Summary
Farelerin transüretral Kateterizasyon kurulan modeli mesane patolojiler, idrar yolu enfeksiyonu, dahil olmak üzere çalışma sağlar ancak yalnızca dişi içinde gerçekleştirilebilir. Burada anlatılan erkek transüretral korumak yeni bir model araştırma cinsiyetler arasında güçlü klinik ve epidemiyolojik farklarına iaretlenmi bir alanı sağlayacaktır.
Abstract
İdrar yolu enfeksiyonu (iye) dünya çapında, son derece önemli morbidite ve sağlık ilişkili giderleri üstlenmeden yaygındır. Doğru bir şekilde hastalık kuruluş ve ilerleme yansıtmak, küçük hayvan modelleri ev sahibi-patojen etkileşimleri diseksiyon ve enfeksiyon bağışıklık nesil izni. Farelerde, uropathogenic E. coli, topluluk % 85'den fazla sorumlu ajan İntravezikal korumak iye satın, insanlarda gözlenen enfeksiyon aşamalarında birçoğu beyannamedir. Yakın zamana kadar ancak, iye sadece dişi hayvanlarda örnek alınarak. Bu sınırlama seks ilgili farklar iye yanı sıra kanser gibi diğer mesane patolojiler çalışmanın engel. Burada, kadın ve erkek hayvanlar arasında doğrudan karşılaştırma sağlar erkek fareler aşılamak ve mesane doku enfeksiyonu için ana bilgisayar yanıt-e doğru daha iyi anlamak için bir araç olarak Akış Sitometresi tarafından değerlendirmek için detaylı bir protokol sağlar için bir yöntem açıklanmaktadır. Birlikte, bu yaklaşımların iye ve mesane ilişkili diğer hastalıklarda gözlenen seks önyargıları katkıda ana etkenleri tanımlama yardımcı olacak.
Introduction
İdrar yolu enfeksiyonu (iye) gelişmiş ülkelerde1en sık görülen enfeksiyonlar biridir. Enfeksiyon oranları kadın ve erkekler arasında ventilasyon ve yaşlı2arasında benzer. Premenopozal yetişkin kadın, ancak, topluluk edinilen iye erkekler2,3' e göre büyük ölçüde artan insidansı olması. Bu hastalık öncelikle kadın etkileri göz önüne alındığında bu, temel ve klinik araştırma ezici bir çoğunlukla dişi içinde iye üzerinde odaklanmıştır. Ancak, iye erkeklerde ve çöküşünde önemli sağlık meydan4' tür. Nitekim, iye erkeklerde daha yüksek morbidite ile ilişkili olduğundan, bu enfeksiyonların rutin olarak karmaşık4,5olarak tanımlanır.
Seks önyargıları fizyolojisi ve patoloji merkezi rol anlayışımızı geliştikçe, yeni yöntemleri hastalığın daha önce ihmal edilen bu yönünü keşfetmek için gereklidir. Cinsiyet farklılıkları dokunulmazlık ve enfeksiyon önemli bir rol oynamak; Erkekler bazı enfeksiyonlar, tüberküloz, sıtma ve HIV6,7gibi daha duyarlı iken kadın otoimmün hastalığı, yüksek insidansı olması. Mesane kanseri, başka bir patoloji dahi, önemli ölçüde daha kadınlarda erkeklerde yaygındır ve çeşitli çalışmalar malignite8,9,10,11 gelişiminde bir rol androjenler için göstermiştir ,12. Özellikle, ancak, soruşturma için mesane kanseri intravezikal tedavilerin sadece art arda erkek fareler13catheterize yetersizlik nedeniyle kadın hayvanlarda gerçekleştirilir.
İYE Patogenez çalışmanın ağır enfeksiyon (örneğin, fare ve sıçanlar) kemirgen modellerde dayanmaktadır. İYE fare modelleri istihdam uropathogens aslında izole--dan uropathogenic E. coli (UPEC) gibi insan hastalık Klebsiella, enterokok, Staphylococcusveya Proteus14. Genellikle, bakteri mesane yolu ile Kateterizasyon, üretra tanıtıldı. Enfeksiyon, mesane ve böbrek enfeksiyonu bakteriyel kolonizasyon, doku hasarı veya konak immün yanıt15,16gibi belirli parametreleri değerlendirmek için kaldırılabilir. Evrensel olarak, ancak, sadece kadın hayvan iye araştırma için kullanılır. Gerçekten de, birçok çalışma anatomik nedenlerden dolayı erkek farelerin Kateterizasyon değil mümkün13,17,18,19olduğunu, gözlemlemekteyiz. Daha yakın zamanlarda, erkek korumak için bir cerrahi yaklaşım tarif edilmiştir, hangi karın açıldığında, mesane dışarıdan karın açılması için hafif basınç uygulayarak yerlerinden olduğunu ve bakteri mesane20enjekte edilir. Bu yaklaşım erkek enfeksiyon, cerrahi müdahale pahasına sağlar. Böylece, bu yaklaşımın önemli bir ihtar iltihap, enfeksiyon gibi bir anti-inflamatuar yara iyileşmesi yanıt kesi21ikna etmek için potansiyel sonucu üzerinde etkisi içerir. Seks önyargı yanıt hastalığı olarak anlamak bizim ilgi alanları arasında bulunmaktadır, biz daha fazla kadın kemirgen22 kullanılan köklü ameliyatsız transüretral yaklaşımı eşlenen bakteriyel İntravezikal korumak erkek farelerde bir yöntem geliştirdi .
Bizim modeli kurulan bir metodoloji oluşturur ve doğrudan iye ana bilgisayar bağışıklık yanıtı kadın ve erkek hayvanlarda karşılaştırmak için yeteneği sağlar. Bu yöntem seks tabanlı farklılıklar enfeksiyon diseksiyon izin ve duyarlılık telaffuz farklılıkları moleküler ve hücresel ipuçları ve yanıt enfeksiyon cinsiyetler arasında potansiyel olarak sunuyoruz. Ayrıca, bu model iye çalışmaları, mesane kanseri, prostatit, altında - veya aşırı - aktif mesane sendromu ve interstisyel sistit gibi mesane ilişkili diğer hastalıkları araştırmak için modeller kurulması izin öteye değer vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare deneyler protokol numarası 2012-0024 onaylanması uygun olarak tarafından Comite d'éthique tr expérimentation animale Paris Merkezi et Sud (hayvan deney Etik Komitesi), uygulama Avrupa Yönergesi 2010/63 AB.
1. kateter hazırlanması
- Bir Pediatrik Intravenous-access kanül bulaşması için fareler her grup için hazırlamak. Dahili bahar mekanizmasını kullanarak, her kanül, iğne, üretici tarafından talimat olarak kurtarmak. Sadece plastik intravenöz kanül koruyarak iğneler, atın.
- Sunar laminar akış başlıklı bir morötesi (ultraviyole) döngüsü için genellikle 25-30 dakika sterilize.
Not: yeni bir kateter deneysel grupları, cinsiyet veya bakteri suşları arasında kullanılması gerektiğini ancak Kateterler birden fazla fare için kullanılabilir.
2. hazırlanması Uropathogenic E. coli enfeksiyonu
- En az iki gün önce enfeksiyon, çizgi UPEC Luria suyu (LB) agar plaka üzerine donmuş bir bakteri stoktan bir steril aşılama döngü kullanarak, uygun antibiyotik içeren. 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Tabaklar 4 ° C'de bir hafta kadar saklanabilir.
- 100 ml steril Erlenmeyer şişeye 10 ml LB, uygunsa, bir koloni LB plaka ile antibiyotik içeren aşılamak ve 37 ° c gece (yaklaşık 16-18 saat) ayakta kuluçkaya.
Not: Ayakta kültürler enfeksiyon23için gerekli olan 1 pili, ifade türü izin verir. Sallayarak yetiştirilen kültür-ecek-si olmak daha az verimli pili ifade ve bu nedenle, enfeksiyon tutarsız oranları. - Gecede kültür optik yoğunluk (OD)600 ölçmek ve önceden belirlenmiş büyüme eğrisi kullanarak ml başına bakteri sayısını hesaplayın. Örneğin, UPEC zorlanma UTI89, OD gibi600 = 0,35 2 x 108 CFU ml, böylece, bir gecede kültür bir OD600 ile başına eşdeğerdir = 2,4 13,7 x 10 için eşdeğer olur8 CFU başına ml. ampirik arasındaki ilişkiyi belirlemek OD600 ve canlı bakteri enfeksiyonu için istihdam her yeni gerginlik ile.
-
Bakteri miktarı hayvan sayısı dikkate alınarak bulaşması için gerekli ve her fare yaklaşık 107 koloni oluşturan birim (CFU) alması gereken 50 μl PBS belirler. Kateter ve şırınga esas ve inoculum belirlemek için gereken 100 µl ~ 130 µl ölü hacmi hesaplamaya dahil.
- 17.000 x g 1 dk. için de bir masa üstü microcentrifuge bakteriyel süspansiyon spin ve 2 x 108 CFU PBS ml başına elde edilen bakteriyel Pelet resuspend. Seri olarak bir aliquot bu süspansiyon ve antibiyotik uygunsa her enfeksiyon için tam inoculum belirlemek LB agar tabağa oranında seyreltin.
- Bakteriyel inoculum 1 ml şırınga çekmek ve kateter şırınga sonuna eklemek. Herhangi bir hava kaldırmak ve pistonu korumak başlamadan önce kateter içinde ölü hava alanı doldurmak için bunalıma girmek için şırınga dokunun.
3. fareler hazırlanması
- Fare ile mayi enjeksiyon 100 mg/kg ketamin ve 5 mg/kg xylazine anestezi. Ek ısı sağlanabilir.
- Orta basınç ile footpad sıkarak her fare tamamen sakin olun. Ne zaman onlar tepki ve bu durum ulaşmak için 3-5 dk gerektiren fare tamamen yatıştırıcı.
- Fareler sırtüstü yerleştirin ve idrar mesane boşaltmak için alt karın orta basınç uygulayın. Tam mesane ileac crests arasında cilt altındaki bir bezelye gibi hissediyorum.
Not: İnhale isoflurane dişi fareler15,22catheterize için kullanılan, erkek farelerin yeterince bu yordam için inhale isoflurane tarafından anestezi olup olmadığını ancak, bunu test edilmemiştir.
4. dişi farelerin transüretral korumak
- Sigara dominant el kullanarak, kuyruk ve bir parmak fare karın üzerinde aynı el başparmak yer ve yön fare sıkıca tutmak için karşıt olarak hafif basınç uygula.
-
Kateter ucu fare dikey üretral orifis yerleştirin. Böylece çalışma yüzeyine paralel aynı anda şırınga düşürürken üretral orifis hub karşılayıncaya kadar hafif basınç ile kateter üretra kaydırın. Kateter yağlamaya gerektirir. İtmek veya kateter üretra zorlamak değil. Kateter sorunsuz ve kolay bir şekilde az direnç ile üretra kaydırın.
- İnoculum (Adım 4,3), bir kez daha önce instilling kateter, yavaşça fare ile sigara dominant üzerinden parmak başkanı doğru karın deri el çekme fare (Adım 4.1) karın bölgesinde zaten çok olduğu yerde. Kateter üretra, ise kateter vajina içinde hatalı yerleştirilmişse, doku yukarı ve kateter uzak hareket edecek, ancak üretra orifis birçok parçalardan oluşan doku, hareket etmez. Bu hızlı test her fare üzerinde yapılmalıdır.
- Kateterin hub üretral orifis karşılar, yavaş yavaş bakteriyel inoculum 50 µl dağıtmak. Bir yavaş korumak oranı vesikoüretral reflü böbrek en aza indirir. Yavaş yavaş kaçağı, 5 sayısı önlemek için kateter kaldırın. Fareler onların kafes sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
5. erkek farelerin transüretral korumak
- İki başparmak forseps fare dış genital için cranially ve caudally yerleştirin. Tam glans penis ortaya çıkarmak için sünnet derisi geri çek. Bir kez penis harici olarak konumlandırılmış, başparmak forseps serbest bırakın.
- Yavaşça ama tautly org tutan hayvan için dikey çıkıntılı penis dengelemeye forseps yeniden konumlandırın. Üretral verin görselleştirmek ve dikkatli bir şekilde organ ucundaki küçük açılış içine kateter tanıtmak. Yavaşça kateter penis nazik gerginlik Forseps ile sürdürmek fare, vücut doğru yol. Kateter yağlamaya gerektirir. Kateter penis zorla itmeyin; Kateter sorunsuz doğru yerleşim gösteren üretra, slayt.
- Kateterin hub penis ucuna karşılayan bir kez penis konumunu koruyarak çok yavaş inoculum 50 µl dağıtmak. Korumak kalitesini bu Şekil 2' de gösterildiği gibi bir önceden belirlenmiş korumak kalite puanı göre şu anda görülebilir.
- Kateter yavaş yavaş, 5 inoculum kaçağı önlemek için bir sayı üzerinde geri çek. Fareler onların kafes sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Hayvanlar 30-45 dk yönetim anestezi takip kurtarmak başlamalıdır.
6. CFU virüslü organlarında tespiti
- Önceden belirlenen zaman-noktalarda, kurban fare kullanarak standart işletim yordamlar (örneğin, servikal yerinden çıkması veya karbon dioksit aşırı doz) onayladı. Karın kirlenme kürk tarafından en aza indirmek için iyice % 70 etanol ile nemlendirin.
- En az 2 cm makas kullanırken fare karın alt üçüncü bir kesi yapın ve aseptik mesane ve diğer istenen organları da dahil olmak üzere ama bunlarla sınırlı olmamak üzere, böbrekler, testis, seminal veziküller veya Prepusyal bezleri, 5 ml kaldırın Polipropilen ek kap içeren 1 ml steril PBS tüpleri. Tüm örneklerini buz üzerinde tutun.
- Kadar neredeyse hiçbir sağlam doku kalır, yaklaşık 15-60 sn organ bağlı olarak organları ile el homogenizer homojenize. Yağ de homojenize değil ve parlak bej beyaz doku kolayca tanınabilir. Önce yağ veya aşağıdaki homojenizasyon atmak. PBS arasında ardından etanol homogenizer yıkayın her deneysel veya organ grup.
Not: Genellikle, el homogenizers veya boncuk değirmen homogenizers kullanın. Tüm bu sistemler, 24 saat sonrası enfeksiyon, bakteriyel CFU doğrudan karşılaştırma tarafından belirlenen benzer sonuçlar vermiştir iken ana bilgisayar doku bakteriyel canlılığı koruyarak homojenize için en uygun koşulları ampirik olarak daha önce tespit edilmelidir Bu iletişim kuralı düzenli olarak gerçekleştiriliyor. - Seri dilutions homojenize organ süspansiyonlar gerçekleştirin. Plaka dilutions LB Ağar Kaplamalar, uygun olduğunda, antibiyotik içeren tarih ve kuluçkaya geceleme (~ 15 saat) 37 ° C'de UPEC suşları çok hızlı katlama kez ve bu nedenle, bu yeteneği bireysel kolonileri saymak için engel olacak çünkü Ağar kaplamalar çok uzun kuluçkaya değil için özen gösterilmelidir.
7. akış sitometrik analizinde mesane doku
- Collagenase 34 adet/mL ve 100 µg/mL, PBS, Dnaz içeren sindirim arabellek hazırlayın. Buz üstünde tutun. Çözümlenmesi için hayvan başına bir 15 ml konik tüp ve boru başına aliquot 1 ml sindirim arabellek hazır olun.
- Önceden belirlenmiş timepoints kurban fare kullanarak standart işletim yordamlar (Örneğin, servikal yerinden çıkması veya karbon dioksit aşırı doz) onayladı. Karın kirlenme kürk tarafından en aza indirmek için iyice % 70 etanol ile nemlendirin.
-
En az 2 cm makas kullanırken fare karın alt üçüncü bir kesi yapın ve tüm mesane kaldırın. Makas mesane 2-3 mm2 boyutlu parçalar, tipik olarak yaklaşık 8 adet kesilmesi de kıyma.
- Bir kıyılmış mesane sindirim arabellek içeren tüp başına ekleyin. Kıyılmış mesane doku sindirim ara belleğe yıkamak için salla. Tüm bladders disseke ve kıyılmış kadar buz üzerinde tutun.
- 60-75 dk 37 ° C'de dinç el sallayarak için 5 ile kıyılmış sidiktorbası kuluçkaya s her 15dk. Doku ıslak kağıt mendil, benzeyen bir cam gibi saydam görünüme kavuştuğunda sindirim tamamlanır. Uzun süreli sindirim yüzey proteinleri tanımlama için gerekli hücrelerden kaldırır ve kaçınılmalıdır.
- Sindirim enzimleri buz gibi Akış Sitometresi arabellek (%2 fetal sığır serum (FBS) ve 0.2 mM EDTA içeren PBS) 2-3 mL ekleyerek devre dışı bırakın ve karışımı yavaşça. Tüpler Buza koyun.
- Bir tek hücre süspansiyon emin olmak için ve herhangi bir bağ dokusu kaldırmak için tüp içeriğini 15 mL konik tüpü içinde 100 µm filtre geçişi. Yavaşça kalan herhangi bir doku enjektör pompası sonu ile filtre aracılığıyla tuşuna basın. Filtre bir ek 2 mL Akış Sitometresi arabellek ile yıkayın. Örnekleri buz üzerinde tutun.
- Örnekleri tarafından 200 x g, 4 ° c de 7 dk aralıklarla yıkamak Granül 5 µg/mL ve bir 96-kuyu alt plaka yuvarlak aktarmak için seyreltilmiş 100 µL Akış Sitometresi arabellek içeren Fc bloğu, resuspend. 10-15 dakika sonra her örnek için 100 µL istenen antikor kokteyl ekleyin. Örnekleri için 30-45 ışıktan korunan min, buz üzerinde kuluçkaya.
Not: Fc Fc reseptör ifade hücreleri antikor Fc bölümünü bağlama önlemek için kullanılan bir reaktif bloktur. Spesifik olmayan antikor bağlama en aza indirmek için hazırlanmıştır. Kullanmak için antikor tayini denemede test edilen hipotez üzerine bağlı olacaktır ve edebiyat adresinden giriş ile seçilmelidir. Şekil 3' te, genel olarak bağışıklık hücre infiltrasyonu ölçmek için bir anti-CD45 antikor, bir pan-bağışıklık hücre proteini olan istihdam edildi. - Örnekleri tarafından 200 x g, 4 ° c de 7 dk aralıklarla yıkamak Hücre topakları 200 µL Akış Sitometresi arabellekte resuspend ve örnekleri 5 ml polistren tüp üzerinde bir Akış Sitometresi edinme önce 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
- Tüm örnek Akış Sitometresi toplamak. İyi bir sindirim 8.000-10.000 CD45 ile 200.000-400.000 hücre verim+ bağışıklık hücreleri enfekte organları daha fazla içerir iken saf fare mesane, hücreleri16 (şekil 3).
Not: akış sitometrik çözümlemesi için hazırlanan örnekleri CFU değerlendirmek için kullanılamaz. Bu mesane o UPEC kolonizasyon göstermek için hiçbir kanıt yok veya bağışıklık hücre infiltrasyon doku tek tip olarak iki parçaya bölmek için tavsiye edilmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı gelişiminde, tabur kadın ve erkek C57Bl/6 farelerin aşılanan ve bakteri yükü 1 saat için 30 gün arasında değişen zaman noktalarda mesane içinde değerlendirilen edildi 6 ila 8 hafta yaşlı. Bu çalışmaların sonuçlarını başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır (Zychlinsky Scharff vd., bekleyen). Burada, temsilcisi veri--dan 24 saat hastalık mevcut. Özellikle, bakteriyel yük eşdeğer 24 saat sonrası enfeksiyon (şekil 1), erkek ve dişi fareler arasında değildi. Bakteriyel yük küçük varyasyon her grup 24 saat sonrası enfeksiyon, dişi fareler15,16' bildirilmiştir için benzer içinde gözlendi.
Bakım için yeterince boş mesane idrar enfeksiyonu önce alınırsa, inoculum önemli kaçak dişi farelerde nadiren görülmektedir. Ancak, erkek farelerin içine korumak önemli miktarda bakteriyel inoculum özellikle bu protokolü geliştirme aşaması sırasında üretra sızıntı sonuçlandı. İnoculum enfeksiyon zaman kaybı kolonizasyon veya enfeksiyon kurulması etkilenen belirlemek için her korumak için bir derecelendirme sistemi çalıştırmaya başladık. Her korumak 1-5 bir ölçekte attı, 1 en uygun ve bakteriyel kolonizasyon olmakta kararlı 24 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 2, kutu). Süre bu sistem araştırmacı bağımlı, ve bu nedenle, potansiyel olarak öznel, bu çalışmanın birincil yazar hemen korumak enfekte mesane içinde bakteri yükü değerlendirilmesi önce aşağıdaki puanları kararlı. Diğer her sütunun ortalama sıralamasına her sütun sırası ortalama karşılaştırma parametrik olmayan bir Kruskal-Wallis testi tarafından değerlendirildi gibi farklı korumak puanları, hayvanlardan elde edilen CFU arasında istatistiksel olarak anlamlı fark var (p = 0.17) ve bir Dunn'ın testi kullanılarak birden çok karşılaştırmalar için düzeltme. Bu analiz, bu o suboptimal söylenebilir instillations (skor > 3), bakteriyel inoculum önemli sızıntı sırasında enfeksiyon sonucu, 24 saat (Şekil 2, grafik), bakteriyel kolonizasyon önemli ölçüde etkisi değil. Özellikle, tecrübesiyle, erkek farelerde sızdırdığı sıklığını önemli ölçüde azalmış.
Son olarak, doğrudan UPEC bağışıklık yanıtı kadın ve erkek hayvanlarda karşılaştırmak için bu model geliştirme hedefi oldu. Hücresel infiltrasyon iye, CD45 sayısı cevaben cinsiyetler arasında değişmiş olup olmadığını sınamak için+ bağışıklık hücreleri naif ve kadın ve erkek farelerin virüslü birlik içinde Akış Sitometresi tarafından değerlendirilen. Bağışıklık hücreleri saf hayvanlarda mevcut kadın ve erkek fareler arasında farklı etmese (p = 0,95), mesane içine infiltrasyonu virüslü dişi fareler istatistiksel olarak anlamlı bir artış oldu (p 0.0015 =) (Şekil 3A-B).
Şekil 1: UPEC eşit etkinlik ile kadın ve erkek mesane Colonizes. Altı 8 hafta yaşlı kadın ve erkek C57Bl/6 fareler için 10 ile telkin7 UPEC CFU. 24 saat sonrası enfeksiyon, mesane aseptik vardı bakteriyel yük numaralandırmak için kaldırıldı. Arsa CFU/mesane gösteriyor. Her nokta bir fare, gösterilen 5 temsilcisi deneme olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Korumak kalite değil 24 saat sonrası enfeksiyon bakteri yükü ile ilişkilendirmek. Altı 8 hafta yaşlı kadın ve erkek C57Bl/6 fareler için 10 ile telkin7 UPEC CFU. Hemen her korumak sonra tek bir araştırmacı, bir kalite puanı belirli ölçüt (kutulu metin) korumak için atanmış. 24 saat sonrası enfeksiyon, mesane aseptik vardı bakteriyel yük numaralandırmak için kaldırıldı. Atanan kalite puanı karşı CFU/mesane arsa gösteriyor. Her nokta bir fare, 5 havuza alınan deneyler gösterilir. p 0.17, Kruskal-Wallis testi öğleden hoc Dunn'ın testi birden çok karşılaştırmalar için ile her diğer sütunun ortalama sıralamasına her sütun sırası ortalama karşılaştırma =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Bağışıklık hücre infiltrasyonu iye cevaben dişi farelerde arttı. Altı yaşlı kadın ve erkek C57Bl/6 fare telkin 8 hafta veya 10 ile değil7 UPEC CFU. Temsilcisi nokta araziler tasvir CD45 içeren toplam mesane hücreleri+ bağışıklık hücreleri pembe gelen saf geçişli ya da enfekte fareler. Grafik CD45 mutlak sayısını gösterir+ bağışıklık hücreleri sidiktorbası saf veya 24 saat enfekte fareler. Her nokta bir fare, 2 havuzlu deneyler gösterilir. p-değerleri Mann-Whitney test tarafından belirlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erkek farelerin transüretral korumak seks etkisi mesane Mukozal hastalık içine birçok yeni araştırma fırsat sunuyor, ama aynı zamanda çeşitli sorunlar sunar. En önemlisi, bir kısıtlamadır korumak başlangıçta aşırı iltihap kateter ekleme sırasında ortaya çıkan teknik olarak zor olduğunu kanıtlayabilir. Teknik iyileştirme Evans mavi boya gibi renkli bir çözüm ile ölü fareler korumak elde edilebilir. Korumak başarılı olduğunu doğrulamak için mesane görsel olarak kontrol edilmelidir ve aşılanan sıvı hacmi çıkarma tarafından tüberkülin şırınga ile değerlendirilebilir. Yavaş, yumuşak hareketler önemini ardı edilemez: hiçbir direniş ve kateter eklemek için bu aşırı inflamasyon ve doku hasarı sonucu olarak kullanılan hiçbir kuvvet olmalıdır. Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, kateter zahmetsizce üretra kaydırın. Direnç veya tıkanıklık hissedilir, kateter kaldırıp ekleme deneyin en iyisi.
Korumak için bakteri yükü 24 saat sonrası enfeksiyon kalitesini birleştiriliyor tarafından biz kusurlu bir tekniği, bakteriyel inoculum az miktarda olduğu kayıp enfeksiyon, zaman hala sağlam kolonizasyon içinde sonuçlar gösterdi Mesane. Bu protokolü kullanmak, bir dedektif sızıntısı Alerjik instillations elde etmek amacı olmalıdır. Ancak, yordamı sağlamlık kusurlu instillations hala yararlı verileri ve yorumlanabilir sonuçları sağlayacaktır sağlar.
Erkek mesane enfeksiyonu, tek yayımlanmış alternatif yol büyük avantaj bizim tekniği, non-invaziv, cerrahi olmayan bir yaklaşımdır. Transüretral korumak kullanarak bizim yaklaşım mesane için karın yapısal bütünlüğünü bozmadan fizyolojik yönlendirme idrar yolu takip eder. Olson ve arkadaşları20tarafından açıklanan invaziv tekniği, cerrahi işlemler, iltihap, şifa, Gecikmeli de dahil olmak üzere ve sonuç skar dokusu doğal faktörler içerir. Organizmanın cerrahi travma enfeksiyon özellikle ilgili bağışıklık yanıtının çalışmaları ile ilgili olarak yanıttır. Bu pro-inflamatuar bir ortamın ve potansiyel doku granülasyon gibi bir anti-inflamatuar yara iyileşme programı oluşumu iyileşme sürecinin bir parçası olarak içerir. Bu faktörler deneysel ayarındaki istenmeyen etkiler gösterir.
Son olarak, gelecek çalışmalar seks etkisi mesane enfeksiyonu gibi Mukozal hastalık adresleme için uygulanan iye boyunca erkek ve kadın bağışıklık yanıtı doğrudan karşılaştırma sağlar bir yöntem geliştirmek için bu çalışmanın amacı yapıldı ve kanser Biyoloji. İkinci ayrı bir avantaj, yöntem tanımlamak burada dişi farelerde on yıl19için kullanılan aynalar. Böylece, bu teknik ile erkek farelerde yapılan deneyler mevcut araştırma geniş bir vücut için karşılaştırılabilir. Deneylerimiz yanıt farklar vardır ve bu farklılıkların seks tabanlı eşitsizliklerin yanıt olarak Mukozal enfeksiyonlar, hem de diğer hastalıklar mesane anlamak için ipuçları sağlayabilir indirdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Dr Matthieu Rousseau bu protokolü ve proje geliştirilmesi sırasında el yazması ve laboratuvar dendritik Immunobiology onların yararlı anlayışlar için eleştirel okuma için teşekkür ediyoruz. Bu eser kısmen Avrupa Birliği yedinci çerçeve programı Marie Curie eylem (PCIG11-GA-2012-3221170 ve IMMUNO-Onkoloji LabEx (MAI). finansman tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0.7 mm external diameter, 14 mM long | BD Medical | 381811 or 381411* | * catalog number is country-dependent |
| inoculating loop | Greiner Bio-One | 731171 | |
| LB Miller broth | Difco | 244620 | |
| LB Miller agar | Difco | 244520 | |
| Cuvettes | Bio-rad | 223-9955 | |
| syringes | B Braun | 9166017V | |
| Thumb (Adson) forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 5 ml tubes, polypropylene | Falcon | 352063 | |
| Tissue Ruptor disposable probes | Qiagen | 990890 | |
| 15 ml flip cap tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| DNAse | Invitrogen | 18047019 | |
| Liberase TM | Sigma-Aldrich | 5401119001 | should be aliquotted and stored at -20 °C to avoid repeated freeze-thaw |
| 100 µM MACS SmartStrainers | Miltenyi | 130-098-463 | compatible with 15 ml tubes, preferred |
| 100 µm cell strainers | Falcon | 352360 | compatible with 50 ml tubes, if MACS Smart Strainers are not available |
| 96 well plate | Falcon | 353077 | |
| Fc block | BD Pharmingen | 553142 | anti-CD16/CD32 |
| anti-mouse CD45 antibody | BD Biosciences | 561487 | many different fluorescent conjugation options are available |
| 5 ml tubes polystyrene with filter cap | Falcon | 352235 | |
| insulin syringe | Terumo | BS05M2913 | |
| hand held homogenizer | Qiagen | 9001272 | TissueRuptor |
| flow cytometer | BD Biosciences | N/A | Fortessa SORP |
| Flow cytometry software | BD Biosciences | N/A | Diva |
References
- Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11 (3), 551-581 (1997).
- Harper, M., Fowlis, G. Management of urinary tract infections in men. Trends in Urology, Gynaecology & Sexual Health. 12 (1), 30-35 (2007).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat Rev Urol. 7 (12), 653-660 (2010).
- Lipsky, B. A. Urinary tract infections in men. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis, and treatment. Ann Intern Med. 110 (2), 138-150 (1989).
- Conway, L. J., Carter, E. J., Larson, E. L. Risk Factors for Nosocomial Bacteremia Secondary to Urinary Catheter-Associated Bacteriuria: A Systematic Review. Urol Nurs. 35 (4), 191-203 (2015).
- Markle, J. G., Fish, E. N. SeXX matters in immunity. Trends Immunol. 35 (3), 97-104 (2014).
- Yu, C. Y., Whitacre, C. C. Sex, MHC and complement C4 in autoimmune diseases. Trends Immunol. 25 (12), 694-699 (2004).
- Castelao, J. E., et al. Gender- and smoking-related bladder cancer risk. J Natl Cancer Inst. 93 (7), 538-545 (2001).
- Donsky, H., Coyle, S., Scosyrev, E., Messing, E. M. Sex differences in incidence and mortality of bladder and kidney cancers: national estimates from 49 countries. Urol Oncol. 32 (1), 40-e31 (2014).
- Garg, T., et al. Gender Disparities in Hematuria Evaluation and Bladder Cancer Diagnosis: A Population-Based Analysis. J Urol. , (2014).
- Dobruch, J., et al. Gender and Bladder Cancer: A Collaborative Review of Etiology, Biology, and Outcomes. Eur Urol. , (2015).
- Hsu, J. W., et al. Decreased tumorigenesis and mortality from bladder cancer in mice lacking urothelial androgen receptor. Am J Pathol. 182 (5), 1811-1820 (2013).
- El Behi, M., et al. An essential role for decorin in bladder cancer invasiveness. EMBO Mol Med. 5 (12), 1835-1851 (2013).
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 113, Suppl 1A. 05S-13S (2002).
- Ingersoll, M. A., Kline, K. A., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. G-CSF induction early in uropathogenic Escherichia coli infection of the urinary tract modulates host immunity. Cell Microbiol. 10 (12), 2568-2578 (2008).
- Mora-Bau, G., et al. Macrophages Subvert Adaptive Immunity to Urinary Tract Infection. PLoS Pathog. 11 (7), e1005044 (2015).
- Oliveira, P. A., et al. Technical Report: Technique of Bladder Catheterization in Female Mice and Rats for Intravesical Instillation in Models of Bladder Cancer. (Conference Title)39th Scand-LAS and ICLAS Joint Meeting. 36, 5-9 (2009).
- Seager, C. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Hagberg, L., et al. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin). Infect Immun. 40 (1), 273-283 (1983).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. J Am Soc Nephrol. , (2015).
- Knipper, J. A., et al. Interleukin-4 Receptor alpha Signaling in Myeloid Cells Controls Collagen Fibril Assembly in Skin Repair. Immunity. 43 (4), 803-816 (2015).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Development of intracellular bacterial communities of uropathogenic Escherichia coli depends on type 1 pili. Cell Microbiol. 9 (9), 2230-2241 (2007).
