Böbrek fonksiyonu geri kazanımı için ilaçların uygulanması lokalizasyonu ve tedavi bileşiğinin dağılımının kontrolünü gerektirir. Burada, detaylı sıçanlarda ilaçların intrarenal teslimat için basit bir teknik açıklar. Bu prosedür kolayca hiçbir ölüm ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile gerçekleştirilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıçan Böbrek için Biologies intravasküler teslim
Bu makalede
Özet
Özet
Renal mikrovasküler kompartman, böbrek hastalığı ve hipertansiyonun ilerlemesinde önemli bir rol oynar ve kardiyovasküler olaylar için ölüm riski yüksek olan Son Dönem Böbrek Hastalığının gelişmesine yol açar. Ayrıca, son yıllarda yapılan klinik çalışmalar, renovasküler yapı ve fonksiyonun cerrahi sonrası fonksiyonel böbrek iyileşmesi üzerinde büyük bir etkisi olabileceğini göstermiştir. Burada, ilaçların sıçanların renal arterine verilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu prosedür, daha lokalize bir terapötik etkiye izin verebileceği için sık kullanılan sistemik uygulamaya göre önemli avantajlar sunar. Ek olarak, klinik öncesi çalışmaların farmakodinamik analizinde kemirgenlerin kullanımı maliyet etkin olabilir ve daha büyük hayvan modellerinde translasyonel deneylerin tasarımının önünü açabilir. Bu tekniği kullanarak, sıçanlarda sıçan rekombinant Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) proteininin infüzyonu, FLK1, pAKT / AKT, pERK / ERK ekspresyonunun artmasıyla gösterildiği gibi VEGF sinyalinin aktivasyonunu indüklemiştir. Özetle, sıçanlarda ilaçların intrarenal verilmesi için basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokol oluşturduk.
Giriş
Böbrek mikrovaskülatürü, böbrek hastalıklarının geniş bir spektrumunda yer alır. Hastalığın patofizyolojisine bağlı olarak, endotel hücreleri yapısal veya fonksiyonel bozukluk gösterebilir ve bu da iskemik bir mikroçevre oluşturarak böbrek hasarının yayılmasında çok önemli bir rol oynayabilir. Bu renal mikrovasküler disfonksiyon, zaman içinde böbrek fonksiyonunda ilerleyici bir bozulmanın başlangıcını katalize ederek kronik böbrek hastalığına (KBH), son dönem böbrek hastalığına, hipertansiyona ve kardiyorenal sendroma yol açabilir. Aslında, tedavi edilmeyen hipertansiyonun renal arteriyollerde etkileri olabilir, bu da vasküler hacim fraksiyonunda önemli azalma, vasküler dirençte artış ve tubulointerstisyel fibrozgelişimi ile nefroskleroz veya glomerüloskleroza neden olabilir 1.
Renal mikrovasküler sistem kaybı, lokal anjiyojenik/antianjiyojenik faktör dengesizliğinin neden olduğu değişmiş vasküler homeostaza bağlı olabilir. Bu, zayıflatılmış Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü (VEGF) sinyalinin yanı sıra yüksek trombospondin-12-4 ile ilişkilidir. Bu nedenle, farklı hayvan modelleri (fareler, sıçanlar ve domuzlar) kullanılarak, VEGF'nin eksojen uygulamasının terapötik etkisi, bazı böbrek hastalığı formlarında yakın zamanda araştırılmış, azalmış interstisyel fibroz ve stabilize böbrek ve kardiyak fonksiyon3-5 göstermiştir. Bu etki muhtemelen VEGF'nin mikrovasküler yatağın endotel hücreleri üzerindeki etkilerinden ve inflamatuar monosit fenotip değiştirmesinden6 kaynaklanmaktadır.
Bazı klinik öncesi çalışmalarda, en yaygın kullanılan laboratuvar hayvanları olan kemirgenlerin kullanımı, nispeten düşük maliyetler ve kullanım kolaylığı nedeniyle yüksek verimli çalışmalar için iyi bir hayvan modeli sağlar. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş sıçanların hipertansiyon gibi insan hastalıklarının modeli olarak kullanılması, bilim camiasında giderek daha sık hale gelmiştir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, sıçanlarda uygulanması kolay ve yüksek oranda tekrarlanabilir yararlı bir intrarenal VEGF uygulama tekniğini tanımlamaktır. Ayrıca, aynı yöntem diğer ilaçları seçici olarak vermek için de kullanılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneyler 250-300 g ağırlığında erkek Sprague-Dawley fareleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (Laboratuar Hayvan Kaynakları Enstitüsü, Ulusal Bilimler Akademisi, Bethesda, MD, ABD) ve için Kılavuzunda belirtilen standartlara uyup Bütün hayvan prosedürleri Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı Mayo Clinic Koleji tarafından kabul edildi ve kullanımı Komitesi (IACUC).
1. Hazırlık
- Ameliyattan önce tüm cerrahi aletler otoklav. Farklı fareler üzerinde birden fazla ameliyatlar aynı gün içinde planlanan, her hayvan işleminden sonra durulama ve sonra sıcak bir boncuk sterilizatör kullanılarak sterilize edin.
- 1 L / dk O 2 izofluran% 4 ile sıçan anestezisi.
- 37 ° C 'de, vücut sıcaklığını muhafaza etmek için kontrollü ısıtma pedi sıçan aktarın. 1 L / dk O 2% 1-2 izofluran ile anestezi koruyun.
- analjezik ilaç (Buprenorfin Release 0.6 mg / kg Sürekli) su yönetmebcutaneously.
- İşlem sırasında kurumasını önlemek için gözlere merhem sürün.
- nedeniyle laparotomi vücut sıvılarının kaybını telafi etmek için, ameliyat öncesinde% 0.9 normal müsil, deri altından 10 ml / kg tatbik edilmesi önemlidir.
- Karın bölgesi tıraş ve povidon-iyot ve% 70 etanol yastıkları ile cildi temizleyin.
2. Cerrahi Prosedür
- sedasyon derinliği gibi ayak tutam çekilmesi, palpebral refleks, çene sesi ve solunum hızı / desen gibi fiziksel refleksleri, izleme yoluyla yeterli olduğundan emin olun.
- Bir cerrahi neşter bıçak No. 10 kullanarak küçük bir orta hat kesi yoluyla bir laparotomi (uzunluğu 2-2,5 cm) gerçekleştirin.
- pamuklu çubuklarla kullanarak karnın sağ tarafına bağırsak ve kolon çekin ve organları nemli tutmak için% 0.9 normal tuzlu için ıslatılmış steril gazlı bez ile bunları kapatın.
- Yavaşça AOR maruz yukarı dalak, karaciğer, mide ve pankreas gerita ve sol böbrek arter.
- Cerrahi mikroskop yardımıyla dikkatlice yukarıda ve sol böbrek ve damarları, yağ sol renal arter ve künt diseksiyon kavisli bir forseps ve steril pamuklu çevreleyen bağ dokusu altında abdominal aorta ayırın.
- yağ çıkarmak için bir yanal yuvarlanma hareketi ile bağ dokusu ve pamuk bezlerden kaldırmak için damarların uzunluğu boyunca tekrarlanan açma-kapama hareketi (künt diseksiyon) ile forseps kullanabilir.
NOT: peri-aort bölgenin diseksiyonu zarar görmüş olabilir sinirler ve lenf damarları olarak çok hassas bir adımdır. diseksiyon işlemi sırasında tuzlu su ile nemli arterler tutmak için emin olun.
- yağ çıkarmak için bir yanal yuvarlanma hareketi ile bağ dokusu ve pamuk bezlerden kaldırmak için damarların uzunluğu boyunca tekrarlanan açma-kapama hareketi (künt diseksiyon) ile forseps kullanabilir.
- aorta altında 4-0 ipek sütür yerleştirin.
- mikrovasküler klipleri kullanarak, (sadece superior mezenterik arterin altında) ve renal arter bifurkasyon altında yukarıda aort kelepçe.
- Sol kidn seviyesinde aort delikler24 G intravenöz kateter ile ey arter dallanma ve renal arter içine kateter ilerlemek.
NOT: Bu oluşabilir renal arter yoluyla delik olarak kritik bir adımdır. - kateter ilaç solüsyonu veya (500 ul kadar) tuzlu su ile dolu bir şırınga bağlayın ve böbrek serpmek.
- Hemen perfüzyon sonra, bir mikrovasküler klip ile sol renal ven ve sol üreter kelepçe ve kateter çıkarın. Ardından, aortun delinmiş alanı üzerinde, doku yapıştırıcı küçük bir damla ile, emilebilen hemostat jelatin sünger bir parça koyun ve yavaşça bir pamuklu çubukla basınç uygulayın.
- Aynı zamanda, sol renal arter bifurkasyon altında, abdominal aort kelepçeyi serbest bırakın. 5 dakika sonra, renal ven ve üreter kelepçeyi serbest bırakın.
- Dikkatle sol renal arter bifürkasyonun üzerinde, aorta kelepçe bırakın ve böbrek reperfüzyon için izin verir. toplam renal iskemi, 7 dakika daha uzun sürmelidir.
- aktif kanama meydana emin olun ve yakından 10 dakika daha alanını gözleyin.
- enfeksiyonu önlemek için 4-0 emilebilir sütürler ve sürekli bir kalıbı kullanarak, iki kat (kas ve deri) karın kesisi kapatın. sürekli bir modeli dikiş tekniğine ilave olarak, başka bir seçenek yarılması önlemek için, özellikle vücut duvarı kapatılması için, basit bir kesintiye tekniği kullanmaktır.
- enfeksiyonları önlemek için kesi alanı üzerinde topikal antibiyotik merhem sürün.
- 35-37 ° C'de ayarlanmış bir sıcaklık aralığında tam iyileşme kadar sıcak bir pad üzerinde bir yatak ücretsiz gözlem kafesin içine sıçan aktarın. Gevşek yatak kaplı (örneğin drape veya kağıt havlu ile) ya da hayvanların tamamen boğulma ya da yatak aspirasyonu önlemek için iyileşene kadar kafes çıkarılmalıdır.
- Ameliyattan sonra birkaç saat için saatlik, daha sonra kendiliğinden nefes kadar sürekli hayvanları gözlemlemek. analjezik Buprenorfin SR 72 saat yeniden dozDaha sonra rahatsızlık belirtileri gibi eğilmiş ve pasaklı uyuşukluk, face, normal aktivitelerini sürdürme değil, görülmesi halinde.
- Tüm çalışmalar tamamlandıktan sonra, CO 2 aşırı dozda inhalasyon ile hayvanların ötenazi ve ex vivo böbrek dokular gibi histoloji ve Western Blot 5 olarak analiz hasat.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Rekombinant fare VEGF (rrVEGF, 0.17 ug / kg ve 5 mg / kg) ya da PBS iki farklı dozda enjekte edildi. hayvanlar VEGF yolunun aktivasyonunu incelemek için 8 saat sonrası ameliyat ötenazi uygulandı. H & E boyama ile gösterildiği gibi, kontrol (Şekil 1B) göre cerrahi işlem perfüze böbrek (Şekil 1A) morfolojisini etkilememiştir. Kontrol (Şekil 1D) ile karşılaştırıldığında Sirius kırmızısı boyama iskemik zaman ve rrV...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kronik böbrek hastalığının artan insidansı, fonksiyonel böbrek iyileşmesini destekleyebilecek yeni terapötik yaklaşımlara olan ihtiyacı artırmaktadır7,8. Geleneksel tedaviler, anti-inflamatuar, anti-fibrotik ilaçların sistemik uygulamasını içerir9. Bununla birlikte, bu stratejiler sıklıkla enjekte edilen ilacın hedef dışı dağılımı nedeniyle istenmeyen yan etkilerle karakterize edilir. Bu nedenle, bu yazıda, sıçanların renal arterine ilaç vermek için basit bir prosedür açıklıyoruz. Bu protokol, hiper...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu çalışma kısmen Astra Zeneca bir araştırma bursu ile desteklenmektedir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cerrahi Mikroskop | Leica | M125 | |
| Isofluran 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anestezik |
| Buprenorfin HCL SR LAB 1 mg / ml, 5 ml | ZooPharm Eczane | Buprenorfin narkotik analjezik, emilimi yavaşlatan, etki süresini uzatan (72 saatlik aktivite süresi) bir polimerde formüle edilmiştir. Sıvı viskozdur, RT'ye ısınmak şırıngaya çekmeye yardımcı olur. Önerilen doz: 1 - 1.2 mg / kg SC. SULANDIRMAYIN. | |
| Puralube Vet Oftalmik Merhem | Dechra | NDC17033-211-38 | Steril oküler kayganlaştırıcı |
| Emzirilmiş Zil Enjeksiyonu, USP, 250 ml VIAFLEX Plastik Kap | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | Vücut sıvılarının değiştirilmesi için |
| Sol Povidon-İyot Çubuk, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Steril pamuk uçlu aplikatörler | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 ipek sütür (iğnesiz) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Gemi Klipsi, Düz, 0,75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Kateter, Düz Hub, Radyoopak, 24 g x 3/4", FEP Polimer | Jelco | 4053 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Hayat | Teknolojileri | 10010023 | |
| SURGIFOAM Emilebilir Jelatin Sünger | Cardinal Sağlık | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBAKTERIYEL) VIOLET 27" RB-1 Konik | Ethicon | VCP304H | Kas için Katman Dikiş |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBAKTERIYEL) BOYASIZ 18" PC-3 KESME | Ethicon | VCP845G | Cilt tabakası dikişi için |
| Üçlü antibiyotik merhem | Actavis | NDC0472-0179-56 | İnsizyon bölgesinde topikal kullanım için |
| Rekombinant Sıçan VEGF 164 Protein R | & D Sistemleri | 564-RV | |
| Tavşan monoklonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Tavşan monoklonal FLK1 | Hücre Sinyali | 9698 | |
| Tavşan monoklonal AKT | Hücre Sinyali | 4691 | |
| Tavşan monoklonal fosfoAKT (Ser 473) | Hücre Sinyali | 4060 | |
| Tavşan monoklonal p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2) | Hücre Sinyali | 4695 | |
| Tavşan monoklonal fosfo p44/42 MAPK (Thr202 ve Tyr 204) | Hücre Sinyali | 4370 |
Kaynaklar
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
