Describimos un protocolo básico para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro. Este protocolo se puede optimizar en función del nivel de actividad y los requisitos de una ATPasa purificada determinada.
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En este artículo
Resumen
Resumen
enzimas trifosfato-hidrólisis de la adenosina, o ATPasas, juegan un papel crítico en una diversa gama de funciones celulares. Estas proteínas dinámicas pueden generar energía para el trabajo mecánico, como el tráfico de proteínas y la degradación, transporte de solutos, y los movimientos celulares. El protocolo descrito aquí es un ensayo básico para la medición de la actividad in vitro de ATPasas purificadas para la caracterización funcional. Las proteínas se hidrolizan ATP en una reacción que resulta en la liberación de fosfato inorgánico, y la cantidad de fosfato liberado a continuación, se cuantifica mediante un ensayo colorimétrico. Este protocolo altamente adaptable se puede ajustar para medir la actividad de ATPasa en ensayos cinéticos o de punto final. Se proporciona aquí un protocolo representativo basado en la actividad y requisitos de EPSE, la AAA + ATPasa implicada en la secreción de Tipo II en la bacteria Vibrio cholerae. La cantidad de proteína purificada necesaria para medir la actividad, la duración del ensayo y la sincronización y la cantidad de saintervalos mpling, tampón y composición de sal, temperatura, cofactores, estimulantes (si lo hay), etc., pueden variar de los descritos aquí, y por lo tanto una optimización pueden ser necesarios. Este protocolo proporciona un marco básico para ATPasas que caracterizan y se puede realizar rápida y fácilmente ajustarse según sea necesario.
Introducción
ATPasas son enzimas integrales en muchos procesos en todos los reinos de la vida. Las ATPasas actúan como motores moleculares que utilizan la energía de la hidrólisis del ATP para impulsar reacciones tan diversas como el tráfico, el despliegue y el ensamblaje de proteínas; replicación y transcripción; metabolismo celular; movimiento muscular; motilidad celular; y bombeode iones 1-3. Algunas ATPasas son proteínas transmembrana involucradas en el transporte de solutos a través de las membranas, otras son citoplasmáticas y pueden estar asociadas con una membrana biológica como la membrana plasmática o las de los orgánulos.
AAA+ ATPa....
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Protocolo
1. Realizar la reacción de hidrólisis de ATP con la proteína purificada
- Las existencias de preparar todos los reactivos necesarios para la incubación con proteína purificada.
- Preparar tampón 5x HEPES / NaCl / glicerol (HNG) que contiene 100 mM de HEPES pH 8,5, NaCl 65 mM, y 5% de glicerol (u otro tampón de ensayo según el caso).
- Preparar 100 mM de MgCl 2 (u otro metal, si es de metal ATPasa dependiente) en agua.
- Preparar fresca mM ATP 100 en 200 mM Tris Base (no ajuste de pH más) utilizando ATP alta pureza. Alícuota y almacenar el archivo de ATP a -20 ° C durante no más de unas pocas semanas, en forma de ATP se desco....
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Resultados
La actividad in vitro de la ATPasa T2S EPSE puede ser estimulada por copurification de EPSE con el dominio citoplásmico de EPSL (EPSE-cytoEpsL) y la adición de la cardiolipina fosfolípido ácido 12. También es posible determinar el papel de los residuos particulares EPSE en la hidrólisis de ATP mediante la comparación de la actividad de tipo salvaje (WT) a formas variantes de la proteína utilizando este ensayo. Aquí, el efecto de sustituir dos residuos de lisina en el .......
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Discusión
Este es un protocolo general para la medición de la actividad ATPasa in vitro de proteínas purificadas para la caracterización bioquímica. Este método se optimiza fácilmente; por ejemplo, el ajuste de la cantidad de proteína, tampón y composiciones de sal, temperatura, y la variación de la longitud de ensayo y los intervalos (incluyendo el aumento del número total de intervalos) puede mejorar la actividad de la cuantificación. Comercialmente disponibles malaquita reactivos basados en verde son muy se.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer la financiación de una subvención de los Institutos Nacionales de Salud RO1AI049294 (a M. S.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tampón HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Cloruro de sodio | Fisher | BP358-212 | |
| Cloruro de magnesio | Fisher | BP214-500 | |
| Trifosfato de adenosina (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| Placas de 96 pocillos (transparentes, de fondo plano) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Ciencias | BML-AK111 | Reactivo de detección de fosfato preferido. Precaución: irritante. |
| Lector | BioTek Synergy o software Prism | ||
| 5 | GraphPad comparable |
Referencias
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15....
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Reimpresiones y permisos
