Introduction
Knoglemarv er et vigtigt organ involveret i hæmatopoiese og immunregulering. Den består af en hæmatopoietisk komponent indeholdende hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller (HSPCs), og en stromal komponent, der indeholder ikke-hæmatopoietiske celler, der giver anledning til mesenchymalceller 1. To tredjedele af hæmatopoietisk aktivitet er dedikeret til frembringelsen af myeloide celler 2. Især er et stort antal neutrofiler fremstillet i knoglemarven, med 1-2 x 10 11 celler frembragt per dag i en normal voksen human 2. Neutrofiler er den første linje i forsvaret mod mikrobielle infektioner og er for det meste forbeholdt i knoglemarven, indtil stress udløser deres mobilisering til at supplere perifere neutrofiler 1,3. Ud over deres antimikrobielle virkninger, de seneste undersøgelser tyder på en vigtig rolle af neutrofiler i cancer biologi, som har begge pro- og anti-tumorigene fænotyper afhængigt transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) signalering i tumormikromiljøet 4,5. Desuden studier viste, at neutrofiler, der ophobes i primære tumorer udøver pro-tumorigene og metastatiske virkninger ved at undertrykke cytotoksiske funktion af T-celler 6,7, mens neutrofiler i omløb udøve en cytotoksisk, anti-metastatisk virkning 8. Som sådan undersøgelse af hæmatopoietiske celler i knoglemarven, især neutrofiler, er afgørende for at belyse deres rolle i immune og tumor regulering.
Histopatologi og en komplet tælling perifert blod rutinemæssigt anvendes til at evaluere cellulære og strukturelle ændringer i knoglemarven 9. Disse fremgangsmåder kun levere statisk information af forskellige cellepopulationer eller væv mikrostrukturer. Langsgående in vivo-billeddannelse kan anvendes i kombination med standard metoder til vurdering dynamikken i multiple cellulære, vaskulære og stromale komponenter samt celle-til-cell interaktioner i en langsgående måde. Intravital mikroskopi (IVM), defineret som billeddannelse af levende dyr ved mikroskopisk opløsning 10, er særlig anvendelig til vurdering af dynamiske cellulære processer over tid i den samme prøve, reducerer antallet af forsøgsdyr påkrævet. IVM er ofte kombineret med en kronisk transplanteret vindue kammer (WC) for at få adgang organet af interesse for billeddannelse over en varighed på uger til måneder. Kraniel og dorsal-skinfold WC modeller har den længste historie anvendelse går tilbage til midten af 1990'erne. Senere er andre organspecifikke WC modeller såsom dem af den brystfedtpuden og forskellige abdominale organer der udviklet 11.
Den typiske fremgangsmåde til billeddannelse af knoglemarv in vivo har hovedsageligt involveret eksponering af calvaria af mus, hvor den indsnævrede ben muliggør direkte visualisering af enkeltceller med minimal kirurgisk indgreb 12-14. Imidlertid kan calvariale knoglemarv be forskellig fra andre knogler, såsom lang knogle, som det fremgår af et lavere antal HSPCs og hypoxiske celler i calvaria, hvilket indikerer mindre vedligeholdelse og udvikling af HSPCs 15. Derfor har alternative metoder til at vurdere cellulære komponenter i den lange knogle blevet undersøgt. Disse omfatter direkte eksponering af den femorale knoglemarv 16 og ektopisk transplantation af split lårben i dorsale skinfold WC 17. Men førstnævnte er en terminal procedure, der ikke tillader sporing af cellulære, strukturelle og funktionelle ændringer over længere tidsperioder, og sidstnævnte sandsynligvis forstyrrer normal knoglemarvsfunktion grund af transplantation af lårben til en ektopisk sted inde i dorsale skinfold WC. En anden metode, som tillader orthotopisk seriel billeddannelse af femoral knoglemarv over tid er anvendelsen af et toilet i den femorale knogle. En tidligere rapport demonstrerede langsigtet billeddannelse af mikrocirkulationen i den femorale knoglemarv under anvendelse af etlårben toilet i mus 18. Derudover forfatterne demonstrerede visualisering af tumorceller i lårbenet, hvilket indikerer dens anvendelighed i overvågningen knoglemarv metastaser. Imidlertid var dette toilet motiv begrænset af dens store størrelse (1,2 cm diameter) og relativt lille billedområde (4 mm diameter), som var kun egnet til store mus (26-34 g, 3-6 måneder gamle) hvorved nærme upraktisk til rutinemæssig brug.
Derfor blev en ny toilet med en mindre samlet størrelse og større indre billedområde udformet til formålet med denne undersøgelse. Målet med denne undersøgelse var at tilvejebringe en fremgangsmåde til afbildning af forskellige celletyper i den femorale knoglemarven. Den lårbenet WC model blev udviklet internt og blev brugt til at visualisere og spore neutrofiler i 3D-vaskulære netværk. Under anvendelse af denne model, kan IVM af knoglemarven udføres serielt over 40 dage. Denne fremgangsmåde kan anvendes på en række områder til at belyse de processer af hæmatopoiese, immunregulering ennd tumor udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyr arbejde blev udført under protokol # 2615 godkendt af University Health Network Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Kirurgisk Fremstilling af mus
- Før operation, sterilisere alle kirurgiske instrumenter og vinduet kammer (WC) ved autoklavering. Supplement drikkevandet med 50 mg / kg legemsvægt af amoxicillin 2 dage før operationen. Injicere mus med 0,1 mg / kg legemsvægt af buprenorphin intraperitonealt 4 timer før operation.
- Bedøve atymiske, nøgne mus ved intraperitoneal injektion af 350-400 pi saltopløsning indeholdende 80 mg / kg ketamin og 13 mg / kg xylazin (Bemærk: Dette blev godkendt af Institutional Animal Care udvalg, og vi har ikke haft nogen erfaring med bivirkninger ). Bekræft korrekt anæstesi ved at teste for mund refleks. Fortsæt observere for respiratorisk mønster, slimhinder farve og fod refleks under proceduren.
- Udfør den kirurgiske procedures under et biosikkerhed skab for at opretholde sterile forhold under operationen. Placer musen på en elektrisk varmepude dækket med et kirurgisk afdækningsstykke til at opretholde kroppens temperatur under operationen. Udfør alle kirurgiske procedurer under stereomikroskop.
- Påfør øjensalve til at holde øjnene fugtige under operationen. Gentag om nødvendigt under den kirurgiske procedure. Steriliser driftsområde af musen ved at tørre med 7,5% povidon-iod, 70% isopropylalkohol og 10% povidon-jod fortløbende, og gentage denne procedure to gange.
- Foretag en 10 mm langsgående incision i huden ved hjælp af skalpel med et blad (# 15), der nærmer femur fra den laterale side. Eksponere lårbenet mellem flexor og extensor musklerne ved stump dissektion med pincet og hemostats at sikre muskel funktionalitet.
- Indsæt den U-formede bar under knoglen, og installere WC (figur 1). Fastgør bar med vinduet ved hjælp af to møtrikker, og spænd møtrikkerne med forCEPS. Fylde rummet mellem knoglen og toilet med dental cement.
- Grind ned kortikal knogle i en 6 x 2 mm2 region med en mikro-bore for at få optisk adgang til marv hulrum.
Bemærk: Kontrollér omhyggeligt udtynding af cortical knogle under mikroskop, mens de udfører denne procedure. Lad en intakt, næsten gennemsigtige periosteal lag af knoglen. - Placer 8 mm dækglas på vinduet, og fastgør dækglasset med en låsering til at holde det på plads.
- Juster muskulaturen af flexors og extensors tilbage til deres oprindelige placeringer ved hjælp af en pincet til at opretholde deres funktion efter operationen. Sutur dermis ved hjælp 5-0 sutur og en nåleholder.
- Overvåg musen til nyttiggørelse, indtil det er ved bevidsthed og er i stand til at bevæge sig frit. Sæt dyret ind i en ny bur, når genvundet.
- Efter nyttiggørelse, udføre erhvervelse billede på dyret på samme dag eller følgende dag (se afsnit 2). Overvåg physical tilstand af musen dagligt.
Bemærk: Overvåg fysiske forhold, såsom vægtbærende på lemmer, hunching, hurtig eller overfladisk vejrtrækning, bagben hævelse, selv-lemlæstelse, cellulitis og alvorlig dermatitis. - Giv intraperitoneal injektion af 0,1 mg / kg legemsvægt af buprenorphin i 3 dage, og 1 mg / kg legemsvægt af meloxicam i 5 dage efter operationen til behandling af post-operative smerter og betændelse. Fortsat at yde den amoxicillin-suppleret vand i 5 dage.
- Ved den eksperimentelle endpoint, aflive dyret ved CO 2 narkose efterfulgt af en sekundær fremgangsmåde (fx cervikal dislokation).
2. Image Acquisition Brug Kombineret Multi-foton og konfokalmikroskopi
- Før billeddannelse, bedøver musen ved intraperitoneal injektion af en 350-400 pi saltopløsning indeholdende 80 mg / kg ketamin og 13 mg / kg xylazin. Alternativt kan du bruge inhalerbar bedøvelsesmiddel, når de foreligger.Anvend øjensalve.
- Injicer blanding af intravaskulære farvestoffer til mærkning kar (0,65 mg to MDa fluorescein (FITC) -dextran) og neutrofiler (4 ug Allophycocyanine (APC) -anti-Ly6G antistof).
- Brug en opretstående kombineret multi-foton og konfokal mikroskop udstyret med en multi-foton laser spænder fra 705 til 980 nm for to-foton excitation, samt enkelt foton lasere, der giver excitationsbølgelængder fra blå til rød.
- Sæt en skræddersyet imaging etape på mikroskop (figur 1B). Fastgør musen på scenen ved at klemme de to ender af toilet med krokodillenæb.
Bemærk: Kritiske komponenter i fase, er: to krokodillenæb at holde WC, og et varmeelement for at opretholde fysiologisk temperatur (37 ° C) af musen under billeddannelse. - Tænd for to-foton laser og konfokal systemet, og starte erhvervelse billedet software ved at klikke på "Start System". Et vindue med 4 faner (Find,Køb, forarbejdning, og Vedligehold) åbnes.
- Opsæt de billeddannende kanaler. Klik på "Smart Setup" under fanen Acquisition og vælge de farvestoffer, der skal bruges til billedbehandling: FITC (488 nm excitation, 493-588 nm emission) og APC (633 nm excitation og 638-743 nm emission). Vælg "Bedste Signal" og klik på "Anvend".
- Tilføj den anden harmoniske generation (SHG) billede erhvervelse kanal manuelt. Tænd for to-foton laser under "Laser" vindue i fanen Acquisition. Under vinduet Kanaler, klik på "+" tegnet for at tilføje et nummer.
- Opsæt SHG sporet. Skift bølgelængden til 840 nm under Kanaler vindue ved hjælp af op- og pil ned, og vælg detektionsområdet til at være 415-425 nm under "Light Path" vindue ved hjælp af skyderen.
- Klik på "okularer Online" under fanen Find. Klik FITC under indstillingen filter til FITC at se området af interesse og justere fokus manuelt ved at dreje than fokusere knop på siden af mikroskopet. Når området af interesse ligger, klik på "okularer offline" under fanen Find.
- Klik på fanen Acquisition. Vælg FITC spor under Kanaler og klik på "live" for at få vist billedet af FITC-dextran med 5X mål. Juster fokus, hvis det er nødvendigt, og klik på "Stop" under fanen Acquisition at stoppe preview.
- Manuelt drej til 20X vand målsætning ved at flytte et hjul over linserne. Se billedet igen for FITC-dextran hjælp 20X objektiv, og juster Master Gain og Pinhole under vinduet Kanaler for at opnå optimal signal og kontrast. Gentag for andre kanaler ved at vælge APC og SHG spor under vinduet Kanaler.
- Vælg de billeddannende parametre. Klik på "Acquisition Mode" for at åbne sit vindue. Indstil ramme størrelse til at være 1.024 x 1.024 pixels, og gennemsnit af 4X at opnå billeder af høj kvalitet.
- Anskaf en 2D snapshot. Vælg alle kanaler under Kanaler vinderdow og klik på "Snap" under fanen Acquisition. Kontroller kvaliteten af billedet og ændre imaging parametre, hvis nødvendigt.
- Anskaf 2D tid-lapse billede.
- Check off "Time Series" i fanen Acquisition at åbne vinduet Time Series. Indtast 0 under intervallerne, og 40 for det samlede antal scanninger til at tage 40 billeder kontinuerligt uden tidsinterval.
Bemærk: 40 scanninger genererer ca. 5 minutters lange tidsserier med en scanningshastighed på 7,5 sek / ramme og billedstørrelsen på 600 um x 600 um. Juster intervallet og antallet af scanninger afhængigt mikroskopet, indstillinger billedoptagelse og billedhastigheden af kameraet. En fast interval (> 0 sek) kan anvendes til at sammenligne time-lapse billeder optaget på forskellige tidspunkter. Der kan kræves en længere time-lapse imaging varighed afhængig af den forventede gennemsnitlige hastighed af neutrofiler (eller andre celler af interesse) i den eksperimentelle tilstand.
- Check off "Time Series" i fanen Acquisition at åbne vinduet Time Series. Indtast 0 under intervallerne, og 40 for det samlede antal scanninger til at tage 40 billeder kontinuerligt uden tidsinterval.
- Acquire 3D-billede.
- Check off "Z-Stack" under fanen Acquisition at åbne Z-Stack vindue. Start "Live" preview mode for FITC-dextran. Fokus på toppen af prøven, og klik på "Set først", og fokusere på den anden ende af prøven og klik på "Set Sidste" i Z-stack vindue.
- Indstil intervallet til at være 10 um under Z-stakken vindue. Afhængigt af første og sidste optiske skive valgt i det foregående trin, vil dette generere 10-20 skiver, med samlede optiske tykkelse af 90-180 um.
Bemærk: z-stak interval afhænger af størrelsen af den pinhole, som bestemmer tykkelsen af den optiske skive. Indstil intervallet til at være mindre end tykkelsen af den optiske skive. - Klik på "Start Experiment" under fanen Acquisition at begynde at indsamle billeder.
- Anskaf 3D tidsforskudt billede.
- Check off "Time Series" og "Z-stack" under fanen Acquisition at åbne Time Seriesog Z-stack vinduer.
- Opsæt Time Series og erhvervelse Z-stack parametre som beskrevet i trin 2.14 og 2.15. Klik på "Start Experiment" under fanen Acquisition at begynde at indsamle billeder.
- Overvåg musen under billedbehandling for at sikre det er stabilt og bevidstløs. Hvis musen er ustabil og / eller bevidsthed under billeddannelse, fjerne musen fra scenen, tilføre yderligere 100-150 pi af bedøvende opløsning intraperitonealt, og fortsætte billeddannelse.
Bemærk: Tegn på ustabilitet omfatter hurtig vejrtrækning og bevægelse af musen, der kan ses som skiftende artefakter i erhvervede billeder. - Efter overtagelsen billede, tage musen ned fra scenen og returnere det til buret. Brug en varmelampe for at holde den varm, og overvåge musen, indtil det er bevidst.
3. Billedanalyse og Kvantificering
- Brug billede analyse software til at analysere 3D og tidsseriedata. Åbn softwaren ogtilføje billeder ved at trække dem ind i det åbne skærmen, som kaldes "Arena" visning. Dobbeltklik på et billede for at åbne den; billedet vil blive åbnet under "overgå" visning.
- Opret en 2D / 3D-billede.
- Fra "Mere" bar fundet på i øverste højre hjørne, klik på "Rediger / Vis Display Justering" for at åbne "Display Justering" vinduet. Optimer fluorescens displayet ved at justere de tærskelværdier for hver kanal, og tage et snapshot for at gemme billedet.
- Generer objekt spor ved hjælp time-lapse billeder.
- Åbn billede, der skal analyseres under "overgå" visning. Klik på ikonet med et billede af orange prikker, fundet under ikonet "overgå". Dette vil åbne et nyt "Steder" vinduet.
- Tjek off "Track Steder (over tid)" og klik på den blå pil for at gå til næste trin. Vælg den kanal, der indeholder de objekter til at spore under "Source Channel", og den forventede objekt diametis under "Anslået XY Diameter" ved at skrive et tal i. Klik på den blå pil for at gå til næste trin.
Bemærk: neutrofil sporing, skal du vælge den kanal, som indeholder APC fluorescens til neutrofiler og sæt objekt diameter til 12 um baseret på den kendte størrelse af neutrofiler. - I vinduet, finde og vælge "Kvalitet" filter ved at klikke på pil ned. Overhold pletter defineret af software og justere tærsklen manuelt for at inkludere eller ekskludere pletter. Når tærsklen er defineret, skal du klikke på den blå pil for at gå til "Tracking" trin.
- Under Algoritme, finde og vælge "Autoregressive Motion Algorithm" ved at klikke på pil ned. Indtast 10 um for "Max Distance" og 3 for "Max Gap Size" findes under Parametre. Check off "Fyld hullerne med alle fundne objekter" for at begynde at spore, og klik på den blå pil for at gå til næste trin.
Bemærk: "Autoregressive bevægelse algoritme" anvendes feller objekter, der er rettet bevægelse, idet den genererer spor baseret på forudsagte placering fra tidligere bevægelse. "Max Distance" og "Max Gap Size" kan justeres afhængigt af den forventede dimension og hastighed af objektet, der spores, samt den samlede varighed af den time-lapse billede. - Under Filtertype, skal du vælge "Lyt Varighed" filter. Klik på den grønne pil for at afslutte sporing, og kontrollere de spor, der er blevet genereret. Gå tilbage til det forrige trin, hvis nødvendigt manuelt sortere sporene.
- Hvis de genererede time-lapse billede driver, rette for translationel afdrift.
- Klik på ikonet med et billede af en blyant. Dette er en redigering fane, der åbner "Rediger Tracks" vinduet. Undersøg time-lapse billedet og find en reference plet, som ikke bør bevæge sig for alle billeder.
- I øverste venstre hjørne af skærmen, find "Pointer" vinduet og afkrydse "Vælg" for at aktivere cursor for at vælge en plet. Klik på henvisningen stedet.
- Klik på "Korrekt Drift" i "Rediger Tracks" vinduet. Check off "Translationel Drift". Softwaren vil automatisk generere den korrigerede serie af billeder.
- Mål cellulære bevægelse defineret af objektet spor i time-lapse billeder.
- Under "Rediger Tracks" vinduet, afkrydse "Spor" og vælge et nummer, der repræsenterer bevægelsen af en celle. Det valgte spor vil blive fremhævet i gult i tidsserien billede.
- Klik på ikonet med et billede af en graf for at åbne "Statistics" vinduet (fanen statistik).
- Under "Selection", vælg "Track Speed Mean" ved at klikke på pil ned for at generere sporet hastighed betyder for det valgte spor. Vælg forskellige spor og gentag trin for at måle sporet hastighed betyder for alle celler af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murin femoral knoglemarv opnået adgang ved hjælp af WC for at muliggøre visualisering af individuelle neutrofiler og vaskulære netværk. Figur 1 viser WC instrumentet og beskriver den kirurgiske procedure, som involverer eksponering af den femorale knogle og udtynding af cortical knogle for at få optisk adgang inde i knogle. Operationen er veltolereret i mus; de blev vurderet for uønskede fysiske reaktioner, såsom bagben hævelse, ikke-vægtbærende på lemmer, selv-lemlæstelse, cellulitis og dermatitis, samt skader på WC i 5 dage efter kirurgi, med ingen rapport af nød. Især vinduet forbliver optisk klar til IVM i op til 40 dage, hvilket kan gøre det muligt langsigtet vurdering af cellulære og strukturelle ændringer efter en intervention.
Vaskulaturen i knoglemarven kan visualiseres ved intravaskulære farvestoffer, såsom FITC-dextran(Figur 2). Da kontrasten er afhængig af indsprøjtning af farvestoffet, den erhvervede billedet repræsenterer funktionelle vaskulatur, hvor der er tilstrækkelig blodgennemstrømning. Foruden vaskulaturen, kan neutrofiler farves in vivo under anvendelse af anti-Ly6G antistof. Figur 3A og 3B repræsenterer den samme område af knoglemarven observeret på forskellige tidspunkter, hvor neutrofiler ses både i det intravaskulære og ekstravaskulære rum. Disse områder var kendetegnet ved de vaskulære vartegn. Rhodamin 6G kan anvendes som et alternativ til anti-Ly6G at farve neutrofiler in vivo; Men det diffunderer ud af vaskulaturen og pletter monocytter i det ekstravaskulære rum på en ikke-specifik måde. Derfor er anti-Ly6G foretrækkes, fordi den muliggør specifik billeddannelse af neutrofiler. Figur 3C repræsenterer billeddannelse af den korticale knogle, som hovedsageligt består af collagenfibre. Den maksimale dybde for billeddannelse opnåsi dette forsøg er 180 um (figur 3C).
Time-lapse fluorescensimagografi letter sporing og kvantificering af cellulær bevægelse in vivo. Figur 4A viser sporing af neutrofiler i knoglemarven vaskulære niche. Imaging uden yderligere tidsinterval mellem hver scanning muliggør nøjagtig sporing af celler; imidlertid nogle brugerinput kræves for yderligere at forbedre nøjagtigheden af spor genereret af softwaren. Sporing af pletter (dvs. celler af interesse) aktiverer kvantificering af forskellige parametre, herunder gennemsnit spor hastighed (figur 4B). Andre parametre, der kan måles, omfatter, men er ikke begrænset til, banelængde, ændring i plet størrelse, form og intensitet. Dette assay tilvejebringer kvantificering af forskellige parametre, der forbedrer karakteriseringen af cellulære bevægelser og interaktioner.
Figur 1: Femur vindue kammer (WC), billedbehandling scenen og den kirurgiske procedure (A) Skræddersyede titanium femur toilet med en U-formet bar, der tjener til at fastsætte lårbenet på plads.. WC har en 8 mm dækning diameter glas, sikret ved en snap ring. (B) Skræddersyede imaging fase. Et varmeelement er anbragt på bunden af scenen for at opretholde fysiologisk temperatur af musen under billedbehandling. De to krokodillenæb anvendes til at holde WC. (C - H) Kirurgisk procedure til installation af lårbenet WC. (C) Lårbenet eksponeres mellem flexor og extensor musklerne. Muskler fjernes ikke under proceduren. (D) Den U-formede bar er placeret under lårbenet, og (E) WC er installeret og fastgøres med to møtrikker. (F) dentalcement påføres mellem knoglen ogWC at fylde rummet. (G) De dermis sutureres og (H) dækglasset er fastgjort på plads med låseringen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: 3D fluorescensafbildning af vaskulære netværk i knoglemarven in vivo repræsentativt billede af vaskulatur i knoglemarven, afbildes gennem femur WC.. Vaskulatur (grøn) visualiseres ved haleveneinjektion af 2 MDa FITC-dextran. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: 3D-afbildning af vaskulære netværk, neutrofiler og knoglematrix in vivo Billeder af vaskulatur og neutrofiler i knoglemarven (A) 3 dage og (B) 10 dage efter lårbenet WC kirurgi.. Neutrofiler, farves ved haleveneinjektion af APC-mærket Ly6G antistof, ses både i de intravaskulære og ekstravaskulære rum. Pilene peger på den vaskulære struktur set på begge dage, hvilket indikerer evnen til at spore den samme placering over tid. Scale bar = 50 um. (C) Bone matrix kan visualiseres ved hjælp SHG (hvid), foruden vaskulatur (grøn) og neutrofiler (rød). Billedet blev købt 40 dage efter WC kirurgi. Scale bar = 70 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sporing neutrofil bevægelighed inden for vaskulære netværk af knoglemarven in vivo (A) Spor stier neutrofiler inden det vaskulære netværk.. Spor genereres automatisk ved hjælp af softwaren indbyggede Autoregressive Motion algoritme. Hver hvid prik repræsenterer et midtpunkt af en partikel spores (neutrofiler). Scale bar = 50 um. (B) Mean track hastighed målt for intravaskulære og ekstravaskulære neutrofiler, hvilket indikerer forskel i bevægelsen af neutrofiler (Error bar = betyder + SD, * p = 0,0176, to-halet t-test). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Real-time, seriel billeddannelse af de dynamiske cellulære processer i knoglemarven giver information, der ellers udfordrende at opnå ved anvendelse af traditionelle teknikker, såsom histologi og totale blodtal. Lårbenet WC model beskrevet her giver unikke muligheder for at undersøge cellulære og strukturelle ændringer i knoglemarven over tid. Selvom en femur WC model er tidligere rapporteret, vores nye design giver et større imaging synsfelt og mindre samlet WC størrelse, som er mere kompatible til brug i voksne mus. Lårbenet WC modellen kan anvendes i en række forskellige musestammer herunder immunkompetente og / eller transgene reporter mus.
Der er kritiske trin i løbet af kirurgi, der bestemmer den samlede varighed og kvaliteten af billedbehandling. Når udsætter lårben, er kun en stump dissektion af muskler mellem flexors og extensors udført; fjernelse af disse muskler kan resultere i nedsat mobilitet musen og must undgås. Endvidere formaling af den korticale knogle skal udføres omhyggeligt. Slibning ca. 50 um er tilstrækkelige til optisk billeddannelse og samtidig bevare den strukturelle integritet af den femorale vaskulære netværk. Anvendelse af dental cement omkring knoglen er afgørende for forsegling af kirurgisk eksponerede område, forhindrer væskeophobning, og der opretholdes en klar optisk afbildning vindue i over en måned, samtidig med at risikoen for infektion. Dental cement virker også til at fiksere WC på plads, forhindrer WC rotere omkring den femorale knogle. Endelig låseringen anvendes til at holde dækglasset er egnet til anvendelse med vand-nedsænkning linse, leverer vand-forsegling. Den snap ring anbefales over lim til at fastgøre dækglas til WC, fordi tilsætning af lim kan øge kløften mellem knoglen og dækglas, eller placere dækglas i en lille vinkel i forhold til billedplanet, og derved reducere den opnåelige indtrængningsdybde for billeddannelse. Endvidere, Fjederringen er nyttig, når dækglasset skal rengøres eller udskiftes.
Ud over den operation, er der flere kritiske trin for at opnå en vellykket optisk afbildning af knoglemarven. Til billedet inde lårbenet WC er WC placeres vandret til billedbehandling scenen for korrekt nedsænkning af objektive linse. Den specialfremstillede imaging fase er egnet til dette formål, da det giver mulighed for justeringer af vinklen af WC i forhold til linsen. Desuden udformningen af WC, især størrelsen af den U-formede bar opretholder knoglen i vandret stilling så tæt på dækglasset som muligt for at opnå optimal indtrængningsdybde. Under billedbehandling, kan vejrtrækning artefakter observeres som horisontale linier i fluorescens billeder. Ud over at sikre WC til billeddannelse fase kan temperaturen af varmeelementet under billeddannende fase justeres til på passende opvarme dyret at minimere overdreven vejrtrækning. Et tyndt lag gazekan placeres mellem musen og den opvarmede scenen for yderligere at hjælpe med at reducere vejrtrækning artefakter under billedbehandling. Afhængigt af den biologisk afbildning målet, kan erhvervelse parametre såsom frame rate, billedbehandling volumen og billeddannelse varighed også justeres til at indhente tilstrækkelige billeder at behandle eksperimentelle spørgsmål. For eksempel kan hastigheden af neutrofil migration og gennemgang varierer under forskellige eksperimentelle betingelser, fra 2,8 um / min for hjemmehørende neutrofiler under basale betingelser til overalt i området fra 5-10 um / min for neutrofiler under inflammatoriske tilstande 19-21. Således ville den passende billeddannelseshastighed og varighed for neutrofil sporing in vivo også variere baseret på eksperimentelle betingelser. Derudover, som det ses fra resultaterne, sporing af celler i vaskulaturen ville kræve en hurtig billeddannelse kamera med en høj billedhastighed (30 billeder / sek). Men hvis målcellerne er bosiddende i ekstravaskulære rum, eller hvis celle-til-celle interactioforventes n af interesse at forekomme langsommere, bør billedkvaliteten prioriteres løbet imaging hastighed.
Indflydelsen af injicerede antistoffer til in vivo cellefarvning på cellulær funktion skal også overvejes. I vores undersøgelse anvendte vi anti-Ly6G antistof (1A8 klon), der typisk anvendes ved høje doser (150-250 ug) at depletere neutrofiler fra cirkulation og studere deres rolle i forskellige sygdomsmodeller. Yipp og Kubes viste, at fluorokromkonjugerede mærket anti-Ly6G antistoffet ikke forstyrrer leukocytrekruttering ved lave intravaskulær injektion doser (1-40 pg) 22. En nyere undersøgelse tyder på, at fluorokromer, der har store forskelle i molekylmasse og kemiske struktur, kan forskelligt påvirke funktionen af anti-Ly6G 23. Studiet viste, at FITC-mærket anti-Ly6G, men ikke PE- og APC-mærkede antistoffer, effektivt udtømning neutrofiler in vivo ved en lav koncentration (30 ug).I vores undersøgelse har vi ikke observere neutrofil udtømning overarbejde hjælp 4 ug af APC-mærket anti-Ly6G. Ikke desto mindre er yderligere karakterisering af funktionen af fluorochrom-mærket anti-Ly6G antistof in vivo kræves for at validere dens anvendelse i intravital billeddannelse. Dette gælder også for andre antistoffer, som har funktionel evne til at ændre cellulære interaktioner. Som et alternativ til in vivo cellefarvning med antistoffer, transgene reporter mus 24 og / eller mærket fluorescerende celler 25 kan anvendes til at visualisere neutrofiler eller andre cellepopulation af interesse in vivo.
Den lårbenet WC model er beskrevet i denne protokol muliggør imaging i op til 40 dage efter operationen. Nogle af udfordringerne for langsigtet billeddannelse ved hjælp af denne WC model omfatter forsinket knogleheling proces og vedligeholdelse af et rent glas vindue. Især har vi ikke observere tegn på synlig knogleheling efter WC implantation, hvilket ville herunde fortykkelse af periost; dette er ikke uventet, da knogleheling proces opstår typisk efter 1 ½-3 måneder 26,27. Opretholdelse af en ren og optisk klare vindue kan opnås ved anvendelse af dentalcement, og brugen af fjederringen og dækglasset som tilvejebringer en fast vand-tætning med vævet. Den dækglas kan lejlighedsvis rengøres med bomuld tip udefra for at fjerne støv og snavs. WC har en bred billeddannelse felt, næsten dækker hele længden af diafysen region (ca. 8,4-8,6 mm 28), hvilket gør det bedre end den tidligere offentliggjorte model 18. Men adgang til de distale regioner og dybere marv hulrum er begrænset. Især er det trabekulære-rige metafyse, placeret ved de distale ender af diafysen, kendt for at være rige på HPSCs 29. Disse områder kan tilgås histologisk eller ved IVM som en terminal procedure. Alternativt forskellige billeddiagnostiske metoder såsom mikro-compligele- des tomografi kan anvendes til at afbilde de distale områder i knoglemarven in vivo 30. Sådanne metoder supplerer IVM, giver en integreret tilgang til vurdering af anatomi og de forskellige cellulære og strukturelle ændringer og interaktioner i knoglemarven.
Protokollen beskrevet her tilbyder en ny tilgang til langsigtet spatio-temporale vurdering af den femorale knoglemarv hos mus ved cellulær opløsning. De metoder, der præsenteres muliggøre in vivo seriel imaging at spore bevægelser af en enkelt celle eller cellulære populationer end biologisk relevante tidsrum, samtidig opnå strukturel og funktionel information af knoglemarven. Derudover kan udføres kvantitativ billedanalyse yderligere at karakterisere cellulære og funktionelle ændringer, såsom sporing af cellulære bevægelser. Anvendelse af denne lårbenet WC model i forskellige stammer af mus, især i transgene reporter mus 31,kan yderligere muliggøre undersøgelse af flere individuelt mærkede cellepopulationer som er involveret i hæmatopoiese. Derfor er den beskrevne protokol er bredt anvendelig til en bred vifte af prækliniske undersøgelser med forskellige biologiske processer i levende murine knoglemarv, herunder undersøgelser i hæmatopoiese, leukæmi, HPSC transplantation, immune regulering, knoglemarvens mikromiljø (f.eks hypoksisk niche) og bidrag immunceller til tumorprogression og metastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Advanced Optical mikroskopi Facility (www.aomf.ca) ved University Health Network for at få hjælp med mikroskopi, og Mr. Jason Ellis fra prinsesse Margaret Cancer Center Machine Shop for fremstilling af WC og billedbehandling scenen. Vi vil også gerne takke Dr. Iris Kulbatski for manuskript redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1 mm- 8.5 mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9 mm (distance between two holes), 0.7 mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8 mm (length), 1.6 mm (width), 3.7 mm (height) |
| Coverglass (8 mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8 mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9 cm (length), 11 cm (width), 0.9 cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
- Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
- Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe? Carcinogenesis. , (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
- Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
- Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
- Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
- Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
- Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
- Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
- Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).
