方法文章

基于显微镜的高通量筛选参与宿主因素的检测方法 布鲁氏菌 Hela细胞感染

DOI：

10.3791/54263

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2016年8月5日

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1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了两种基于显微镜的高通量筛选方法，用于研究参与Brucella感染的宿主因子。Brucella入侵检测法用于鉴定宿主细胞中支持其入侵的关键因子，而终点检测法则用于鉴定支持其胞内复制的宿主因子。尽管这些方法可适用于其他实验体系，本文以HeLa细胞中的siRNA筛选为例，详细说明实验方案的操作流程。

摘要

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Brucella 属细菌是兼性胞内病原体，可感染动物这一自然宿主。人类感染通常由直接接触受感染动物或摄入被污染的食物引起，可导致严重的慢性感染。

布鲁氏菌 可侵入专业和非专业的吞噬细胞，并在内质网（ER）来源的液泡内复制。宿主细胞中支持该过程所必需的因子包括 布鲁氏菌 进入宿主细胞、逃避溶酶体降解以及在类似内质网的区室中复制的机制在很大程度上仍不清楚。本文描述了两种用于鉴定参与这些过程的宿主因子的检测方法 布鲁氏菌 在HeLa细胞中的侵入与复制。本实验方案描述了RNA干扰技术的应用，但也可采用其他筛选方法。该检测基于使用自动化宽场显微镜，对荧光标记的细菌在荧光标记的宿主细胞中的定位进行检测。荧光图像通过CellProfiler中标准化的图像分析流程进行分析，可实现基于单细胞的感染评分。

在终点检测实验中，于感染后两天测定细胞内复制情况。这使得细菌有足够时间转运至其复制生态位，并在细菌进入宿主细胞约12小时后启动增殖。因此，成功建立细胞内生态位的布鲁氏菌（Brucella）将在宿主细胞内大量增殖。由于细胞内复制的细菌数量远超过单个细胞外或非复制性的细胞内细菌，因此可使用持续表达GFP的菌株，通过强烈的GFP信号来识别被感染的细胞。

相比之下，在侵入实验中，区分细胞内和细胞外细菌至关重要。此处使用一种编码四环素诱导型GFP的菌株。通过添加庆大霉素灭活细胞外细菌的同时诱导GFP表达，可根据GFP信号区分细胞内与细胞外细菌，仅细胞内细菌能够表达GFP。这使得在细胞内增殖启动之前，即可稳定地检测单个细胞内细菌。

引言

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Brucella 属细菌是革兰氏阴性、兼性胞内寄生的病原菌，属于α-变形菌纲。它们在其自然宿主（如牛、山羊或绵羊）中可引起流产和不育，导致疫区严重的经济损失。布鲁氏菌病是全球最重要的人畜共患病之一，每年导致超过50万例新发人类感染1。人类感染通常通过与受感染动物直接接触或摄入受污染的食物（如未经巴氏消毒的牛奶）而传播。该发热性疾病的症状缺乏特异性，给布鲁氏菌病的诊断带来困难。若未及时治疗，患者可能发展为慢性感染，并出现更严重的症状，如关节炎、心内膜炎和神经病变2。

在细胞水平上 布鲁氏菌 能够侵入吞噬细胞和非吞噬细胞，并在一种称为细胞内区室的结构中进行复制 布鲁氏菌含细菌空泡（BCV）。细菌的内化需要Rac、Rho介导的肌动蛋白细胞骨架重排以及Cdc42的直接激活3在真核宿主细胞内，细菌容纳泡（BCV）沿内吞途径运输，尽管与溶酶体相互作用，细菌仍能避免被降解4液泡ATP酶对BCV的酸化作用是诱导细菌IV型分泌系统（T4SS）表达所必需的5. 研究认为，由 IV 型分泌系统（T4SS）分泌的细菌效应蛋白对于 布鲁氏菌 以建立其复制生态位，因为T4SS的缺失6 或抑制囊泡ATP酶会导致细胞内生态位建立的缺陷7细菌在转运阶段不会进行复制，直到它们

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方案

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注意：所有涉及活的Brucella abortus菌株的操作必须在生物安全三级（BSL3）实验室中进行，并严格遵守所有相关法规和安全防护措施。

1. 筛选平板的制备及细菌与细胞的培养

  1. 制备 布鲁氏菌 abortus 起始培养物
    1. 划线 Brucella abortus 2308 (B. abortus从-80 °C保存的牛奶菌种中取样，接种于含50 µg/ml卡那霉素的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA/Km）平板上，37 °C培养3-4天。使用该菌株 布鲁氏菌 abortus 2308 pJC43 (apHT::GFP)13 用于终点测定和菌株 Brucella abortus pAC042.08（apht::dsRed，tetO::tetR-GFP用于进入实验。
      注意：光滑型脂多糖（LPS）的 Brucella abortus 是一种重要的毒力决定因子，但粗糙型突变体可能以相对较高的频率出现14因此，我们建议在开始本实验前对培养菌株的状态进行检测。
    2. 在四个TSA/Km平板上重新划线接种细菌，覆盖整个平板，于37 °C培养2-3天。
    3. 使用一次性塑料接种环，将细菌从TSA/Km平板转....

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结果

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图1A展示了在终点实验中用于自动识别感染细胞的图像分析示例。通过DAPI染色识别HeLa细胞的细胞核，计算出围绕细胞核、宽度为8像素的核周区域，以及通过将细胞核扩展25像素得到的Voronoi细胞区域。由于细菌主要在核周区域增殖，因此该区域内的GFP荧光强度是区分感染与非感染细胞最可靠的指标。在某些情况下，细菌被发现可在核周区域外增殖，或与细胞核区域大量重叠，因此也考虑了这两个额外的区域用于感染细胞的识别。图像分割及GFP荧光强度的测量均使用图像分析软件CellProfiler 2完成。

Brucella 成功侵入宿主细胞需要肌动蛋白的重排3。因此，敲低肌动蛋白重塑相关组分可作为siRNA筛选的阳性对照。我们发现，通过siRNA介导敲低参与肌动蛋白聚合的Arp2/3复合物组分，可显著抑制Brucella对HeLa细胞的感染（未发.......

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讨论

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细菌病原体已进化出多种策略，以操纵真核宿主细胞为其自身利益服务。引起急性感染的病原体通常表现出快速增殖，这往往伴随着免疫系统的显著激活以及感染细胞活力的丧失。相比之下，引起慢性感染的Brucella及其他病原体则能够在宿主细胞内建立长期的相互作用。因此，这些细菌需要在不破坏细胞稳态的前提下，精细调控宿主细胞的功能以利于自身生存。一种在基因组水平上鉴定参与感染过程的宿主细胞因子的常用策略，是利用系统性基因敲低（例如通过siRNA）并结合感染的功能性检测读出结果。本文介绍了适用于基于荧光细菌检测的高内涵、高通量筛选的实验方案。

成功进行大规模筛选的一个重要方面是稳健的自动化图像分析和感染评分。本文所述方法依赖于通过DAPI染色检测细胞核，该方法通常非常可靠，并定义一个感兴趣区域用于测量病原体信号。终点检测利用在核周、细胞核以及Voronoi细胞体中增殖细菌的检测，从而能够可靠地识别被感染的细胞。此外，该方法允许为各个区室设定不同的阈值。虽然在细胞核和核周区域可以设置相对较低的阈值，但在Voronoi细胞体中应采用较高的阈值。这有助于避免检测到来自邻近细胞的GFP信号，.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本工作得到了瑞士系统生物学计划 SystemsX.ch 框架下研究与技术开发（RTD）项目 InfectX 和 TargetInfectX 的资助，项目编号分别为 51RT 0_126008 和 51RTP0_151029。我们感谢瑞士国家科学基金会（SNSF）提供的资助 310030B_149886。S.H.L 和 A.C. 的工作得到了巴塞尔生物中心“卓越奖学金”国际博士生项目的资助。感谢 Simone Muntwiler 提供的技术支持。我们感谢 Dirk Bumann 提供质粒 pNF106，以及 Jean Celli 提供质粒 pJC43 和 pJC44。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）BD236950
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）Fluka22092
硫酸卡那霉素Sigma-Aldrich60615
脱脂牛奶
250 ml 螺口瓶康宁8396
DMEMSigma-AldrichD5796
胎牛血清（FCS）Gibco10270热灭活
胰蛋白酶-EDTA（0.5%）Gibco15400-05410倍浓缩液，用PBS按1:10稀释
Scepte 2.0 细胞计数仪默克密理博PHCC20060可使用替代的细胞计数设备
Greiner CELLSTAR 384孔板Sigma-AldrichM2062
可剥离铝箔Costar6570
试剂分配器： "Multidrop 384 试剂分配器"赛默飞世尔科技5840150可使用替代试剂分配器。
转染试剂： "Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778-150
自动洗板机 "ELx50-16型洗板机"BioTekELX5016该洗板机配备一个16通道歧管，适用于384孔板。其设计可置于生物安全柜内，且在清洗过程中带有覆盖板子的盖子，可降低气溶胶产生的风险。也可使用具有类似功能的其他洗板机。
庆大霉素Sigma-AldrichG1397
盐酸无水四环素Sigma-Aldrich37919100 μg/ml 溶液溶于100%乙醇中，保存于-20℃ °C 用铝箔包裹避光保护
PBSGibco20012
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148溶于0.2 M HEPES缓冲液（pH 7.4）中。-20℃保存 °C，使用前一天新鲜解冻。注意：PFA 通过吸入、皮肤接触或吞咽具有毒性。
HEPESSigma-AldrichH3375
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
DAPI罗氏10236276001
随机对照siRNADharmaconD-001810-10
Kif11 siRNADharmaconL-003317-00
ARPC3 siRNADharmaconL-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP)细胞 等12
pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP)构建：pJC44 4 用EcoRI进行消化，随后使用Klenow酶生成平末端，再用SalI进行消化。使用引物prAC090和prAC092从pNF106中扩增出TetR-GFP。经SalI消化后，将TetR-GFP扩增产物连接至已消化的pJC44载体中。
引物 prAC090Sigma-AldrichTTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
引物 prAC092Sigma-AldrichTTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2ATCCCCL-2
ImageXpress MicroMolecular Devices IXM 成像显微镜配备精密电动Z轴载物台的全自动细胞成像显微镜。可根据需要选用以下指定的自动化显微成像系统的替代设备，以及硬件和软件的替代组件。
高速激光自动对焦Molecular Devices 1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X 物镜尼康 MRF00100数值孔径 0.50，工作距离 1.20 mm，微分干涉（DIC）棱镜：10倍，弹簧加载
Photometrics CoolSNAP HQ 黑白CCD相机Molecular Devices 1-2300-10601,392 x 1,040 成像像素，6.45 x 6.45 µm 像素，12 位数字化
MetaXpress 软件Molecular Devices 9500-0100
LUI-Spectra-X-7LumencorSPECTRA X V-XXX-YZ光源引擎。使用的光源如下：紫色（DAPI）、青色（GFP）、绿色/黄色（RFP）
DAPI单波段激发器SemrockFF01-377/50-25
DAPI单波段发射器SemrockFF02-447/60-25
用于 DAPI 的单波段二向色镜SemrockFF409-Di03-25x36
用于GFP的单波段激发器SemrockFF02-472/30-25
用于GFP的单波段发射器SemrockFF01-520/35-25
用于GFP的单带二向色镜SemrockFF495-Di03-25x36
RFP单波段激发器SemrockFF01-562/40-25
用于RFP的单波段发射器SemrockFF01-624/40-25
用于RFP的单带二向色镜SemrockFF593-Di03-25x36

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their ....

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RNA CellProfiler

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