Summary
Vi presenterer forbigående transgenesis og genet knockdown i Ciona intestinalis, en chordate søstergruppe til virveldyr, ved hjelp av mikroinjeksjon og electroporation teknikker. Slike metoder lette funksjonell genomforskning i denne enkle virvelløse som har rudimentære kjennetegn ved virveldyr, inkludert ryggstreng og hode sensorisk epitel, og mange ortologer av humane sykdoms forbundet gener.
Introduction
Nylig har genomsekvens og transkribert gen repertoar blir tilgjengelige i en rekke modellorganismer. Bestemme genet funksjonelle koblinger, imidlertid, og hvordan disse tilkoblingene er fastkoblet i DNA for å utføre transkripsjonen aktivitet gjennom embryonale tid og rom, er fortsatt en stor utfordring, spesielt i virveldyr. Kompleksiteten av regulatoriske interaksjoner og kompleksiteten av genomer 1,2, særlig hos virveldyr, tregere effektive funksjonelle analyser, særlig på DNA-nivå in vivo. Faktisk er ingen GRN tiden analysert fra befruktning til finalen, terminalt differensiert tilstand av å utvikle organisme.
Den ascidian C. intestinalis representerer en modellorganisme hvor en slik komplett grn analyser kan være mulig. Den har en udupliserbar genom typisk for virvelløse dyr med lite genet redundans. Virveldyr, i motsetning har gjennomgått to runder med genom duplikasjoner som have generert større genfamiliene og funksjonelle spredning, men også redundans mellom paraloger. De kompakte cis-regulatoriske sekvenser (kontrollenhetene GRNs) av C. intestinalis, og en ufravikelig embryonale avstamning med få celler minner om C. elegans. Videre sin unike fylogenetisk posisjon som en virvelløse søstergruppe til virveldyr innenfor chordatar tillater utviklings observasjon, på celle oppløsning, til formings chordate kroppen plan 3-6.
Hovedsaken som sikrer fremtidig suksess for funksjonell genomforskning i modellorganismer er generering av et stort antall embryoer for kvantitative in vivo forstyrrelser. Utviklingen av mikroinjeksjon teknikk i Ciona egg 7, og muligheten til raskt å få mange forbigående transgene dyr ved in vivo electroporation i hundrevis av Ciona zygotes 8,9 har vært et gjennombrudd i
Protocol
1. Forberedelser for Mikroinjeksjon og Electroporation i Ciona Egg og zygoter
- Forbered 10 L kunstig sjøvann med HEPES (ASWh) for dyrking av embryoer. Løs opp 420 mM NaCl, 9 mm KCl, 10 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 24,5 mM MgCl2 · 6H 2 O, 25,5 mM MgSO4 · 7H 2 O, og 2,15 mM NaHCO3 i dobbelt destillert vann (DDH 2 O) ved omrøring over natten. Tilsett 5 mM HEPES pH 8,0, og kontrollere / regulere pH til 8,0. Oppbevar ASWh ved 4 ° C. Varm opp til 18 ° C og filtrere det med filterpapir før bruk.
- Forbered 20x inaktivert dechorionation løsning: 20% natrium thioglycolate, 1% pronase i ASWh. Lagre 500 ul porsjoner ved -20 ° C, og fortynnet til et sluttvolum på 10 ml ASWh før bruk.
- Forbered 15 til 20 kultur retter for egg / embryoer. Hell smeltet 1% agarose i ASWh til 3,5, 5, 9 eller 15 cm petriskåler, belegg dem med en 1-2 mm tynt lag.La agarose stivne og dekker platene med ASWh. Lager dem ved 4 ° C i 1-2 uker maksimum. Bytt ASWh før bruk.
- Forberede spesielle injeksjon retter.
- Hell et 5-7 mm tykt lag av smeltet 1% agarose i en 5 cm petriskål, og plasser i en form på agarose (for eksempel en glidelås lukke limt til en plastdekkglass) for å fremstille et innsnitt ved størkning av agarose som kan holde eggene. Forbered 4 til 5 injeksjons retter og dekk med ASWh. Oppbevar ved 4 ° C og erstatte med frisk ASWh før bruk. Bruk kun ferske plater for injeksjon (maks en dag gammel).
- Fremstille β-galaktosidase (LacZ) farging buffer: 1 mM MgCl2 · 6H 2 O, 3 mM K 4 [Fe (CN) 6] · 3 H 2 O, 3 mM K 3 [Fe (CN) 6] i fosfatbufret saltvann (PBS) med Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na-HPO 2 4, 2 mM KH 2PO 4, 0,05% Tween). Oppbevares in mørke ved 4 ° C. Forbered LacZ substrat 5-brom-4-klor-3-indolyl ß-D-galaktopyranosid (X-gal, 10 U / ml) i alikvoter på 40 mg / ml i dimetylformamid (DMF) og lagre lager på -20 ° C inntil bruk.
- Sug Pasteur pipetter i springvann vann over natten for å hindre at embryo fester seg.
- Forbered kanyler.
- Sett opp en mikropipette avtrekker på forhold som varme 425, pull 75, hastighet 75 og tid 200 (fra en glødetråd ramp test av 415).
- Trekk 4 til 5 glødeholdig glass kapillærer til å produsere 8 til 10 lange, fine nåler normalt lukket på spissen. Oppbevar nålene på et støvfritt nål boksen, festet til dobbeltsidig tape på en forhøyet støtte, for å unngå å bryte tips og som er praktisk for nål fylling.
MERK: Test innhentet nåler ved å injisere et par egg med grønn vital fargestoff (som beskrevet i kapittel 6) og juster nålen trekke betingelser for å få en spiss form som gjør det mulig for finjustert og repetitive injeksjon som beskrevet i 6.6.
- Forbered injeksjon løsning. Forbered 4 ul av injeksjonsoppløsning, f.eks, bestående av 1 pl 2 mM MO, 2 ul av 10 ug / ul grønn vitale fargestoff og 1 ul DDH 2 O. Legg til en endelig konsentrasjon på 0,05 til 0,5 ug / ul avkortet mRNA eller 20 ng / mL av plasmid-DNA i henhold til den eksperimentelle spørsmålet. Bland godt. Hold på is hvis oppløsningen inneholder mRNA.
2. Innsamling av kjønnsceller
- Dissekere Ciona voksne i en 18 ° C avkjølt embryo rom. Bruke små saks og starte fra den ende som vender mot sifongene på siden av exhaling (kortere) hevert under hvilke egglederen og sædlederén løp.
- Expose egglederen og delikat lage et snitt i egglederen ved hjelp av tuppen av saksen. Slipp utstrømmende eggene direkte inn i en seks-brønns plate som inneholder ASWh ved å trykke forsiktig egglederen med lukkede saks stripping av f.eksgs. Overfør de gjenværende eggene med en Pasteur pipette forhånds skylles med ASWh.
- Innskudd egg fra forskjellige dyr i forskjellige brønner. Observer eggkvalitet under dissekere omfang.
MERK: Velutviklede egg er runde og rosa til svakt gul i fargen. De er omgitt av en ikke-cellulær vitelline pels, chorion som danner et veldefinert perivitelline plass rundt egget. Chorion er assosiert med testcellene på sitt inne og stjerneformede hårsekkceller på sitt utenfor. Egg av lav kvalitet ofte mangler perivitelline plass eller hårsekken celler. De vises mindre runde, mer detaljert eller annen farge. Umodne oocytter er mindre og har en sølv hvit farge. - Skjær sperm duct med saksen og samle konsentrert sperm inn i en 1,5 ml rør ved hjelp av en egen Pasteur pipette. Pool sperm fra forskjellige dyr (minst to) i samme rør. Oppbevares sperm ved 4 ° C i flere dager.
3.befruktning
- Samle spermier og egg ved 18 ° C som beskrevet i trinn 2.
- Aktiver sperm.
- Fremstille en ml ASWh i et 1,5 ml rør og blandes med 50 pl 1 M Tris pH 9,5. Deretter legger 20 ul konsentrert sæd og forsiktig blandes ved å snu røret.
- Kontroller sperm aktivering i en dråpe sæd plasseres på en cover av en liten petriskål eller et objektglass og observere under dissekere omfang. De sædcellene skal svømme febrilsk.
- Legg 100-200 pl av den aktiverte sperm løsning til hver brønn av egg (inneholdende mellom 100 og 1000 egg), bland godt ved å pipettere opp og ned, slik at eggene blir flyter i mediet. Vent i 10 minutter uten å flytte embryoene.
4. Dechorionation av egg og embryoer
- Fortynn en 500 mL delmengde av 20x dechorionation løsning på 10 ml i ASWh. Aktiver dechorionation løsningen ved å tilsette dråpevis 200 ul 2.5 M NaOH til 10 ml 1x dechorionation løsning. En melkeaktig bunnfall vil dannes. Bland forsiktig ved å vende røret.
- Samle egg eller zygotes (etter 10 min vente i trinn 3.3) inn i glassrørene ved hjelp av en Pasteur pipette. Pool eggene fra 2 til 3 dyr i en tube (ca. 1000-5000 egg / rør). Sediment med en hånd sentrifuge ved spinning med høy hastighet (1200 xg) i omtrent 20 sekunder for å danne et embryo pellet på bunnen av røret. Sakte stoppe sentrifugen og fjern ASWh med en Pasteur pipette.
- Tilsett 4 ml aktivert dechorionation løsning til de pelleterte egg / zygotes i hvert rør. Suspendere egg / zygotes ved forsiktig pipettering dem opp og ned ved hjelp av en vannbehandlet springen Pasteur pipette toppet med en liten gummi pære. Løsningen bør slå gulaktig etter 1-3 min.
- Flg dechorionation ved å fjerne en liten porsjon av dechorionating egg / zygote suspensjon ved hjelp av Pasteur-pipette. Deponere en dråpe på et lysbilde og observere under dissekere shåndtere. Hold pipettering egg / zygotes opp og ned og sjekke hvert 20-30 sek.
MERK: Første hårsekkceller løsne, så chorion blir gul og ugjennomsiktig, og til slutt det løsner fra zygotes. Rosa dechorionated egg / zygotes vil synke til bunnen av glassrøret. Den dechorionation bør ikke ta mer enn maks. 5 min. - Fyll røret med ASWh gang 50% av egg / zygotes er dechorionated.
MERK: Veldig forsiktig sentrifuge (8 xg) i ca 10-15 sek tilsvarer en svært lav hastighet akkurat nok til å sedimentere dechorionated egg / embryoer. Sakte stanse sentrifugen som å ikke forstyrre pelleten av egg / zygotes ved bunnen av røret. - Fjern nesten all væsken fra glassrør inkludert flytende materiale med ufullstendig dechorionated egg / zygotes og erstatte med ASWh. Langsomt pipettér opp og ned for å vaske og forsiktig sentrifuge igjen som i trinn 4.2. Alternativt vente på zygotes å slå seg ned av tyngdekraften. Vask igjen til det ikke chorion rusk er left.
- Overfør egg / zygotes til ferskt skylt kultur retter ved hjelp av en Pasteur pipette. Hold zygotes (ikke egg) ved lav tetthet (rundt 200 embryoer pr 10 cm tallerken) for å unngå deres henger sammen. Kultur embryoene til det ønskede stadium ved temperaturer mellom 13 og 20 ° C. Alternativt electroporate de zygotes (Trinn 5) eller injisere ubefruktede egg (trinn 6).
5. Electroporation
- Befrukte eggene og dechorionate de zygotes ved 18 ° C som i §§ 3 og 4. Gi mellom 50 og 400 egg per electroporation prøve.
- Forbered 50 pl plasmid DNA i en 1,5 ml tube (maks. 100 ug plasmid DNA i 50 ul DDH 2 O) og tilsett 200 mL 0,95 M mannitol. Bland godt ved virvling.
- Dispatch og gravitasjon sedimentere dechorionated zygotes i silikoniserte 1,5 ml rør. Fjern det ASWh ned til 100 ul merket på røret.
- Fortsett, etter hverandre, for hver zygote rør som følger: leggDNA / mannitol løsning ved hjelp av en Pasteur pipette. Bland forsiktig med zygotes og umiddelbart ta opp DNA / mannitol / zygote suspensjon og overføring til en 4 mm electroporation kyvette.
- Plasser kuvetten umiddelbart inn i electroporation holderen og gi en enkelt puls med 16 msek ved 50 V.
- Fjern de zygotes fra kyvetten ved hjelp av samme Pasteur pipette og spre dem ut på en kulturskål inneholdende frisk og filtrert ASWh. Pipetter zygotes før de begynner å spalte rundt en time etter befruktning (HPF) ved 18 ° C.
- Skyll pipetten mellom prøvene i et beger med ASWh.
- Kultur de zygotes ved 15-20 ° C ved lav nok tetthet på rundt 200 embryoer pr 10 cm tallerken for å unngå deres henger sammen.
6. Mikroinjeksjon
- Forbered Dechorionated egg for injeksjon.
- Dechorionate eggene hver for seg, fra 2-4 dyr, som beskrevet i kapittel 4. Hold ubefruktet og dechorionated eGGS i egne små agaroseovertrukne kultur retter. Vask egg flere ganger i rettene for å fjerne rusk.
- Test gjødsle små grupper av de dechorionated egg (rundt 50) fra hver enkelt. Bruk en separat 5 cm fatet for hvert parti og bruke 2 mL aktivert sperm (trinn 3.2). Bland godt ved å svinge rettene og spredt ut eggene i fatet ved å flytte rettene sidelengs. Hold sperm og egg sammen i ca 10 min uten å flytte.
- Eliminer maksimalt sperm som følger: overføre befruktede egg til en frisk kultur tallerken eller skyll to ganger med frisk ASWh. La de spalte embryoene uforstyrret fram til 32-cellestadiet (ved 18 ° C i ca 3 timer etter befruktning). Velg egg fra de beste utviklings batch (best andel av befruktning og mest vanlig cleavage mønster) for mikroinjeksjon.
- Sett opp kanyler.
- Etterfylling 4 kanyler i en vertikal stilling for å tillate gravitasjons flow langs filamentet. Innskudd 0,5 mL injeksjon løsning (trinn 1.8) som inneholder grønn vital fargestoff på baksiden slutten av nålene som er plassert nålespissen ned. Vent for væsken til å fylle nålespissen på bunnen.
- Flytt nålene horisontalt og etterfylle dem med mineralolje med en fin og lang metall eller pipette plast. Sakte overlappe injeksjonsoppløsningen med mineralolje utvise alle luftbobler mens fylle nålen.
- Oppsett mikromanipluatoren i en 18 ° C Cooled Room.
- Koble plastrør av nåleholderen til en 10 ml glassprøyte fylt med mineralolje. Fylle slangen og nålen holder med olje og fjerne eventuelle luftbobler.
- Sett nålen i nåleholderen og plassere holderen på micromanipulator.
- Juster nåleholderen bevegelse langs en rett linje i en vinkel på 45 ° i forhold til overflaten.
- Orientere dechorionated egg langs agarose innrykk av injeksjonen parabolen slik at eggene kan injiseres én etter én under disseksjon mikroskop.
- Brekke nålespissen, om nødvendig, ved å skyve nålen mot agarose eller mot et stykke glass dekkglass plassert på agarose. Litt press sprøyten knappen for å bekrefte at nålespissen er åpne (grønne nål innholdet vil utvise).
- Injisere eggene ubefruktet en etter en ved å først innføre nålen inn i egget og litt aspirering for å bryte egg membranen, etterfulgt av injeksjon. Injiser grønn injeksjonsoppløsningen inn i midten av egget til maksimalt 1/3 av cellediameteren. (Dette tilsvarer ca. 30 pl for et egg diameter på 140 um).
- Overfør de injiserte ubefruktede egg til en frisk kultur tallerken og inkuber dem ved 15-18 ° C før befruktning.
- Gjødsle de injiserte egg med friskt aktivert sperm som i test befruktninger (trinn 6.1.2). Eliminatea maksimalt sperm ved å overføre zygotes til en frisk kultur parabolen. Spre ut embryoene og ikke forstyrre dem under cleavage stadier (opp til 32-cellestadiet).
- Kultur embryoene til ønsket trinnet ved en temperatur mellom 13 og 20 ° C.
- Samle embryoer ved å svinge dem inn i midten av platen og overføre dem til silikoniserte 1,5 ml rør. Fix og beis, eller monter (trinn 7 og 8).
- Sammenlign innhentet fenotyper til kontroll injisert embryoer.
MERK: Sprøyt en andre, ikke-overlappende MO som er rettet mot den samme karakter å få identiske fenotyper. Redde spesifikke MO fenotype (er) med en modifisert mRNA som koder for protein av interesse, men som ikke er anerkjent av Mos. Sprøyt en kontroll MO som gir ingen fenotype.
7. LacZ Farging
- Samle embryoene på et ønsket tidspunkt i silikoniserte 1,5 ml rør og fikse dem i 0,2% glutaraldehyd i en ml ASWh for 1530 min maks.
- Vask 2x 10 min med 1 ml 1x PBT.
- Skyll en gang i 500 mL LacZ flekker buffer. Erstatte med X-Gal substrat tilsatt 1 ml farging buffer (bruke 10 ul / ml 40 mg / ml X-Gal lager). Overfør embryoene i en 12 brønns plate for bedre observasjon av farging.
- Inkuber i mørket. Variere inkubasjon fra 0,5 timer til over natten ved 4 ° C, ved romtemperatur eller ved 37 ° C, avhengig av styrken av driveren uttrykke LacZ.
- Vask embryoene opp til 4 ganger i 1 ml 1X PBT for å fjerne flekker buffer.
- Post-fix for 10 minutter ved romtemperatur med 2% paraformaldehyde (PFA) i 1 ml 1x PBT eller 0,2% glutaraldehyd i en ml 1x PBT for tolkning og visualisering av de fargede embryoer.
8. Montering av fluorescerende merkede Wmbryos
- Fix embryoene av en ønsket utviklingsstadiet i 20 minutter i 2% PFA i en ml ASWh.
- Vask embryoene 2x i 1 ml 1x PBT. Unngå lys exposure ved å holde embryoene i mørke forhold.
- Overfør opptil 50 embryoene ett lysbilde. Fjern maksimalt PBT først med en pipette og nøye med et papirhåndkle.
- Legg 20-25 mL montering medium.
- Legg et dekkglass ved å plassere den i en vinkel (fra den ene siden først) og sakte senke den med en spiss gjenstand (nål, pinsett, pipette) unngår bobler til prøven er dekket. Fest dekk i kantene ved hjelp av prikker av en gjennomsiktig neglelakk.
- Tett hele dekkglass med en neglelakk etter tørking. Oppbevares i mørke ved -20 ° C.
Representative Results
Mikroinjeksjon for gennettverk studier
Embryoer av ascidian Ciona intestinalis er godt egnet for genet funksjonelle eller gen regulatoriske studier ved celle avstamning nivå og med mobilnettet oppløsning. mRNA, Mos eller etiketter kan microinjected inn i ubefruktet egg eller i individuelle blastomeres følgende befruktning. MO mediert genet knockdown hjelp av mikroinjeksjon teknikk er beskrevet i trinn 6. Mos spesifikt mål mRNA av utvalgte gener og hindre deres oversettelse til protein. MO mediert tap-av-funksjon (LOF) utviklings gener forandrer uttrykk for et bredt spekter av nedstrømsgener, samlet avslører et glimt inn i den embryonale GRN 10. Slike analyser i Ciona gitt den første hele embryoet regulatoriske blåkopi i en metazoan 11. Figur 1 viser et eksempel på hvordan microinjectividere ble benyttet for å studere den oppstrøms regulering av ekspresjonen av den konserverte Ci -Myelin transkripsjonsfaktor (Ci -MYT) ved gastrulastadiet av Ciona embryoer. Overvåket ved in situ hybridisering (ISH), endogen uttrykk (Figur 1a, skjematisert i Figur 1a ') er observert i de seks-rad nevrale plate forløpere, av særlig hjernen (rader III / IV, i rødt) og ryggmargen ( rad jeg, i grønt). I tillegg ble Ci -MYT oppstrøms regulering analysert ved hjelp av MO injeksjon målretting flere faktorer som er uttrykt i, eller i tilknytning til nevrale forløpere før Ci -MYT uttrykk innsett (figur 1b-g). MO knockdown av tidlig fosterdød faktorer, slik som den gaffelhodeboksen Aa (Foxá-a) transkripsjonsfaktor og fibroblastvekstfaktor 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (Figur 1b eller 1c, henholdsvis) eliminerer samlet Ci -MYT uttrykk. Andre transkripsjonsfaktorerbare delvis påvirke Ci -MYT uttrykk som resulterer i MO-mediert nedregulering i en undergruppe av hjerne forløpere (blå piler i figur 1d, f og g). Motsatt er Ci -MYT uttrykk ectopically aktivert ved nedregulering av Nodal (figur 1e, røde piler), noe som tyder på at Nodal normalt undertrykker Ci -MYT uttrykk i disse side nerve ledningen forløpere.
Electroporation for effektiv genet funksjonelle og enhancer studier
Elektroporering av plasmid-DNA inn i Ciona zygotes er en effektiv metode for forbigående transgenesis og etterfølgende observasjon av fenotypiske endringer in vivo. I motsetning til mikroinjeksjon av mRNA, tillater elektroporering for vevsspesifikk overekspresjon, hvori genet kodende regioner (ORF, åpne leserammer) blir uttrykt under kontrollvev bestemte drivere. Disse normalt utgjøre cis-regulatoriske regioner av kjente gener (for eksempel brachyury Enhancer for uttrykk i ryggstreng forløpere 8). Motsatt er electroporation instrumental for effektiv analyse av nye regulatoriske regioner der reporter gener (LacZ eller grønt fluorescerende protein, GFP) avsløre sin aktivitet in vivo. Den arbeidsflyt for identifisering og påfølgende elektroporering mediert analyse av en slik ny regulatoriske område (for Ci -MYT) er vist i figur 2.
Et stort repertoar av Ciona samfunnet data, lett tilgjengelig i ascidian bestemte genomlesere 12,13, som Ascidian Nettverk for In situ Expression og embryologiske Data (anis) 23, er inspisert for i silico identifisering av regulatoriske regioner (Figur 2A). Etterfølgende polymerasekjedereaksjon (PCR) basert kloning av disse områder i ekspresjonsvektorer tillater elektroporering mediert testing in vivo. (Figur 2B). Genomet browser screen-shot i Figur 2A viser oppstrøms regionen KH transkripsjon modell for Ci -MYT (første tre eksoner, i oransje, og to introner er synlige). Ulike genom nettleser spor kommentere funksjonelle genomdata spådd for denne regionen, slik som kromatin immunoprecipitation (chip) data 14 (her vist for ZicL, Ci -zinc finger av lillehjernen L), sekvens bevaring mellom to beslektede Ciona arter 15,24 eller nucleosome belegg 16,17 (fra topp til bunn i figur 2A). Vanligvis er exonic protein-kodende områder sterkt konservert (justering spor i figur 2A). Ekstra høy bevarings topper vises i ikke-kodende regioner oppstrøms og i første intron. To av disse er spådd til å bli nucleosome fri enccording til en sekvens basert algoritme 16,17 (røde rammer i figur 2A) tyder tilgjengelighet til transkripsjonsfaktorer. Faktisk er Chip-on-chip signaler 14 for Ci -ZicL transkripsjonsfaktor bindende (grønne søyler i figur 2A) beriket i disse to konserverte regioner. Videre bruker et grensesnitt 25 som søker etter potensielle transkripsjonsfaktor bindingsseter, identifiserte vi ZIC områder ligger innenfor genomsekvenser preget av Ci -ZicL Chip klynger (oransje piler og sekvenser med streket ZIC-core, figur 2A). Bindingen av Ci -ZicL transkripsjonsfaktoren i konservert og forutsigbart nucleosome frie regulerende områder ifølge Ci -MYT er forenlig med nedregulering av Ci -MYT ekspresjon observert i MO-injeksjon medierte knockdown eksperimenter som målretter ZicL (figur 1d).
etter avskrekkegruvedrift potensielle cis-regulatoriske regioner i silico for Ci -MYT uttrykk, disse er PCR forsterket fra Ciona genomisk DNA og innsatt ved rekombinasjon kloning i LacZ reporter plasmider 19. Konstruksjonene blir så elektroporert inn i befruktede egg Ciona (figur 2B) og analysert med hensyn på deres aktivitet ved LacZ-farging (figur 3).
Figur 3 viser at ved en slik in silico måte var det mulig å identifisere to separate cis-regulatoriske sekvenser som rekapitulere Ci -MYT mRNA-ekspresjon domener (sammenlign figur 1a). Vanligvis forbigående transgene embryoer electroporated med plasmid DNA viser mosaikk uttrykk i de cellene bare som har innarbeidet DNA. Mosaic LacZ uttrykk er dermed drevet av pmyt-R3 og kan finnes i alle forløpere som også uttrykker Ci (figur 3a, b, lilla og røde pilen hoder, henholdsvis). I motsetning til dette er pmyt-R5 aktiv bare i bakre (rad I) neurale plateforløpere og starter på den senere neurula stadium (figur 3c, røde pilspisser). De to regionene dermed kode to separate romlige og tidsmessige aspekter av Ci-myt genregulering. Interessant, både regulatoriske regioner også beis flere forløpere ikke sett i ISH, særlig i fremre og laterale nevrale plate og i muskel (figur 3a, b, rosa, hvit og gule pilen hoder, henholdsvis). En slik bredere uttrykk kan peke til undertrykkende elementer som ikke finnes i de isolerte regulatoriske fragmenter (for eksempel for Nodal som undertrykker lateral nevrale skjebne, se figur 1e) eller lave nivåer oppdages med akkumulereLacZ enzymatisk signal.
I tillegg til enhancer studier, elektroporering i Ciona forenkler også de funksjonelle analyser av Ciona koding gener ved deres overekspresjon. En stor samling av Ciona full lengde ORF er tilgjengelig for samfunnet, og ble videre kommentert for menneske ortologer, inkludert sykdomsassosierte gener 18. Enkeltgener eller grupper av gener fra denne rekombinasjon-kloning kompatible fullstendig ORF-cDNA-bibliotek (figur 2B) kan lett overføres til mottaker vektorer inneholdende egnede drivere for å bli uttrykt i embryoer. Resulterende uttrykk kloner kan videre være co-elektroporert med cis-regulatoriske reporter-konstruksjonene for å teste deres antatte rolle i aktiveringen enhancer. Figur 2B illustrerer isoleringen av fullstendige ORF kloner for transkripsjonsfaktorene Ci -ZicL og Ci- GATAa og deres recombination inn tilpasset destinasjons vektorer som kan inneholde translasjonsforskning koder 19 (f.eks grønn fluorescerende Venus-eller viral hemagglutinin (HA) -tag) og en vev bestemt driver som Friend Of Gata reguleringsområdet (pfog driver) for tidlig pan-ectodermal uttrykk 15 anvendt i denne studien. Effekten av Ci -ZicL overekspresjon i ectodermal og neuroectodermal vev ble analysert ved co-electroporation av pmyt-R3> LacZ og pmyt-R5> LacZ journalister (figur 3b ', b' 'og c', c '', henholdsvis). Våre electroporation analyser tyder på at Ci -ZicL kan aktivere Ci -MYT uttrykk gjennom pmyt-R3 og pmyt-R5 Enhancer regioner som både reporter konstruerer viste ektopisk LacZ uttrykk i ectodermal regioner (grønne piler i figur 3b ', b' 'og c &# 39;, c '',). Som vist i figur 3d, elektroporering av plasmid-DNA i flere hundre Ciona egg muliggjør statistisk relevant kvantifisering av endringer uttrykk, illustrert for ektopisk pmyt-R3> LacZ uttrykk på konsentrasjonsavhengig, pan-ectodermal Ci -ZicL uttrykk.
Elektroporering for in vivo subcellulære lokalisering
Figur 4 viser subcellulære lokalisering av merket transkripsjonsfaktorer når det uttrykkes ved elektroporering i ectodermal blastomeres hjelp tilpasset uttrykk konstruerer (skjematiserte i figur 2B). Ved C-terminalt tagging transkripsjonsfaktorer (for eksempel Ci -GATAa) med en Venus tag (figur 4b) eller en HA-tag (figur 4c) og overekspresjon dem i ectodermal vev (pfog) Kan vi observere at in vivo, "Ci -GATAa er hovedsakelig lokalisert til kjerner, som forventet for en transkripsjonsfaktor, mens Venus uttrykk er allestedsnærværende, inkludert cytoplasma. Lignende eksperimenter kan utføres for å studere dynamikken i subcellulære lokalisering over tid, til individuelt eller kombinasjoner av transkripsjonsfaktorer, eventuelt å avsløre ko-lokalisering med forskjellige koder.
Figur 1:. Vurdere Ci -MYT regulering av mikroinjeksjon i Ciona egg Ci -MYT mRNA uttrykk i WT og Morpholino (MO) injisert embryoer. (A) WT uttrykk mønster av Ci -MYT i det nevrale plate. (A ') Skjematisk fremstilling av farget forløpere i det neurale platen (NP). Rad I / II: posterior neural skjebne; rad III / IV: anterior neural skjebne; rad V / VI: palp skjebne. (
Figur 2: Arbeidsflyt for i silico etter forsterker regioner og rekombinasjon kloning for transient transgenesis ved elektroporering i Ciona embryoer (A) Et øyeblikksbilde fra anisfrø 23 ASCI.dian genom leseren identifiserer oppstrøms regulatoriske sekvenser av Ci - myt. Røde rammer markere to potensielle cis-regulatoriske regioner, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) og pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) som ble valgt ut for analyse ved elektroporering. Navn på banene: ZicL probes: SMD-on-Chip data 14; KH2012 transkripsjoner: Ciona intestinalis transkripsjon modeller; Alignment Score Cs / Ci LastZ: sekvens bevaring mellom Ciona savignyi (Cs) / Ciona intestinalis (Ci) 15,24; . Segal 2006 spådde nucleosome belegg versjon 1: chick trent beregningsalgoritme ved Segal et al, 2006 16 påføres Ci som i Khoueiry et al, 2010 17 Grønne streker:.. Ci -ZicL ChIP topper 14; oransje piler: spådd ZIC områder; GCTG: core ZIC bindingssete. (B) Skjema for generering av overekspresjon konstruksjoner fra en cionen full lengde ORF cDNA bibliotek, saman inn destinasjon vektorer som inneholder vev spesifikke drivere (pfog) og protein tags senere co-electroporated med reporter konstruksjoner (for eksempel pmyt-R3> LacZ eller pmyt-R5> LacZ) for in vivo avlesning Ci. - MYT, Ci -Myelin transkripsjonsfaktor, Ci -ZicL, Ci -Zinc finger av lillehjernen L transkripsjonsfaktor;. pfog, regulatoriske regionen Ci -Friend av GATA klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: electroporated Ciona embryoer som viser Ci -ZicL induserbar rom-tid-cis -regulation av Ci -MYT LacZ farget embryoer på mid-gastrul.en (mg) / sen-gastrula (LG) eller tidlig neurula (eN) scenen vises som ble co-electroporated med enten pmyt-R3> LacZ eller pmyt-R5> LacZ og en kontroll konstruksjon (pfog> mCherry) eller pfog> ZicL. Den pfog driver 19 formidler ektopisk (pan-dyr) ZicL uttrykk i ektoderm og neuroectoderm og forårsaker ektopisk LacZ flekken i disse cellene. (A) pmyt-R3 LacZ aktivitet i mg / LG stadium embryoer (små pilspisser, venstre panel) eller i tilsvarende farget skjematiske territorier (blå sirkler, panel til høyre); vegetal view (vg). Rad I / II: posterior neural skjebne; Row III / IV: anterior neural skjebne; Row V / VI: palp skjebne. (B) pmyt-R3 aktivitet på eget stadier i vev som i en. (B ') Ektopisk pmyt-R3 aktivitet på Ci -ZicL co-electroporation er angitt med grønne pilspisser. (B '') Samme embryoer som i b ', orientert dyr stang opp (en). (
Figur 4:. Differential subcellulære lokalisering av proteiner ved electroporation Lokalisering av Venus-merket eller Hemagglutinin- (HA) -tagged proteiner overuttrykt i ectodermal celler ved hjelp av pfog driver 19. (A - c) DIC bilder. (A ', b') tilhørende fluorescens bilder. (C ') Tilsvarende fluorescens bilde på immun histologisk merking med TRITC. Scale bar = 100 mikrometer refererer til alle bildene. DIC, Differential interferens kontrast. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det er to hovedteknikker for å generere transgene embryoer Ciona: mikroinjeksjon av RNA eller DNA og elektroporering av DNA. Disse teknikkene for genet forstyrrelse i Ciona embryoer ble først brukt på 1990-tallet 7,8 og fra da av suksessivt forbedret, og nå benyttes i Ciona (og andre ascidian slekter) 20 på verdensbasis.
Kritiske trinn i protokollen
Vellykket transgenesis inn i Ciona kjønnsceller som er lett samles fra voksne dyr, avhenger av en rekke kritiske faktorer. Kvaliteten på kjønnsceller er avhengig av gytesesongen (vanligvis fra mai til desember i Nord-Atlanteren, endring med vanntemperatur og oksygentilførsel), på sjøen vannkvaliteten i akvarier (på riktig saltinnhold, voksne holde seg frisk i 2-4 uker) , og til slutt på korrekt håndtering av kjønnsceller ved ekstraksjon fra de voksne, som beskrevet nedenfor for de ulike trinnene iprotokoll.
Under forberedelse trinn, vil inkubasjon Pasteur pipetter med vann fra springen hindre embryo fester seg og sjøvann pre-inkubasjon av agarose-belagt petriskåler vil fjerne giftige stoffer fra agarose. Generelt kan retter fremstilles opp til 2 uker før bruk, lagret ved 4 ° C for å unngå bakterievekst og skyllet ferskt før bruk. En dag gammel, små retter synes best for injeksjoner.
Effektivitet og lengden på dechorionation er et viktig skritt i protokollen som langvarig behandling av egg / embryo vil skade utviklingen. Grundige forberedelser (ingen risting) og korrekt lagring (ved 4 ° C i opp til en uke) bevare kvaliteten på dechorionation løsning. Proteaser i oppløsningen taper effektivitet hvis enten blandet altfor voldsomt ved fremstillingen eller over tid, særlig hvis de holdes ved romtemperatur i lengre timer / dager. Vi har optimalisert denne kritiske steg med ferske dechorionation løsning beleiligberedt fra frosne prøver av 20x stamløsning.
Riktig håndtering av skjøre dechorionated egg / embryoer er viktig og klipping eller knivstikking av embryoer under pipettering vil være skadelig. Ved pipettering, blir embryoer opprettholdes så mye som mulig i suspensjonen (ved forsiktig å "blåse" væske til å virvle dem opp, etterfulgt av jevn, men rask pipettering), samtidig som holder glasset pipetten i vertikal i stedet for vannrett stilling. Slike omsorg gjelder alle pipetteringstrinn for vasking, resuspensjon og overføring av egg / embryoer inn og ut av rør, kyvetter eller plater, før og etter fiksering. Ved fiksering, bør forsiktighet også tas til separate pipetteringsutstyr for live kontra faste embryo for å unngå toksisitet fra restene av fiksativ.
Mikroinjeksjon er ganske vanskelig i Ciona egg / embryoer på grunn av sin lille størrelse og robusthet i vitelline membranen og kritisk avhengig av en optimalisert tip størrelsekanylen, en perfekt vinkel injeksjon (nål bevegelse i én linje, langs radius egg) og en finstemt, manuell bryte av vitelline membran (ved suging før aspirasjon til injeksjon). Det siste er bare mulig dersom luftbobler blir fullstendig eliminert fra injeksjonsrøret som inneholder mineralolje for å jevne suge / injeksjonstrykket. I tillegg vil de minste biter av støv eller egg rusk tette nålen, og er lett unngås ved rene arbeidsforhold og skylle trinn for egg før overføring på injeksjons fatet. Post injeksjon, vil overføring av egg på ferske retter unngå toksiske effekter av døde fostre som ikke har overlevd injeksjonsprosedyren.
Feilsøking
Potensielle problemer i prosedyren kan rettes ved følgende løsninger. Lave befruktning prisene kan oppstå fra utilstrekkelig sperm aktivisering, lav egg renslighet eller store befruktning volumer. Bruk freshly samlet og mindre utvannet sperm. Kontroller sperm bevegelse ved aktivering. Vask egg med ASWh før befruktning som beskrevet i trinn 4.2. Redusere vannvolumet og redusere mengden av egg per befruktning tallerken / brønn. Miste embryoene i løpet av fremstillingsfremgangsmåten kan unngås ved å tilsette en dråpe av dechorionation løsning til mer effektivt å sentrifugere ned undechorionated egg / embryoer. Dechorionation tid skal være optimalisert som delvis dechorionated egg vil ikke sediment og langvarig dechorionation er giftig, forårsaker embryoene til å eksplodere.
Asynkron utvikling kan oppstå fra rest sperm frigjøres under disseksjon. Hold rognpartier adskilt fra forskjellige dyr for å unngå ukontrollert kryssbefruktning. Unormal utvikling kan ha ulike årsaker. Ved begynnelsen og ved slutten av sesongen, etter å holde embryoet fra forskjellige individer separert, de beste partier kan velges. Unngå perturbing embryoene for10 min som følger befruktning for å unngå å forstyrre deres ooplasmic segregering. Pass på at embryoene ikke begynner å dele mens du blir overført som pipettering skiller søster blastomeres og resultater i delvis embryoer. Bruk mindre sperm for dechorionated egg for å unngå polyspermy. Bruk nylagde men skylte agarose retter. Sørg for at pipettering enheten er fiksativ gratis. Hold kontroll embryoer som ikke ble dechorionated og ikke electroporated å oppdage hvor trinnet utvikling ble avbrutt. Supplement embryoene med antibiotika hvis forurensning og nedbrytning oppstår.
Hvis injeksjonen enheten har "tett", kanylen åpning kan verifiseres ved å utvise noen av sine farget innhold. Tilstopping materiale kan tørkes av ved forsiktig å dra nålespissen gjennom agarose. Luftbobler i injeksjonsrøret og / eller nål bør fjernes. Bytt nål for bedre kontroll av injeksjonsvolumet som needle spissen kan brekke eller tette sammen injeksjon. Skyll eggene og legg dem i en ren injeksjon rett hvis rusk har samlet seg i retten. Sentrifuger injeksjonsoppløsningen før fylling friske nåler for å sedimentere eventuelle små partikler eller krystaller. Også nyttig praktiserer injeksjon med vital fargestoff. Kontroller injeksjonsteknikk ved gjødsling injisert og ikke-injisert egg. Til slutt, rådgivning med en erfaren kollega kan være nyttig for å forbedre injeksjonsteknikk.
For å kontrollere for off-target effekter en andre ikke-overlappende MO og redning med en modifisert mRNA som ikke er anerkjent av MOS kan trofast utelukke uspesifikke fenotypiske effekter i Ciona.
Mikroinjeksjon: betydning og begrensninger
Mikroinjeksjon i Ciona ble benyttet til å generere den første blåkopi for en hel embryo gennettverk (GRN) i en chordate 11. Men til tross for en slik remarkable prestasjon, mikroinjeksjon i Ciona embryoer har begrensninger på grunn av den relativt lille størrelsen (0,14 mm i diameter) av Ciona egg. Sammenlignet med de andre chordate arter hvor fremmed DNA / mRNA er innført av microinjections, Ciona egg er relativt vanskelig å håndtere og frekvensen av injisert Ciona embryoer per eksperiment er fortsatt lav (i gjennomsnitt 30 til 50 embryoer per eksperiment), som hindrer kvantitative analyser. Likevel, for forstyrrende faktorer hos mor i Ciona, mikroinjeksjon av Mos er metoden for valg også for å studere deres engasjement i zygotiske utbruddet av utviklingen fra 16 til 32 celle iscenesetter 15. I tillegg er det mulig, skjønt mye vanskeligere å microinject individuelle blastomeres opp til 16-32 cellestadiet. Til slutt gjenstår mikroinjeksjon den mest effektive metode for generering av transgene embryoer (ved mRNA eller DNA-injeksjon) i andre enn Ciona ascidian art, hvor det fullt ut optimalisering avZed electroporation protokoller ikke eksisterer.
Electroporation: betydning og begrensninger
For å overvinne den lave tall og andre begrensninger av mikroinjeksjon, har det meste av Ciona samfunnet brukt electroporation av plasmid DNA siden den ble utviklet og utgitt som en optimalisert og standardisert protokoll av Zeller et al. I 2004 9. Faktisk tusenvis av transgene Ciona embryoer kan genereres i løpet av en time med opp til 500 embryoer samtidig elektroporerte i en kuvette med en enkelt 50 V puls med 16 msek. Tilnærmingen til å generere massive antall transgene embryoer er fremdeles unik blant chordate modellorganismer. Dette hadde ført Ciona å bli raskt anerkjent som en kraftig modellsystem for å utføre in vivo analyser av potensielle cis-regulatoriske regioner og mobil / subcellulære lokalisering, som eksemplifisert her.
selv electroporatipå i Ciona zygotes har fundamentalt revolusjonert chordate GRN forskningsfeltet, står teknikken likevel noen begrensninger. Først blir plasmider forbigående føres inn i Ciona embryoer, og er mest sannsynlig arves som ekstrakromosomale matriser, slik at stabiliteten av elektroporert plasmid DNA spekulative. Videre er det meget vanskelig, kanskje til og med umulig, å kontrollere kopier av elektroporerte plasmider som vil bli tatt opp pr zygote, noe som resulterer i fenotypiske svingninger. Et ytterligere problem som gjør det vanskelig å tolke electroporation utfall er et fenomen som vi kaller mosaicism. Elektroporert plasmid DNA kan bli tatt opp ved forskjellige posisjoner av en celle-trinns fosteret; som bestemmer hvilke og hvor mange fjerdedeler av zygote vil motta plasmid bli arvet av kommer blastomeres. Slike variasjoner klart gjøre tolkningen av kvantitative virkninger vanskeligere. Men de fleste problemer som kommer med electroporasjon variabilitet er løst ved en passende mengde av biologiske prøver, med telling og statistikk over LacZ (eller GFP)-positive celler, som er lett oppnåelig i en enkelt sats.
Allsidighet og potensialet for electroporation for genteknologi
Electroporation slutt åpner for mid-throughput screening av potensielle cis-regulatoriske regioner og kvantitative analyser av gen-funksjon gang klonet inn reporter eller uttrykk plasmider. På grunn av den kompakte Ciona genomet, identifisering og kloning av potensielle regulatoriske regioner er ganske grei tre. En strategi for bruk av det vell av samfunnet data er vist i figur 2A. Kloning av reporter og genet som koder plasmider lettes ytterligere ved generering av Ciona tilpasset, GATEWAY kompatible vektor suiter 19 og en kompatibel full lengde ORF bibliotek 18. Begge verktøyene er tilgjengelige for samfunnet ogmuliggjøre effektiv, restriksjonsenzym-fri rekombinasjon av regulatoriske drivere og kodende områder, som vist i figur 2B.
I de senere årene, ble elektroporering vellykket tilpasset for å oppnå vev målrettet genmanipulering med plasmider som uttrykker genet redigeringsverktøy som de CRISPR / Cas9 komponenter under kontroll av vev spesifikke drivere 21,22. Slike tilnærminger vil raskt fremme vår forståelse av dynamikken i GRNs og potensielt konserverte signalmekanismer, inkludert transkripsjonsfaktorer koder involvert i vev dannelse og trinnvis exit fra pluripotency. Videre vil vev spesifikke taps eller få-av-funksjon tilnærminger (ved CRISPR / Cas9 eller ved overekspresjon) ved hjelp av electroporation være medvirkende til å studere Ciona ortologer menneskesykdomsassosierte gener. Faktisk, kataloger for Ciona ortologer menneskelige sykdomsgener og deres fulle lengde ORF koding kloner er lett tilgjengele for analyse i Ciona en 8. På grunn av genomet brede duplikasjoner i virveldyr, de fleste menneskelige gener har funksjonelt overflødige paraloger som vanskelig analyser av gen-funksjon 1. Ciona være et enklere system med den typiske chordate vev arrangement hos larver skal avdekke grunnleggende roller i slike viktige, ofte funksjonelt konserverte gener.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab with constant temp. (~18 °C) | For embryo work | ||
| Ciona intestinalis adults | UPMC - Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
| KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
| Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
| Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
| Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
| Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
| Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1 M pH 9.5, for sperm activation |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12 hr |
| Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
| Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
| Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
| Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
| X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
| K4Fe(CN)6•3H2O | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
| Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
| Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
| Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0 mm O.D. x 0.78 mm I.D., containing filament, for microinjection |
| Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
| Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
| All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10 ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
| Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5 mM | |
| Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
| Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
| Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
| Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 | |
| anti-HA tag antibody | abcam | ab9110 | for Immunofluorescence, use 1:400 in 3% BSA/PBT |
| TRITC goat anti-rabbit antibody | Jackson | 111-025-144 | for Immunofluorescence, use 1:300 in 3% BSA/PBT |
References
- Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).
- Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).
- Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).
- Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).
- Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux's Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).
- Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124 (3), 589-602 (1997).
- Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).
- Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).
- Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).
- Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).
- Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).
- Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
- Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).
- Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).
- Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2 (9), e916 (2007).
- Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).
- Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).
- Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).
- ANISEED, Free Software Foundation Inc.,. , Available from: http://www.aniseed.cnrs.fr/v3 (2007).
- VISTA, 1997-2013 The Regents of the University of California. , http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml (2013).
- Genomatix Inc. , http://www.genomatix.de/cgi-bin//eldorado/main.pl (2013).
