Summary
Gebruik makend van de patiënt afgeleide tumoren in een subcutane preklinisch model is een uitstekende manier om de effectiviteit van nieuwe therapieën, voorspellende ontdekking van biomarkers, en resistente paden te bestuderen. Dit model, in de ontwikkeling van geneesmiddelen, is essentieel voor het bepalen van het lot van vele nieuwe anti-kankerbehandelingen voorafgaand aan klinisch onderzoek.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is een belangrijke bijdrage aan kanker sterfgevallen in de Verenigde Staten. In 2015 waren er naar schatting 132.700 nieuwe gevallen van CRC met 49.700 sterfgevallen 1. Hoewel de prognose bij patiënten met gelokaliseerde ziekte is uitstekend, patiënten met gevorderde ziekte slechte resultaten, waardoor dit een hoge prioriteit bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Ondanks de kwaliteit van de zorg chemotherapeutische behandelingen en nieuwere biologics die worden ingezet tegen deze ziekte, is er slechts een stapsgewijze toename van de totale overleving. Dienovereenkomstig is er een aanzienlijke inspanning in het begrijpen van de bestuurder die betrokken zijn bij het vergemakkelijken van tumorgroei bij deze ziekte. De Cancer Genome Atlas Network heeft onlangs veel belangrijke routes die zijn betrokken bij CRC ontregeling en omvatten: WNT, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), RAS, transforming growth factor-β (TGF-β) en TP53 2. Samen met onderzoeken beschrijven othaar routes die de groei versterken in CRC hebben de ontwikkeling van de nieuwere therapieën die gericht zijn op een aanzienlijke verbetering van de overlevingskansen in deze patiëntenpopulatie 3-5 ontstoken. Gebruik makend van preklinische modellen in de oncologie de ontwikkeling van geneesmiddelen zijn van essentieel belang geweest in dit proces in het voorspellen van de klinische activiteit van deze nieuwe verbindingen.
Diverse preklinische modellen zijn gebruikt bij de ontwikkeling van geneesmiddelen. Aangezien preklinische transgene diermodellen en geïmmortaliseerde cellijnen niet succesvol bij het bepalen van de klinische activiteit van nieuwe kanker therapieën geweest, voornamelijk omdat het niet mogelijk om de complexiteit van menselijke tumoren tijdens zijn patiënt afgeleide tumor xenograft (PDTX) modellen opgezet. Het grootste voordeel van dit model is dat de tumor heterogeniteit intact blijft en sluit nauw aan bij de moleculaire kenmerken en clonaliteit van de oorspronkelijke tumor patiënt 6-9. PDTX modellen bieden een uitstekende in vivopreklinische platform om nieuwe agenten, resistentie tegen geneesmiddelen paden, combinatorische strategieën en kanker stamcel biologie 10 bestuderen.
Een algemeen overzicht van de PDTX werkwijze wordt geïllustreerd in figuur 1. Het begint in de kliniek, instemmende patiënten deel van hun overcapaciteit tumorweefsel worden gebruikt voor dit onderzoek toe. Vervolgens, in de spreekkamer van een stuk van de tumor wordt geëxtrapoleerd door een patholoog en in te transporteren media te onderzoekspersoneel. Direct daarna een deel van de tumor wordt in kleine stukjes gesneden en getransplanteerd in immunodeficiënte muizen subcutaan. Zodra de tumor groeit wordt doorgekweekt in verschillende generaties muizen om de tumor 10 te handhaven. Gewoonlijk nadat de F3 generatie de tumor kan worden uitgebreid tot een behandelingsstudie waarbij nieuwe verbindingen en / of combinatorische therapieën worden geëvalueerd. Gebruik makend van Next Gen Seq (exome Seq, RNA Seq en SNP array) potentieel predictieve biomarkers zijn ontdekted die helpen bij de selectie van patiënten die voordeel kunnen halen uit een bepaalde behandeling.
De overkoepelende doelstellingen van het gebruik van PDTX modellen zijn: 1) een evaluatie van de effectiviteit van nieuwe therapieën als monotherapie of in combinatie en 2) het identificeren van voorspellende biomarkers voor de gevoeligheid of weerstand voorafgaand aan klinisch onderzoek. In dit manuscript, bieden wij de methodologie bij het initiëren en onderhouden van een CRC PDTX bank en bieden de voordelen en beperkingen van dit model in de ontwikkeling van geneesmiddelen ontdekking.
Figuur 1. Overzicht van de CRC PDTX Model Protocol. Een patiënt afgeleid tumor wordt ontvangen van operatie en direct geïnjecteerd in athymische naakt muizen subcutaan. Zodra de tumor groeit het wordt uitgebreid naar de volgende generaties en uiteindelijk uitgebreid voor de behandeling studies. behandeling Responses worden beoordeeld en predictieve biomarkers zijn geïdentificeerd die kunnen helpen bij de selectie van patiënten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Patient afgeleide colorectaal adenocarcinoom tumor monsters werden verkregen van toestemming patiënten aan de Universiteit van Colorado Ziekenhuis in overeenstemming met een protocol door de Colorado Multiple Institutional Review Board (08-0439) goedgekeurd. Alle dierlijke werk werd uitgevoerd onder dier protocollen die door de Universiteit van Colorado Denver Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC, Protocol # 51412 (06) 1E en 96813 (04) 1E).
1. Het ontvangen en voorbereiden van de patiënt Bloed
- Verzamel 1-2 ml bloed in een bloed / cel scheiding buisje met natriumcitraat (tube fasen opgenomen zijn plasma, lymfocyten en monocyten band, dichtheidsgradiënt vloeistof, gel barrière, en erytrocyten en neutrofielen). Let op, volg Blood Borne pathogeen richtlijnen met bloed of weefsel.
Noot: PBMC's en plasma kan worden gebruikt voor toekomstige studies omvatten: het vergelijken kiemlijn genetische variatie tumor mutaties isoleren circulatieTing tumorcellen, het evalueren van celvrij DNA (cfDNA), het onderzoeken van eiwitten en microRNAs, etc. - Centrifugeer het bloed / cel scheiding buis bij 2.500 g gedurende 15 min zonder rem bij kamertemperatuur.
- Verzamel perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs in lymfocyten en monocyten band van de buis) en in een microcentrifugebuis van 1,5 ml (helder, autoclaveerbaar, DNase, RNase en pyrogeenvrij) en plakt aan de bovenkant van de buis met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Centrifugeer bij 2300 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om een pellet van PBMCs vormen op de bodem van de buis. Verwijder vervolgens de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Voeg 1 ml steriele PBS voor de pellet en centrifugeer bij 3000 xg wassen gedurende 30 seconden en verwijder supernatant.
- Gebruik een pipet om plasma te verzamelen van het bloed / cel scheiding buis (in plasma fase van de buis) in een 1,5 ml steriele cryogene flacon (DNase en RNase vrij, geen menselijke DNA, endotoxine gratis) en zet de plasma en pellet van PMBC's in een -80 ° Cfreezer voor opslag.
2. Het ontvangen en voorbereiden van de patiënt Tumor Sample
- Bereid ofwel RPMI of DMEM medium met 1: 100 (10%) van penicilline-streptomycine en niet-essentiële aminozuren, 1: 1000 (1%) Plasmocin en 10% geïnactiveerd foetaal runderserum (compleet medium) en voeg 20 - 25 ml in een steriele verzamelbeker de tumor specimen.
- Ophalen tumor monster in een steriele beker met volledige media op het ijs of te houden bij 4 ° C.
Opmerking: De tumor monster een stuk overmaat patiënt tumorweefsel dat door een chirurg verwijderd, verwerkt door een patholoog, en geplaatst in een steriele opvangbeker met compleet medium. Let op, volg Blood Borne pathogeen richtlijnen met bloed of weefsel. Ook ideaal vijf muizen te injecteren, moet de tumor ongeveer 1 cc. - Breng de tumor monster om het dier faciliteit voor het injecteren in immuungecompromitteerde muizen.
Opmerking: Het beste is om de tumor monster zo snel mogelijk te verwerken.- In een laminaire stroming kap, plaats de tumor monster in een steriele plastic snijden gerecht uit de tumor beker. Gebruik geautoclaveerd-kleine schaar en forceps in 10 te snijden - 12 ongeveer 3 x 3 x 3 mm gesneden en het in een autoclaaf 1,5 ml microcentrifuge buis gevuld met 300 gl gelatineuze eiwitmengsel oplossing. Houd de buis op ijs.
- Voorrang injecteren tumor in muizen, maar als er een tumor overgebleven, verzamelen diepgevroren flacons (FF), formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) bekers en een levensvatbare tumor flesje.
- Voor FF, verzamelen kleine stukjes tumorweefsels uit een steriel cryogeen flesje voor verdere analyse zoals eiwitten, RNA of DNA isolatie. Plaats FF onmiddellijk in vloeibare stikstof Dewar en opslaan op lange termijn in een -80 ° C vriezer.
- Voor FFPE, bij voldoende tumor, plaats 3 kleine stukjes in een 10 ml 10% formaline kop en werkwijze in paraffine ingebedde blokken eenmaal tumor in formaline sedert ten minste 24 uur.
Let op: 24 uur is gebaseerdkorting op onze histologie Core suggesties 11. - Tot slot plaatst u de resterende tumor in een cryogene buis. Voeg geschikt materiaal door toevoeging van 10% dimethylsulfoxide (DMSO) media voltooien. Voeg vervolgens 1 ml van een cryogene gelast en bewaard op ijs. Let op: niet te houden op het ijs voor langere tijd.
- Snijden overgebleven tumor in kleine stukjes die idealiter zal volstaan om 10 tumoren worden geïnjecteerd in 5 muizen in de toekomst. Plaats vervolgens de levensvatbare tumor buis op ijs tot het in een isopropylalcohol bevriezing container (langzaam bevriest de tumor 1 ° C per keer) kan worden gebracht en in -80 ° C vriezer zodat de tumoren niet in de dood gaan invriezen.
Opmerking: Voor de lange termijn opslag van de tumoren worden verwijderd (na 2-3 dagen) en geplaatst in een grote stikstof Dewar vloeistof. Houd er rekening mee dat de levensvatbare buizen niet moet worden toegestaan om te ontdooien, tenzij het wordt genomen om te injecteren in muizen.
- Snijden overgebleven tumor in kleine stukjes die idealiter zal volstaan om 10 tumoren worden geïnjecteerd in 5 muizen in de toekomst. Plaats vervolgens de levensvatbare tumor buis op ijs tot het in een isopropylalcohol bevriezing container (langzaam bevriest de tumor 1 ° C per keer) kan worden gebracht en in -80 ° C vriezer zodat de tumoren niet in de dood gaan invriezen.
3.Injectie van Patient Afgeleid Tumor Xenograften
- Gebruik vijf 6 - 8 weken oude mannelijke en / of vrouwelijke athymische naakt muizen (T-cel deficiënt) voor elke afzonderlijke patiënt afgeleid tumor. Injecteer een totaal van 10 tumoren (2 injecties per muis) subcutaan (SQ).
Opmerking: De oorspronkelijke menselijke tumor is aangewezen als F0 en dan een keer geïnjecteerd in muizen de volgende generatie is F1. Gebruik ook geautoclaveerd forceps, scharen, en trocarts voor elke unieke explantatie. - Belasting stukjes tumor van het gelatineuze eiwitmengsel oplossing in autoclaaf 12 G trocars en waarborgen dat de tumor volledig wordt geduwd in de trocar.
- In een steriele laminaire stroming kap, plaats 5 muizen in een narcosebox die is verbonden met een isofluraan anesthesie machine (begon bij de initiële snelheid van 5% isofluraan, 3-4% zuurstof en 2-3% isofluraan onderhoud van anesthesie) en koolstoffilter (absorbeert overtollige gas).
Opmerking: Een ervaren technicus in staat zijn de gehele procedure opeen kooi van 5 muizen binnen ongeveer 5 minuten in totaal (ongeveer 30 sec per muis). Daarom is extra thermische ondersteuning en eye smering wordt over het algemeen niet gebruikt. Voor minder ervaren mensen of tijdens de training, is het sterk aanbevolen dat individuen ofwel de procedure uit te voeren met minder dieren in een keer en / of gebruik een warming pad / eye smering tijdens de procedure als de dieren langer zal worden verdoofd dan 5 min. Procedure is gebaseerd op IACUC normen aan onze universiteit.
- In een steriele laminaire stroming kap, plaats 5 muizen in een narcosebox die is verbonden met een isofluraan anesthesie machine (begon bij de initiële snelheid van 5% isofluraan, 3-4% zuurstof en 2-3% isofluraan onderhoud van anesthesie) en koolstoffilter (absorbeert overtollige gas).
- Knijp een muis teen te zorgen voor de muis is niet meer reageert, neem dan de muis uit de Isofluraan doos. Plaats de muis op een schone veld om tumoren te injecteren op de middelste dorsale halsgebied en het verschuiven van de trocar naar beneden subcutaan totdat de flank regio wordt bereikt met een autoclaaf 12 G trocars.
- Leveren een tumor subcutaan aan elke zijde van flank van de muis. Knijp de tumor wanneer de trocar wordt uitgetrokken, ervoor te zorgen dat de tumor blijft in de gewenste flank regio. de gelatinous eiwitmengsel verhardt met de muis lichaamstemperatuur en kapselt de tumor voor ongeveer 1 week om te helpen de tumor te laten groeien en zet hem aan de SQ bindweefsel. De laesie door de trocar is niet groter dan 4 mm en er is geen noodzaak om de huid met nietjes sluiten.
Opmerking: Onze dierenartsen bepaald geen sluiting nodig is gebaseerd op de zeer kleine omvang van de laesie, snelle genezing tijd (midden dorsale nek vermindert enige spanning huid of het verzorgen van de laesie), geen infecties geconstateerd, en nauwgezette controle van de dieren in deze periode .
- Leveren een tumor subcutaan aan elke zijde van flank van de muis. Knijp de tumor wanneer de trocar wordt uitgetrokken, ervoor te zorgen dat de tumor blijft in de gewenste flank regio. de gelatinous eiwitmengsel verhardt met de muis lichaamstemperatuur en kapselt de tumor voor ongeveer 1 week om te helpen de tumor te laten groeien en zet hem aan de SQ bindweefsel. De laesie door de trocar is niet groter dan 4 mm en er is geen noodzaak om de huid met nietjes sluiten.
- Voor de muis is volledig wakker inject Meloxicam 2 mg / kg SQ (pijnstillers) van de plaats van tumor injectie. Vervolgens plaatst u de muis in de kooi en controleren totdat de muis is wakker en bewegen.
Opmerking: Laat het herstellen van dieren zonder toezicht totdat helemaal wakker. Meloxicam dosering is gebaseerd op IACUC normen aan onze universiteit.- Vervolgens herhaalt u dezelfde procedure met de 4resterende muizen en toezicht op hun ademhaling.
Let op: Let op: dit is een zeer snelle procedure en muizen wakker zeer snel na Meloxicam injectie, maar passen Isofluraan als dat nodig is. Elke keer dat een muis wordt genomen, zet het Isofluraan. De Meloxicam zal 24 uur duren en de letsels van het trocars zal volledig genezen in 1 week.
- Vervolgens herhaalt u dezelfde procedure met de 4resterende muizen en toezicht op hun ademhaling.
4. Onderhoud van de patiënt Afgeleid Tumor xenograft Bank
- Monitor groei en gezondheid van muizen ten minste eenmaal per week. Gebruik een spreadsheet (of ander volgsysteem) aan tumorgrootten, tumor generatie na tumorinjectie en gezondheid van muizen te volgen.
Let op: Als muizen 15% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht, lage lichaamsconditie scores (≥ 2) hebben verloren, hebben tumor zweren, tumoren bereiken van 2.000 mm 3 of totaal tumoren 3.000 mm 3, of zijn ziekelijk (ineengedoken, koude, lethargie, etc .) op enige wijze worden muizen gedood via CO₂ of verdoofd gevolgd door cervicale dislocatie alsecondary methode. Euthanaseren via anesthesie en cervicale dislocatie als het verzamelen van de tumor, anders muizen gedood via CO₂ en cervicale dislocatie. - Wanneer een tumor is ongeveer 1500-2000 mm 3 Verdoven de muizen zoals hierboven beschreven en vervolgens uit te voeren cervicale dislocatie te euthanaseren.
- Controleer of de muis heeft geen hartslag. Accijnzen de SQ tumor met geautoclaveerd schaar en pincet.
OPMERKING: Laat tumoren groeien tot 1 jaar en als er geen tumor wordt waargenomen dan euthanaseren de muizen via CO 2, gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire methode. - Passage de beste groeiende tumor in de volgende generatie (aka een nieuwe reeks van 5 muizen). Gebruik bovenstaande instructies voor het verzamelen van 10-12 tumoren te passeren en vervolgens het verzamelen van de overgebleven tumor zoals ook hierboven beschreven.
Opmerking: Het verzamelen tal levensvatbare buizen is zeer belangrijk in de vroege generaties (F1 - F8); Daarom verzamelen verschillende levensvatbare buizen, FF buizen, en 1 FFPE per generation. - Houd de overblijvende muizen tot een nieuwe generatie muizen heeft tumorgroei van ongeveer 300 mm 3. Wanneer de resterende muizen tumoren die groot zijn, blijven verzamelen op de bovengenoemde.
- Controleer of de muis heeft geen hartslag. Accijnzen de SQ tumor met geautoclaveerd schaar en pincet.
- Blijven passage tumoren en verzamelen in elk stadium tot F15. Op dit punt neemt een levensvatbare buis van de eerste generatie mogelijk van vloeibare stikstof en laten ontdooien op ijs en follow-tumor injecteren procedures hierboven beschreven.
Let op: Tumoren die groeien van levensvatbare buizen langer duren om te groeien in muizen in vergelijking met het passeren van generatie op generatie, dus houd daar rekening mee bij het plannen. Als een bepaald PDTX model niet langer elke passage nodig, euthanaseren en verzamel tumor te zorgen tal levensvatbare buisjes worden verzameld voor toekomstig gebruik.
5. Developmental Therapeutics met Patiënt Afgeleid tumorxenotransplantaten
Opmerking: De meeste tumoren op F3 generatie hebben een goede groei kinetiek (sneller en co groeiennsistent), daarom overgaan tot werkzaamheid van het geneesmiddel studies PDTX.
- Wanneer de gewenste tumor is zeer groot (1500 - 2000 mm 3), volgt u bovenstaande procedures om de tumor uit te breiden naar de gewenste hoeveelheid muizen te verzamelen.
- Afhankelijk van de hypothese te testen bepaal het aantal tumoren bestaan per behandelingsgroep.
Opmerking: 1 ml gelatineus proteïnemengsel oplossing ongeveer 30 fit kleine stukjes tumor (afhankelijk tumor morfologie) te injecteren in muizen.
- Afhankelijk van de hypothese te testen bepaal het aantal tumoren bestaan per behandelingsgroep.
- Controle muizen met tumoren wekelijkse en wanneer de meeste tumoren zichtbaar klein (ongeveer tussen de 50-300 mm³) meet de tumoren met remklauwen aan de tumor volume te bepalen. Tumor volume = [width² (kleinste meting) x lengte (grootste meting)] x 0,52.
Opmerking: Het gelatineuze eiwitmengsel oplossing rond de geïnjecteerde tumor stukken voor een week, dan na een week tumorgroei accuraat is. - Gebruik tumor volumes tussen 50-300 mm³ en den het gemiddelde van de linker en rechter tumoren. willekeurig dan in behandelingsgroepen met 10 tumoren per groep en een groepsgemiddelde binnen een paar nummers van elkaar. Vervolgens sorteren de muizen in groepen en beginnen met het gewenste behandeling studie.
- Dosis de muizen met drugs (schema afhankelijk van de drug), wegen en meten (tumor) twee keer per week. Aan het einde van de studie, euthanaseren muizen via anesthesie en cervicale dislocatie en laat tumor toekomstige farmacodynamische analyse in het laboratorium.
Opmerking: Het onderzoek duurt 30 dagen afhankelijk van de auto tumorgrootte en gezondheid van muizen.
6. Organisatie van een PDTX bank
- Houd een goed gedocumenteerde vorm om te voorkomen dat het herhalen van het onderzoek en het juiste gebruik van de dieren.
LET OP: Dit is de sleutel tot een succesvolle PDTX bank.- Gebruik spreadsheets bijhouden van een tumor van de menselijke patiënt in de kliniek te houden aan muizen in de PDTX bank, behandelingen, data, en wat opgevangen. Let op: dit is inclusief vriezer, vloeibare stikstof dewarsEn FFPE opslag ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overeenkomsten van het gemeenschappelijk Mutaties in het CRC PDTX Models en de TCGA
We hebben onderzocht of het percentage van de gemeenschappelijke mutaties (KRAS NRI, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 en TP53) in de CRC PDTX bank representatief was om de mutatie frequentie te zien in de CRC patiëntenpopulatie. Zoals getoond in Figuur 2A (TCGA) en B (CRC PDTX bank), de frequentie van mutaties in deze genen waren vergelijkbaar tussen de TCGA (n = 276 patiënten) en de CRC PDTX bank (n = 59 patiënten CRC). Het grootste verschil waargenomen was in het APC-gen waarbij een 23% verschil waargenomen. Deze resultaten suggereren dat gemeenschappelijke mutaties waargenomen in de CRC patiëntenpopulatie goed vertegenwoordigd in de CRC PDTX model.
Evaluatie van de stabiliteit van de behandeling antwoorden tussen verschillendeGenerations
In deze CRC PDTX model hebben we besloten om te bepalen of de effecten van de behandeling waren vergelijkbaar tussen de verschillende generaties. Tumoren werden geëxpandeerd in athymische naakt muizen (10 tumoren / groep) en de werkzaamheid van de zorgstandaard middelen zoals cetuximab (0,4 mg / mouse IP tweemaal per week) en irinotecan (15 mg / kg IP keer per week) onderzocht 4 unieke CRC PDTX modellen in twee afzonderlijke generaties. Zoals geïllustreerd in figuur 3A en B, CRC026 (F3) meer resistent tegen behandeling met cetuximab, terwijl CRC010 (F6) vertoonde behandeling gevoeligheid. Soortgelijke resultaten werden waargenomen wanneer deze CRC explantaten in verschillende generaties werden behandeld; CRC026 (F9) was resistent en CRC010 (F7) was gevoelig voor cetuximab. Om de werkzaamheid van irinotecan in de PDTX model te bepalen, onderzochten wij behandeleffecten op tumorgroei in 2 CRC PDTX modellen. Terwijl CRC098 (F8) was resistent tegen irinotecanbehandeling, CRC036 (F5) vertoonden gevoeligheid (Figuur 3C en D). Zoals werd waargenomen met cetuximab, een behandeling met irinotecan in verschillende generaties niet de respons op de behandeling in deze tumoren niet veranderen; CRC098 (F12) werd bestendige CRC036 (F10) was gevoelig voor irinotecan (figuur 3C en D). Hoewel de groeikinetiek van onbehandelde tumoren soms verschillend tussen generaties behandelingsreacties irinotecan en cetuximab gebleven, met vermelding van de stabiliteit van dit model bij de beoordeling anti-kankertherapieën.
Onderzoek van de Stroma Component in de CRC PDTX Model
Vervolgens waren we geïnteresseerd in het bepalen of het stroma component op deze CRC explantaatmodel bestond uit humane en / of muizen afgeleide cellen. We gebruikten een dual-color Cot-1 FISH test die bestond uit muisCot-1 DNA (groene fluorofoor) en humaan Cot-1 DNA (rode fluorofoor) naar muis en menselijke cellen in 10 afzonderlijke CRC explantaten tussen F0 en F1 generaties 25 te bepalen. Zoals getoond in figuur 4A, in de F1-generatie menselijke stroma wordt vervangen door de stroma muis, omdat de menselijke tumor nu omringd door stroma muis. Deze bevindingen waren duidelijk in alle 10 CRC explantaten die werden onderworpen aan Cot-1 FISH tussen de F0 en F1 generaties. Naast Cot-1 FISH, onderzochten we eiwitniveaus van muis en humaan HGF en VEGF liganden in de F0 en F1 generatie behulp van de muis en menselijke ELISA's voor deze liganden. Zoals weergegeven in figuur 4B en C, terwijl alle menselijke afgeleid HGF in de F0 generatie wordt vervangen met de muis HGF in de F1-generatie, VEGF ligand bestond uit zowel mens en muis in de F1-generatie. Samen vormen deze experimenten suggereren dat in de CRC PDTX muismodel dat de muis stroma haalt het menselijk stroma in the F1-generatie en de liganden afgescheiden kan variëren met betrekking tot het mens en / of de muis afgeleid.
Figuur 2. Vergelijking van het gemeenschappelijk Mutaties in het CRC PDTX Bank en de TCGA. We zagen zeer vergelijkbaar mutatie frequenties tussen de TCGA (A) en de CRC PDTX model (B) met betrekking tot KRAS NRI, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 en TP53 . klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De gevolgen van cetuximab en irinotecan Behandeling op tumorgroei. (A) CRC026 weergegeven weerstand tegen cetuximab wanneer evaluated in de F3 en F9 generaties en (B) CRC010 vertoonden gevoeligheid voor cetuximab in de F6 en F7 generaties. (C) CRC098 vertoonde resistentie tegen irinotecan in de F8 en F12 generaties, terwijl (D) CRC036 gevoelig voor irinotecan in F5 was en F10 generaties. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een gemiddelde van 10 tumoren per behandelingsgroep. Muizen werden behandeld met cetuximab (100 ul IP 400 ug / muis) tweemaal per week en irinotecan (100 gl IP 20 mg / kg) werd eenmaal per week gedoseerd. De gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Evaluatie van de Muis en Tumor Cell Components in de F0 en F1 Generations. (A) Dual-cCygnus FISH voor humaan Cot-1 DNA (rood) en muizen Cot-1 DNA (groen) werd gebruikt om verschillen tussen tumoren in de F0 en F1-generatie onderzoeken. Human stroma (F0) wordt vervangen door de muis stroma (F1) in CRC098 en CR174 (schaal = 20x). Necrotische cellen werden geïdentificeerd door een verminderde of gebrek aan DAPI intercalatie en rode fluorescentie. Onderzoek van muis en humaan HGF en VEGF ligand expressie door ELISA (muis en mens ELISAs) tussen F0 en F1. (B) Human HGF werd vervangen door muis in de F1-generatie en (C) mens en muis VEGF waren duidelijk in de F1-generatie (picogram / milliliter [pg / ml]). De gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De PDTX drug discovery platform biedt een verbeterd model om de tekortkomingen van andere preklinische modellen die onbetrouwbaar voorspellen van de klinische activiteit van nieuwe verbindingen. Belangrijk is dat tumoren in dit model zijn biologisch stabiel, behouden metastatische potentieel, en vertonen vergelijkbare drug responsiviteit van generatie op generatie. In dit model worden afgeleid patiënt tumoren geïnjecteerd in athymische naakt muizen gepasseerd en vervolgens gebruikt in therapeutische evalueren. Er zijn verschillende kritische stappen voor een succesvolle PDTX bank die omvatten: 1) een samenhangend klinisch team / consent identificeren en voor het verwijderen en extrapolatie van tumorweefsel voor PDTX model en 2) een sterke onderzoeksgroep uitstekende laboratorium en dierlijke technische vaardigheden voor het injecteren tumoren, organisatie en onderhoud van de PDTX bank en de gezondheids- muizen. Een belangrijk voordeel in onze PDTX modellen is het injecteren van tumoren met de trocar procedure. De alternatieve cun de sla een tumor zak en vervolgens hechten of het gebruik van de huid clips is meer tijd in beslag voor het personeel, vergt meer pijn medicatie voor de muizen, en het toezicht op de gehechte wond of uitgeknipte gebied. De trocar procedure vereist minder training, is zeer snel, de muizen onder narcose minder tijd en minder pijnstillers nodig. Daarom is in onze ervaring injecteren tumoren met trocar is de beste methode versus alternatieve methoden. Deze factoren zullen significante invloed op de algehele succes van de PDTX bank en in de drug discovery proces. Hoewel dit in vivo model is aanzienlijk duurder dan het testen van agenten in kanker cellijn culturen, PDTX modellen bieden een meer klinisch relevante aanpak bij het testen van de oncologie verbindingen.
In de CRC PDTX bank, hebben we 99 tumor samples, die in athymische naakt muizen werden geïnjecteerd ontvangen. Er waren 68 van de 99 (68,7% take rate) tumoren die groeiden in muizen en werden doorgegeven in meerdere generaties. Erzijn verschillende redenen waarom sommige tumoren die we kregen niet groeien in muizen. Bijvoorbeeld, we soms kregen slechts zeer kleine stukjes weefsel dat alleen liet ons toe om te injecteren in slechts één muis het verminderen van de kans op de oprichting van een tumor. Een ander probleem was dat soms patiënt weefsel dat normaal was en geen tumorcellen zichtbaar op H & E slide bevatten ontvingen wij. Bovendien kunnen slecht weefsel kwaliteit door het ontvangen van al tumor necrose waar er een respons van de patiënt op de behandeling. Daarom is het belangrijk om een betrouwbare en chirurgische pathologie team wanneer grossing de tumor. Aangezien sommige van deze problemen, zijn we in staat om een van de grootste CRC PDTX banken volledig geannoteerde tumoren vastgesteld met betrekking tot mutaties, genexpressie en klinische kenmerken zijn, waardoor dit een waardevol model voor de evaluatie van nieuwe therapieën met als einddoel het verbeteren van patient outcomes.
Talrijke biologische en combinatorischetherapieën zijn onderzocht in dit model met als doel het bepalen van de werkzaamheid, resistentie mechanismen, alsmede behandelingseffecten op kanker stamcelpopulatie. Onze fractie heeft de werkzaamheid van een groot aantal nieuwe biologische pathway-remmers het gebruik van dit preklinisch model 12-18, die waardevol inzicht heeft gegeven in de verdere klinische ontwikkeling van deze verbindingen onderzocht. Veel van deze studies zijn voorspellende biomarkers 12-14,17,18 die kunnen helpen bij de selectie van patiënten in toekomstige klinische trials geïdentificeerd. Bovendien hebben andere studies verder bepaald mechanismen van behandelingsresistentie gebruik van dit model, die heeft geleid tot de ontwikkeling van rationele combinaties 19-24. Bijvoorbeeld, Bardelli en collega's 19 toonden aan dat de behandeling met cetuximab geïnduceerde BMO versterking en dat voldaan, kunnen een onderliggende mechanisme van de behandeling weerstand tegen cetuximab in CRC. 19 In een aparte studie, Bertotti et al. 20Her2 geïdentificeerd als doelwit CRC tumoren die resistent cetuximab waren. Tenslotte hebben wij en een andere groep getoond dat behandeling met een Notch remmer in combinatie met irinotecan verkleinde CRC kanker stamcelpopulatie en tumor recidief na stopzetting van de behandeling 25,26. Samen vormen deze studies tonen de potentiële kracht van het gebruik PDTX modellen in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen die een belangrijke invloed hebben op het verder ontwikkelen van nieuwe verbindingen.
Ondanks de grote voordelen behulp patiënt afgeleide tumors het bepalen van de effectiviteit van nieuwe verbindingen, zijn er verschillende beperkingen in dit model. Zoals experimenteel aangetoond in dit document, is de menselijke stroma van de tumor, van oorsprong (F0) vervangen met de muis stroma op de F1-generatie in de CRC PDTX model. Afhankelijk van het specifieke drug target, kan dit een probleem zijn wanneer de muis liganden zijn niet in staat om de receptor (en) op humane tumorcellen te activeren. voor instance laten we zien dat in de F1-generatie, HGF wordt afgeleid van de muis stroma en onderzoeken hebben aangetoond dat muis HGF niet in staat is functioneel activeren van het humane c-Met receptor 27,28. Hierdoor kan c-Met remmers niet anti-tumorgroei effecten PDTX deze modellen vertonen. In feite hebben gehumaniseerde HGF SCID-muizen ontwikkeld om dit potentiële probleem 28 te pakken. Een ander nadeel van het gebruik van subcutane tumoren is het onvermogen om behandelingseffecten op het metastatische potentieel van tumoren te bestuderen. Met behulp van orthotope modellen, hoewel meer technisch moeilijk om vast te stellen en het imago tumorgroei, zal waarschijnlijk zorgen voor een beter inzicht in de behandeling effecten op metastase. Een laatste beperking van dit model is het onvermogen om de rol van het immuunsysteem bij potentiëren tumorgroei en zijn functie in het faciliteren resistentie tegen behandeling te onderzoeken. Bovendien, met de uitstekende activiteit van immuuntherapie onlangs aangetoond in de kliniek gebruikt immunodeficient muizen voorkomt dat het onderzoek van het immuunsysteem gerichte agenten. Dienovereenkomstig zijn gehumaniseerde muismodellen zijn ontwikkeld om deze beperkingen, welke waarde kan verschaffen in het begrijpen van de fundamentele rol van immuun-tumor- interacties en bieden voor het onderzoek van immuuntherapie in combinatie met andere nieuwe verbindingen en goedgekeurd pakken.
Concluderend geven we een werkwijze voor het ontwikkelen en handhaven van een CRC PDTX model dat van onschatbare waarde bij het bepalen van de therapeutische werkzaamheid, voorspellende biomarkers en geneesmiddelen resistentieroutes van nieuwe anti-kankermiddelen. Hoewel dit model heeft inherente problemen, het nut van dit model is dat het nauw recapituleert de tumor heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor, die een meer nauwkeurige en klinisch relevante onderzoeken van nieuwe therapieën voorafgaand biedt klinische evaluatie. Toekomstige evaluatie van de klinische impact bij de ontwikkeling van geneesmiddelen van deze preklinische PDTX model zal uiteindelijk bepalen de kracht van dezemodel voorspellen van de klinische werkzaamheid van therapieën bij kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI or DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Non-essential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath |
| CPT blood tube | BD vacutainer | 362761 | |
| Microcentrifuge tube | Surelock | A-7002 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | |
| Cyrogenic vials | Cyroking | C0732901 | |
| Plastic tumor cutting dish | Trueline | TR4001 | |
| Scissors | Roboz | RS-5881 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (gelatinous protein mixture) | Corning | 354234 | Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT |
| 10% Formalin cups | Protocol | 032-059 | |
| Liquid Nitrogen Dewar Storage | Thermolyne | CY50900 | |
| Portable liquid nitrogen dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Freezing container: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Isopropyl Alcohol | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Anesthesia machine | Patterson Veterinary | ||
| Anesthesia box | Patterson Veterinary | ||
| Isoflurane | Vet one | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Calipers | Fowler | 54-100-167 | |
| Weight scale | Ohaus | Scout Pro SP601 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487 (7407), 330-337 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. Tumours with elevated levels of the Notch and Wnt pathways exhibit efficacy to PF-03084014, a gamma-secretase inhibitor, in a preclinical colorectal explant model. Br J Cancer. 109 (3), 667-675 (2013).
- Hubbard, J., Grothey, A. Antiangiogenesis agents in colorectal cancer. Curr Opin Oncol. 22 (4), 374-380 (2010).
- van Es, J. H., et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature. 435 (7044), 959-963 (2005).
- Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Res. 75 (15), 2963-2968 (2015).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Julien, S., et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clin Cancer Res. 18 (19), 5314-5328 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Carson, F. L. Histotechnology: A Self-Assessment Workbook. , American Society of Clinical Pathologists Press. Chicago, IL. (1996).
- Arcaroli, J. J., et al. Common PIK3CA mutants and a novel 3' UTR mutation are associated with increased sensitivity to saracatinib. Clin Cancer Res. 18 (9), 2704-2714 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. A NOTCH1 gene copy number gain is a prognostic indicator of worse survival and a predictive biomarker to a Notch1 targeting antibody in colorectal cancer. Int J Cancer. 138 (1), 195-205 (2016).
- Arcaroli, J. J., et al. Gene array and fluorescence in situ hybridization biomarkers of activity of saracatinib (AZD0530), a Src inhibitor, in a preclinical model of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 16 (16), 4165-4177 (2010).
- Lieu, C. H., et al. Antitumor activity of a potent MEK inhibitor, TAK-733, against colorectal cancer cell lines and patient derived xenografts. Oncotarget. 6 (33), 34561-34572 (2015).
- Pitts, T. M., et al. Association of the epithelial-to-mesenchymal transition phenotype with responsiveness to the p21-activated kinase inhibitor, PF-3758309, in colon cancer models. Front Pharmacol. 4, 35 (2013).
- Song, E. K., et al. Potent antitumor activity of cabozantinib, a c-MET and VEGFR2 inhibitor, in a colorectal cancer patient-derived tumor explant model. Int J Cancer. 136 (8), 1967-1975 (2015).
- Tentler, J. J., et al. Identification of predictive markers of response to the MEK1/2 inhibitor selumetinib (AZD6244) in K-ras-mutated colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 9 (12), 3351-3362 (2010).
- Bardelli, A., et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov. 3 (6), 658-673 (2013).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov. 1 (6), 508-523 (2011).
- Davis, S. L., et al. Combined inhibition of MEK and Aurora A kinase in KRAS/PIK3CA double-mutant colorectal cancer models. Front Pharmacol. 6, 120 (2015).
- Morelli, M. P., et al. Preclinical activity of the rational combination of selumetinib (AZD6244) in combination with vorinostat in KRAS-mutant colorectal cancer models. Clin Cancer Res. 18 (4), 1051-1062 (2012).
- Pitts, T. M., et al. Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer. PLoS One. 9 (11), e113037 (2014).
- Spreafico, A., et al. Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (15), 4149-4162 (2013).
- Arcaroli, J. J., et al. ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer. Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).
- Hoey, T., et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).
- Ikebuchi, F., et al. Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species. Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).
- Zhang, Y. W., et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).
