醇和10％的聚维酮碘擦拭连续消毒鼠标的操作区，并重复此过程两次。
- 使用手术刀用刀片（＃15）10毫米纵向切开皮肤，从侧面接近股骨。使用镊子和止血，以保证肌肉功能钝性分离暴露屈肌和伸肌的股骨。
- 插入骨下的U形杆，并安装WC（ 图1）。安全使用两个螺母窗口栏，并拧紧与螺母牛肝菌。填充骨和牙科用粘固了WC之间的空间。
- 磨得在一个6×2 mm 2的区域中的骨皮质用微钻头获得对骨髓腔的光接入。
注意：仔细检查骨皮质变薄，在显微镜下，而执行此过程。离开骨完整，几乎透明的骨膜层。 - 将8mm的玻璃罩到窗口，并用卡环固定玻璃罩，以保持它在的地方。
- 通过使用镊子，以保持其功能的手术后，重新调整屈伸回原来的位置的肌肉。缝合使用5-0缝合和针保持器真皮。
- 监测小鼠进行恢复，直到它是有意识的，并能自由移动。把动物进入一个新的笼子里回过神来的时候。
- 恢复后，执行上的当天或随后几天的动物图像采集（见第2节）。监控physi鼠标校准状态每天。
注：监控物理条件，如负重肢体，拱起，快速或呼吸浅，后肢肿胀，自残，蜂窝组织炎，重度皮炎。 - 得到的0.1毫克/千克体重丁丙诺啡腹腔注射3天，和1毫克/公斤体美洛昔康的5天的手术治疗手术后疼痛和炎症以下重量。继续5天提供阿莫西林补充水。
- 在实验终点，用CO安乐死动物2麻醉，随后由次级方法（ 例如 ，颈脱位）。
2.图像采集使用组合多光子和共聚焦显微镜
- 成像之前，由含有80毫克/千克氯胺酮和13毫克/千克甲苯噻嗪一个350-400微升盐溶液的腹膜内注射麻醉小鼠。另外，尽可能使用吸入麻醉剂。应用眼膏。
- 注入用于标记脉管的血管内染料（0.65毫克2-丙二醛荧光素（FITC） - 葡聚糖）和嗜中性粒细胞（4微克Allophycocyanine（APC的） - 抗 - Ly6G抗体）的混合物。
- 使用一个直立组合后的多光子和共聚焦显微镜配备多光子激光从705-980纳米为双光子激发，以及单光子激光器提供激发波长从蓝色至红色。
- 设置一个定制的成像舞台上镜（ 图1B）。由WC的两头鳄鱼夹夹紧固定在舞台上的鼠标。
注意：舞台的关键组件是：二鳄鱼夹持有了WC，和一个加热元件，以在成像期间保持鼠标生理温度（37℃）。 - 打开双光子激光和共聚焦系统，并通过点击“开始系统”启动图像采集的软件。有4个选项卡的窗口（定位，采集，处理和维护）将打开。
- 建立了成像通道。点击“智能设置”取样选项卡下，选择将用于成像染料：FITC（488 nm激发，493-588 nm发射）和APC（633纳米激发和638-743 nm发射）。选择“最佳的信号”，然后点击“应用”。
- 手动添加二次谐波（SHG）图像采集渠道。打开双光子激光下的采集选项卡中的“激光”窗口。根据通道窗口中，点击“+”号添加曲目。
- 建立了SHG轨道。使用向上和向下箭头的波长变化至840纳米的下通道窗口，选择检测范围是根据使用滑块栏中的“光路”窗口415-425纳米。
- 点击“在线目镜”的定位选项卡下。点击过滤器设置下为FITC FITC查看感兴趣的区域，并转动T手动调整焦距他调焦旋钮显微镜的一面。当感兴趣的区域的位置，单击该选项卡中找到的“目镜离线”。
- 点击采集标签。选择在通道窗口FITC轨道，然后点击“实时”预览FITC葡聚糖具有5X客观的形象。如有必要，调整焦距，然后单击“停止”收购选项卡下停止预览。
- 通过移动镜头上方的轮手动打开20倍水的目标。再次查看图像使用20X客观FITC葡聚糖和渠道窗下调整主增益和针孔，以达到最佳的信号和对比度。重复的通道窗口下选择APC和SHG轨道等渠道。
- 选择的摄像参数。点击“采集模式”，以打开其窗口。设置帧大小为1,024×1,024像素，和4X的平均化，以获得高质量的图像。
- 获取二维快照。选择所有通道下通道取胜道指和点击“捕捉”收购选项卡下。检查图像的质量，并在必要时更改成像参数。
- 获取2D时间推移图像。
- 检查关“时间序列”中的采集标签打开时间序列窗口。输入0的时间间隔下，和40扫描的总数采取连续40张无时间间隔。
注：40扫描产生大约5分钟长的时间序列与7.5秒/帧的扫描速度和600微米×600微米的图像尺寸。调整间隔，并根据在显微镜，图像采集设置，摄像机的帧速率的扫描次数。固定时间间隔（> 0秒）可用于比较在不同时间点获取的时间推移的图像。较长的时间推移成像持续时间可以根据在实验条件下的中性粒细胞（或其它感兴趣的细胞）的预期平均速度是必需的。
- 检查关“时间序列”中的采集标签打开时间序列窗口。输入0的时间间隔下，和40扫描的总数采取连续40张无时间间隔。
- 获得3D图像。
- 检查关“的Z-Stack”，在采集选项卡打开Z-Stack窗口。启动FITC葡聚糖“实时”预览模式。专注于样品的顶部，然后单击“设置第一”，并专注于样品的另一端，并单击Z堆栈窗口“设置最后”。
- 设置间隔为Z-Stack窗口在10微米。取决于第一和最后一个光学片在上一步中选择，这将产生10至20片，与90-180微米的总光学厚度。
注意：Z堆叠间隔是依赖于针孔，它决定了光切片的厚度的大小。将间隔设置为小于光学切片的厚度。 - 点击采集选项卡下的“开始实验”开始采集图像。
- 获得3D时间推移图像。
- 检查关“时间序列”和“Z堆栈”中的采集标签打开时间序列和Z堆叠的窗户。
- 在步骤2.14和2.15方法设定时间序列和Z堆栈采集参数。点击采集选项卡下的“开始实验”开始采集图像。
- 在成像过程中监视鼠标，以确保它是稳定的和无意识的。如果鼠标成像期间不稳定和/或意识，从台上移除小鼠，腹膜内注入额外100-150微升麻醉剂溶液中，并继续成像。
注意：不稳定的迹象包括呼吸急促和鼠标，它可以被看作是在获取的图像移位的工件运动。 - 图像采集后，将鼠标离开舞台，并使其返回到笼子里。使用加热灯来保持温暖，并监测小鼠，直到它是有意识的。
3.图像分析和量化
- 使用图像分析软件来分析三维和时间序列数据。打开软件和将其拖动到打开的画面，这就是所谓的“竞技场”视图中添加图像。在图像文件打开双击它;图像将在“超越”视图中打开。
- 创建一个2D / 3D图像。
- 从右上角找到“其他”栏，点击“编辑/显示显示调整”，打开“显示调整”窗口。通过调整阈值，为每个通道优化荧光显示屏，并采取快照保存图像。
- 生成使用时间推移图像对象轨道。
- 打开图像下的“超越”的观点进行分析。点击橙色小点的图像，发现下面的“超越”图标上。这将打开一个新的“点”窗口。
- 勾选“追踪斑点（随时间变化）”，并点击蓝色箭头进入下一个步骤。选择包含对象的频道的“源通道”进行跟踪，并设置估计对象diamet根据“估计XY直径”通过键入一些呃，点击蓝色箭头进入下一步。
注意：对于中性粒细胞的跟踪，选择包含APC荧光中性粒细胞的通道，并设置基于中性粒细胞已知大小的物体直径12微米。 - 在窗口中，找到并点击向下箭头，选择“质量”过滤器。观察由软件定义的斑点和手动调整阈值包含或排除斑点。一旦阈值定义，点击蓝色箭头转到“跟踪”的步骤。
- 在算法中，找到并点击向下箭头，选择“自回归运动算法”。键入10微米的“最大距离”和3“最大间隙大小”下的参数找到。勾选“装满所有检测到的对象的空白”，开始跟踪，然后点击蓝色箭头进入下一步。
注：“自回归运动算法”用于˚F或已经指示运动，因为它基于从先前的运动预测位置的轨道的对象。 “最大距离”和“最大间隙尺寸”可以根据预期的尺寸和物体的速度被追踪，以及隔时图像的总持续时间来调整。 - 在过滤器类型，请选择“跟踪时间”过滤器。点击绿色箭头来完成跟踪，检查生成的轨道。返回到前面的步骤，如果必要的磁道手动排序。
- 如果生成隔时图像漂移校正平移漂移。
- 点击图标用铅笔的图像。这是打开“编辑曲目”窗口中编辑标签。检查隔时图像，并找到一个参考点不应该移动的所有图像。
- 在屏幕的左上角，找到“指针”窗口，勾选“选择”激活立方米rsor用于选择一个点。点击参考点。
- 在“编辑曲目”窗口中点击“正确漂”。检查关“转化漂”。该软件将自动生成校正图像系列。
- 通过测量物体在轨道时间推移图像定义细胞运动。
- 在“编辑曲目”窗口，勾选“曲目”，并选择代表一个细胞的运动轨迹。所选曲目将在黄色中的时间序列图像中突出显示。
- 点击图标与图的图像打开“统计”窗口（统计标签）。
- 在“选择”，通过点击向下箭头，产生轨道速度意味着所选的曲目选择“跟踪速度平均值”。选择不同的轨道，并重复步骤测量的轨道速度意味着所有感兴趣的细胞。
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Representative Results
鼠股骨骨髓是使用了WC启用个人中性粒细胞和血管网络的可视化成功访问。 图1示出了WC工具和描述了外科手术，其涉及股骨骨和骨皮质变薄的曝光以获得内部的光接入骨。该手术是很好的耐受性小鼠;他们进行了评估不良生理反应，如后肢浮肿，非负重肢体，自残，蜂窝组织炎和皮炎，以及损害了WC 5天手术后，无痛苦的报告。值得注意的是，窗口仍然IVM光学透明多达40天，这可以使在介入细胞和结构变化的长期评估。
骨髓内脉管可由血管内染料，如FITC-葡聚糖被可视化（ 图2）。由于对比度依赖于染料的注入，所获取的图像表示官能脉管在有足够的血流。除了 脉管，嗜中性粒细胞可以在体内使用抗Ly6G抗体染色。 图3A和3B表示在不同时间点，其中的中性粒细胞都在血管内和血管外空间看到观察到的骨髓的同一区域。由血管标这些方面进行了表征。罗丹明6G可用作替代抗Ly6G染色体内嗜中性粒细胞;然而，它扩散出在以非特异性方式血管外空间的脉管和污渍的单核细胞的。因此，抗Ly6G是优选的，因为它使嗜中性粒细胞的特定成像。 图3C表示皮质骨，它主要由胶原纤维的成像。最大深度成像实现在该实验中是180微米（ 图3C）。
时间推移荧光成像利于跟踪和细胞运动的量化体内 。 图4A示出嗜中性粒细胞的跟踪在骨髓血管利基。成像每次扫描之间没有额外的时间间隔允许细胞进行精确跟踪;然而，一些用户输入被要求进一步改善由软件生成轨道的精度。斑点跟踪（ 即，所关注的细胞）使各种参数，如平均轨道速度（ 图4B）的定量。可以测量包括但不限于其他参数，跟踪光点的大小，形状和强度的长度，变更。该测定提供了改善细胞的运动和相互作用的表征各种参数的量化。
图1：股骨窗口室（WC），成像级和手术过程 （A）的定做钛股骨WC与用于固定到位股骨的U形棒。该WC持有直径8毫米玻璃盖，通过卡环固定。 （B）定做成像阶段。加热元件被放置在成像期间保持鼠标的生理温度的阶段的底部。两个鳄鱼夹用于存放厕所。 （C - 高 ）手术安装股骨WC程序。 （C）的股骨的屈肌和伸肌之间露出。肌肉在手术过程中不会被删除。 （D）的U形杆放置在股骨下，和（E）的WC安装并使用两个螺母固定。 （F）的牙科水泥在骨和之间施加WC，以填补空间。 （G）的真皮缝合和（H）玻璃盖固定在固定环的地方。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 体内 骨髓血管网的三维荧光成像在骨髓血管的代表性图像，通过股骨WC成像。 脉管（绿色）由2丙二醛FITC-葡聚糖的尾静脉注射可视化。比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：追踪 在体内 骨髓的血管网内嗜中性粒细胞运动的血管网内嗜中性粒细胞（A）的轨道路径。曲目所使用的软件内置的自回归运动算法自动生成。每个白点表示一个粒子的中心点被跟踪（中性粒细胞）。比例尺= 50微米。 （B）平均血管内和血管外的中性粒细胞测定轨道的速度，这表明在中性粒细胞的运动差（误差条=平均值+ SD，* p = 0.0176，双尾t检验）。 请点击此处查看大图这个数字。
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Discussion
实时的，在骨髓动态细胞过程的串行成像提供以其它方式挑战，得到使用常规技术，如组织学和总血细胞计数信息。这里所描述的股骨厕所模型提供随时间调查在骨髓细胞和结构改变了独特的机会。虽然股骨WC模型先前已经报道，我们的新颖设计提供的视图和较小的整体WC尺寸较大的摄像视场，这是在成年小鼠使用更兼容。股骨厕所模型可在各种小鼠品系，包括免疫活性和/或转基因报告小鼠的使用。
有确定的总持续时间和成像质量的手术过程中的关键步骤。当暴露股骨，只进行屈伸肌肉之间的钝性分离;除去这些肌肉的可能导致降低的鼠标和亩流动性T为避免。此外，皮质骨研磨必须小心地进行。研磨大约50微米是足够的光学成像，同时保持股骨血管网的结构完整性。周围的骨牙科水泥中的应用是用于密封外科手术暴露面积，防止流体积聚，并保持清晰的光学成像窗口超过一个月，同时减少感染的风险至关重要。牙科水泥还起到固定厕所的地方，防止WC各地的股骨旋转。最后，用于保持玻璃罩扣环是适合与水-浸没透镜的使用，提供水密封。卡环建议过粘合剂的玻璃罩附加到厕所，因为除了粘合剂可在轻微的相对于成像平面的角度增加的骨和玻璃罩之间的间隙，或放置玻璃罩，从而降低了可实现的穿透深度为成像。此外当玻璃罩需要被清洁或更换卡环是有益的。
除了手术，有几个关键步骤，以实现骨髓成功光学成像。到股骨的WC内部的图像，将WC水平放置于成像阶段为物镜的适当浸泡。所述定制成像级是适合于该目的，因为它允许相对于该透镜的WC的角度的调整。此外，厕所，U形杆的特别尺寸，设计保持在尽可能靠近玻璃罩尽可能水平位置，以达到最佳的穿透深度的骨。在成像期间，呼吸伪影可被观察到的荧光图像的水平线。除了固定的WC到成像阶段，成像级下的加热元件的温度可以被调整以充分暖动物以减少过多的呼吸。纱布的薄层可以放置在鼠标和加热阶段，以进一步帮助减少在成像期间呼吸工件之间。取决于生物成像目标，采集参数诸如帧速率，成像体积和成像持续时间也可被调节以收集足够的图像处理的实验问题。例如，嗜中性粒细胞的迁移和爬行速度可以各种实验条件下不同，从2.8微米/分钟为基础条件下驻留嗜中性粒细胞的任何地方从5-10微米/分钟为嗜中性粒细胞炎性病症19-21下。因此，对于在体内嗜中性粒细胞的跟踪相应的成像速度和持续时间也将有所不同根据实验条件。另外，如从结果可见，在脉管内的细胞的跟踪将需要具有高帧速率的快速成像照相机（30帧/秒）。然而，如果目标细胞是驻留在血管外空间中，或如果细胞 - 细胞interactio感兴趣n被预期会发生更缓慢，图像质量应该优先于成像速度。
对细胞功能的体内细胞染色注射抗体的影响，也必须考虑。在我们的研究中，我们使用抗Ly6G抗体（1A8克隆），它通常用于在高剂量（150〜250微克），以流通消耗中性粒细胞和研究它们在不同疾病模型的作用。 Yipp和Kubes证明荧光染料标记的抗Ly6G抗体不以低血管内注射剂量（1-40微克）22破坏白细胞募集。然而，最近的研究表明，荧光染料，具有分子量和化学结构的巨大差异，能不同地影响抗Ly6G 23的功能。这项研究表明，FITC标记的抗Ly6G，但不PE-和APC标记的抗体，在低浓度（30微克）有效消耗体内中性粒细胞。在我们的研究中，我们没有使用APC标记的抗Ly6G的4微克观察中性粒细胞耗竭加班。然而， 在体内的荧光标记的抗Ly6G抗体的功能的进一步表征需要验证其在活体成像的使用。这也适用于具有改变的细胞相互作用功能能力的其他抗体。作为替代体内细胞染色的抗体，转基因报告小鼠24和/或标记的荧光细胞25可用于可视化的中性粒细胞或体内其它感兴趣的细胞群。
在本协议中所描述的股骨WC模型使成像手术后40天。一些使用这种厕所模型长期成像的挑战包括延迟骨愈合过程和清洁的玻璃窗口的维护。值得注意的是，我们没有观察到以下的WC明显的植入骨愈合的迹象，这将大型的源码骨膜电子增厚;这并不意外因为骨愈合过程1个半-3个月26,27后通常会发生。清洁和光学透明窗口的保养可以由牙科水泥的应用，以及使用卡环和玻璃罩的其提供牢固水封与组织来实现。玻璃罩可以用棉花提示偶尔清洗从外部的灰尘和碎屑。了WC具有宽摄像视场，几乎覆盖了骨干区域（约8.4-8.6毫米28），这使得它优于先前公布的模型18的整个长度。但是，访问到远端区域和较深骨髓腔是有限的。特别是，富小梁干骺端，位于骨干的远端，被称为是富含HPSCs 29。这些区域可以在组织学访问，或者由IVM作为终端过程。可替代地，不同的成像模态，例如微排版布式层析可用于图像骨髓的远侧区体内 30。这些方法是互补的，以体外成熟，对于骨髓内评估解剖及各种蜂窝和结构改变和相互作用提供的综合方法。
这里所描述的协议提供了用于在蜂窝分辨率股骨骨髓小鼠长期时空评估的新方法。提出的方法能够在体内的串行成像跟踪单个细胞或以上生物相关的时间尺度细胞群的动作，而同时获得的骨髓的结构和功能的信息。此外，可以进行定量图像分析进一步表征细胞和功能的改变，如细胞运动的跟踪。在小鼠的各种菌株，特别是在转基因小鼠记者31这个股骨WC模式的应用，还可以使多个单独标记的细胞群，如那些参与造血调查。因此，所描述的协议是广泛地适用于广泛累及活小鼠骨髓内的各种生物过程，包括在造血，白血病，HPSC移植，免疫调节，骨髓微环境（ 如，低氧小生）调查临床前研究和免疫细胞的贡献肿瘤进展和转移。
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Disclosures
作者有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢在大学健康网络高级光学显微镜基金（www.aomf.ca），与显微镜的帮助，并从玛嘉烈医院癌症中心的机械车间贾森·埃利斯先生制造WC和成像阶段。我们还要感谢光圈Kulbatski博士稿件编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
