Ilustramos aquí un ensayo de unión a membranas in vitro en el que las interacciones entre el Gag del VIH-1 y las membranas lipídicas se analizan visualmente utilizando Gag marcado con YFP sintetizado en un sistema de traducción in vitro basado en germen de trigo y GUVs preparados por una técnica de electroformación.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)
En este artículo
Resumen
Resumen
La proteína estructural de VIH-1, Pr55 Gag (o Gag), se une a la membrana plasmática en las células durante el proceso de ensamblaje del virus. unión de la mordaza de la membrana es un paso esencial para la formación de partículas de virus, ya que un defecto en los resultados de unión a membrana de la mordaza de deterioro severo de la producción de partículas virales. Para obtener detalles mecanicistas de la membrana interacciones Gag-lípidos, los métodos in vitro basados en RMN, la huella de la proteína, resonancia de plasmones superficiales, centrifugación liposoma de flotación, o perla de lípidos de fluorescencia unión se han desarrollado hasta el momento. Sin embargo, cada uno de estos métodos in vitro tiene sus limitaciones. Para superar algunas de estas limitaciones y proporcionar un enfoque complementario a los métodos previamente establecidos, se desarrolló un ensayo in vitro en el que las interacciones entre el VIH-1 Gag y las membranas de lípidos tienen lugar en un entorno de "célula como". En este ensayo, la mordaza de la unión a las membranas lipídicas se analiza visualmente utilizando YFP-Tagged Gag sintetizado en un germen de trigo-basa en el sistema de traducción in vitro y GUVs preparados por una técnica electroformation. Aquí se describen los antecedentes y los protocolos para obtener proteínas Gag de larga duración myristoylated y membranas GUV necesarios para el ensayo y para detectar la unión mediante microscopía Gag-GUV.
Introducción
virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es un virus con envuelta que se reúne en los brotes y de la membrana plasmática (PM) en la mayoría de tipos de células. El montaje de VIH-1 partículas de virus está impulsado por la proteína del núcleo viral 55 kDa denominado Pr55 Gag (Gag). Gag se sintetiza como una poliproteína precursora compuesta de cuatro grandes dominios estructurales, a saber, matriz, la cápside, la nucleocápside, y p6, así como dos péptidos espaciadores SP1 y SP2. Durante el montaje, la matriz (MA) de dominio es responsable de la orientación de la mordaza para el lugar de montaje, la cápside (CA) de dominio media interacciones Gag....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Día 1: Expresión de la mordaza de proteínas usando el basado en lisado de germen de trigo in vitro transcripción-traducción Sistema
1. Preparación de VIH-1 Gag
- Retire todos los reactivos del kit FBEC germen de trigo comercial del congelador (lisados de germen de trigo se almacenan a -80 ºC; otros reactivos a -20 ºC). Descongelar en hielo y mezclar los componentes como se muestra en la Tabla 1.
| Mix-1 (La alimentación de la mezcla) | |
| solución de al.... |
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Utilizando el protocolo anterior, hemos preparado GUVs compuestos de POPC + POPS + Chol (relación molar: 4,66: 2,33: 3). Esta composición fue elegida para representar aproximadamente las concentraciones de colesterol y PS de la PM. Robusto y eficiente de unión de Gag se observó sólo cuando el cerebro-PI (4,5) P2 se incluyó en la mezcla de POPC + + POPS Chol-PI cerebro (4,5) P2 [relación molar (POPC + POPS + + Chol : 4: 2: 3: 1] en este ejemplo) (Figura.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El ensayo de unión GUV como se describe anteriormente proporciona una buena alternativa en escenarios en los otros ensayos de interacción proteína-lípido tienen sus limitaciones. Este ensayo nos permite examinar las interacciones entre myristoylated la mordaza de cuerpo entero y ácidos lípidos con cadenas de acilo de longitud nativa en el contexto bicapa lipídica y lo hacen sin larga centrifugación de flotación a través de gradientes de sacarosa de alta densidad u otro tratamiento posterior a la unión de Gag-lípido comp.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Declaramos que no tenemos intereses en conflicto.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Mohammad Saleem, Jing Wu y Krishnan Raghunathan útil para los debates. También se agradece a Priya Begani de asistencia durante el rodaje. Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 AI071727 (AO) y R01 GM110052 (a SLV).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Multímetro digital | Meterman | 30XR | Un multímetro genérico que puede medir la resistencia y los voltios servirá para este propósito. |
| Generador de funciones | Instek | GFG-8216A | Un generador de funciones genérico que sea capaz de generar una onda sinusoidal a 10 Hz y 1 V es suficiente. |
| Portaobjetos de vidrio recubierto ITO | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubadora | Hoefer | Cualquier incubadora que pueda mantener la temperatura con precisión será suficiente | |
| Cámara de vacío | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Jeringa | Hamilton | 80400 | Calibre 22S, número de jeringa 702 |
| Kit base de elastómero PDMS Sylgard, Dow-Corning | Sylgard, 184 | ||
| RTS 100 Kit CECF de germen de trigo | BiotechRabbit, Berlín, Alemania | BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Lípidos Polares, Alabastro, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Lípidos Polares | 840034C | |
| Colesterol | Avanti Lípidos Polares | 700041P | |
| Cerebro-PI(4,5)P2 | Avanti Lípidos Polares | 840046X |
Referencias
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
