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Neuroscience

Énumération des cellules souches neurales utilisant clonales Assays

doi: 10.3791/54456 Published: October 4, 2016

Summary

Les cellules souches neurales (NNC) se réfèrent à des cellules qui peuvent se renouveler et de se différencier en trois lignées neurales. Ici, nous décrivons un protocole pour déterminer la fréquence NSC dans une population cellulaire donnée en utilisant Neurosphère formation et la différenciation dans des conditions clonales.

Abstract

Les cellules souches neurales (NSC) ont la capacité d'auto-renouvellement et de générer les trois grandes lignées neurales - astrocytes, neurones et les oligodendrocytes. NNC et progéniteurs neuronaux (IP) sont couramment cultivées in vitro comme neurosphères. Ce protocole décrit en détail la façon de déterminer la fréquence NSC dans une population cellulaire donnée dans des conditions clonales. Le protocole commence avec l'ensemencement des cellules à une densité qui permet la génération de neurosphères clonales. Les neurosphères sont ensuite transférées à des lamelles couvre-cloisonnées et différenciées dans des conditions clonale dans un milieu conditionné, ce qui maximise le potentiel de différenciation des neurosphères. Enfin, la fréquence NSC est calculée sur la base de la formation et de multipotence capacités neurosphères. Utilitaires de ce protocole comprennent l'évaluation des candidats marqueurs NSC, la purification de NNC, et la capacité de distinguer NSCs de NPs. Cette méthode prend 13 jours pour effectuer, ce qui est beaucoup sHorter que les méthodes actuelles d'énumérer la fréquence NSC.

Introduction

Les cellules souches neurales (NNC) sont des cellules du système nerveux central (SNC) qui peut auto-renouveler et sont multipotentes. NNC sont d'abord spécifié au cours du développement du cerveau antérieur embryonnaire et continuent à persister dans le cerveau des adultes à des régions spécifiques telles que la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et le gyrus denté (DG) de l'hippocampe. Un certain nombre de lignes NSC sont utilisés dans des essais cliniques pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux et d' autres maladies neurologiques telles que la maladie de Batten 1.

NNC et progéniteurs neuronaux (IP) se propagent dans la culture comme structures flottantes sphéroïdes 3 dimensions appelées neurosphères. Le système de culture de neurosphères a été développée par Reynolds et Weiss au début des années 1990, quand ils ont découvert que les cellules corticales embryonnaires et adultes peuvent se diviser en présence du facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) 2-4. Neurosphères se composent d'un mélange hétérogène de caunes comprenant des sous - classes à différents stades de développement 5. Il est difficile d'étudier spécifiquement NSCs en utilisant les données obtenues à partir de neurosphères en raison de la présence d'infirmières praticiennes. Par conséquent, il est crucial d'enrichir NSCs de neurosphères. À l' heure actuelle, quatre méthodes principales ont été utilisées pour enrichir NSCs in vitro. La première est l'utilisation de marqueurs de la surface cellulaire. Lewis-X (LEX) et CD133 (également connu sous le nom Prominin1) sont de surface cellulaire le plus important NSC marqueurs 6-9. Syndécane-1, Notch-1 et de l' intégrine bêta 1 sont d' autres protéines de surface qui viennent enrichir pour NNC 10. Deuxièmement, il y a l'exclusion du colorant. Il a été démontré que les cellules côte-populations, qui ont la capacité unique de pomper le colorant fluorescent de liaison à l' ADN Hoechst 33342, sont enrichies en 11 NNC. Troisièmement, l'utilisation de la sélection morphologique. Il a été démontré que les cellules avec un accroissement de la taille des cellules et la granularité port plus NNC que leurs homologues 5,12,13. La quatrième est l'ajout de NSC suLes facteurs rvival au milieu de culture. Il a été démontré que l' addition de sulfate protéoglycane chondroïtine et améliore la survie apolipoprotéine E NSC et augmente ainsi la fréquence NSC 14,15. Bien que de nombreux marqueurs , y compris les facteurs de transcription ont été associés à 16,17 NNC, aucun de ces marqueurs sont capables d'enrichir NNC à la pureté. En raison du manque de marqueurs NSC définitives, il reste un défi de quantifier NNC et de les distinguer des NPs in vitro.

Les premières études ont utilisé le test de formation de neurosphères (NFA) pour quantifier NSCs 7,11,13. Dans cet essai, les cellules dissociées sont cultivées pour former des neurosphères et le nombre de neurosphères générés pour 100 cellules étalées est déterminé. Cette valeur est nommé comme l'Unité de Formation Neurosphère (NFU). La NFU est égale à la fréquence NSC si tous les neurosphères proviennent de NNC. Cependant, il a été montré que la NFU surestime la fréquence NSC neurosphères sont formées par les deux NSCs et au début de NPs 5. Ainsi, il est inexact d'énumérer NSCs uniquement basée sur la formation Neurosphère. Il pourrait être possible de quantifier NSCs en fonction de leur capacité d'auto-renouvellement, prolifèrent abondamment et générer neurosphères multipotentes.

NNC, qui sont EGF et bFGF sensibles, survivent généralement pendant au moins dix passages et donc afficher une vaste capacité d' auto-renouvellement dans la culture 4,18-20. IP, qui sont EGF et bFGF répondant ainsi, pourrait également générer des neurosphères pour quelques passages, mais pas pour une longue période de temps. Par conséquent, il a été largement admis que NSCs de bonne foi peuvent être énumérés avec une précision équitable basée sur la formation Neurosphère pendant au moins dix passages. Dans la plupart des études, cependant, l'auto-renouvellement est généralement mesurée sur la base de la formation de neurosphères secondaire ou tertiaire en raison de la longue période d'expérimentation nécessaire pour dix passages. Par conséquent, la NFA secondaire peut être utilisé pour comparer globalement la capacité d'auto-renouvellement paripopulations ween, mais ne peuvent pas être utilisés pour énumérer avec précision la fréquence NSC.

NNC ont une plus grande capacité proliférative par rapport à NPs. Cette propriété de NNC a été utilisé par Louis et al. mettre au point un essai pour le dénombrement NSC - le dosage de neurones formant colonie cellulaire (NCFCA) 21,22. Dans cet essai, des cellules isolées sont cultivées pendant 3 semaines dans une matrice semi-solide contenant du collagène. Dans ces conditions de culture, il a été montré que les cellules qui forment neurosphères de plus de 2 mm de diamètre sont tripotent et peuvent se renouveler pour le long terme. Ces cellules sont définies comme NNC. Par conséquent, les NNC sont effectivement distingués des infirmières praticiennes.

NNC ont la capacité de se différencier en astrocytes, les oligodendrocytes et les neurones. Pour la différenciation des neurosphères, les facteurs de croissance sont retirés et le sérum est ajouté au milieu de culture. Si les trois lignées neurales sont observées dans une neurosphère, la cellule qui a initié cette neurosphères is un NSC. Toutefois, le test de différenciation a quelques limitations. En premier lieu, les conditions de culture utilisées pour la différenciation peuvent ne pas être optimal pour la génération des trois lignées neurales. En fait, dans un seul processus de différenciation des neurosphères, la mort cellulaire significative se produit et surtout la génération des astrocytes se produit (Tham M et Ahmed S, non publié). Deuxièmement, il y a la question de la clonalité. Pour le dénombrement précis de NNC, la formation et la différenciation des neurosphères doivent être réalisées dans des conditions clonales, où chaque Neurosphère surgit d'une seule cellule. Dans les cultures de suspension en vrac, l' agrégation se produit aux niveaux cellulaires et neurosphères 23-25. Par conséquent, il est possible pour chaque neurosphères, provenir de cellules ou de neurosphères multiples, ce qui complique le comptage et l'évaluation de multipotence neurosphères. Des données récentes montrent que l'agrégation des cellules ne se produit pas à une faible densité de placage de 0,5 cellules / ul ou au-dessous, et lorsque des plaques de culture ne sont pas déplacées pendant neuformation rosphere 15. Ainsi la culture de cellules à cette faible densité assurerait clonalité.

Actuellement, le NCFCA est la méthode la plus couramment utilisée pour distinguer NSCs de NPs et d'énumérer la fréquence NSC. Le NCFCA, cependant, nécessite un temps relativement long de trois semaines. Ici, nous décrivons un protocole d'énumérer la fréquence NSC basée sur la capacité de NNC pour former neurosphères multipotentes. Ce protocole prend seulement 13 jours pour effectuer. NCFCA assure la clonalité que la matrice de collagène empêche le mouvement des neurosphères. Les conditions de culture utilisées dans ce protocole permet également clonalité d'être maintenue tout au long. Par exemple, l'utilisation de 50 puits lamelles chambré assure que les neurosphères se différencier sans contact les unes avec les autres. De plus, nous utilisons moyenne qui fournit des facteurs neurotrophiques lors de la différenciation pour maximiser le potentiel de différenciation des neurosphères (figure 1) conditionnés.

Protocol

Le traitement des animaux a été réalisée en conformité avec les lignes directrices du IACUC et NACLAR et approuvé par le département des animaux ((http://www.brc.astar.edu.sg/index.php?sectionID-11).
NOTE:
Les cultures de neurosphères ont été préparés à partir du cerveau antérieur de embryonnaire (E14) C57BL / 6 tel que décrit précédemment 5.

1. Culture des exemples neurosphères clonales (Jour 1)

  1. Préparer un milieu de croissance de NSC en combinant Modified Medium / Nutrient Eagle F-12 (DMEM / F12) du milieu de Dulbecco avec un supplément B27 (concentration finale: 1 x), EGF (concentration finale: 20 ng / ml), bFGF (concentration finale: 10 ng / mL) et de la pénicilline / streptomycine (concentration finale: 1 x).
  2. Désolidariser neurosphères E14.5 de souris dans du milieu de croissance 1 NSC ml et 1 ml de 0,05 N d'hydroxyde de sodium pendant 7 min à température ambiante. cellules pipettes haut et en bas de temps en temps pour garder les cellules en suspension. Ajouter 1 ml de 0,05 N d'acide chlorhydrique à neutreiser la substance alcaline.
    REMARQUE: Les cellules de neurosphères sont ensemencées à raison de 20.000 cellules / mL dans une boîte de culture de 10 cm et sont cultivés pendant 5 jours à 37 ° C, 5% de CO 2. Le rendement attendu après est d'environ 10 millions de cellules par boîte de 10 cm. Ces cellules sont ensuite dissociées et ensemencées à une densité clonale comme décrit dans les étapes 1.2 et 1.3, respectivement.
    1. Effectuer le nombre de cellules en utilisant coloration au bleu Trypan et un hémocytomètre.
  3. cellules de neurosphères E14.5 de souris de semences simples à une densité de 50 cellules / ml ou au-dessous de 100 milieu de croissance ul NSC dans un plat de 96 puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 1 w pour générer des neurosphères clonales.
    REMARQUE: La clonalité est assurée lors de la formation de neurosphères à cette densité que les cellules ne sont pas en contact entre eux.

2. Culture de Neurosphères pour milieu conditionné (Jour 3)

  1. Dissocier neurosphères de souris E14.5 comme décrit dans l'étape 1.2.
  2. Seed cellules isolées à partir de E14.5 neurosphères de souris à une densité de 20.000 cellules / ml dans un NSC ml de milieu 10 de croissance dans une boîte de culture de 10 cm. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 5 jours pour générer des neurosphères cultivées en vrac.

3. Préparation du Neurosphère milieu conditionné (Jour 8)

  1. Préparer une solution de revêtement en mélangeant 700 ul de 0,01% de poly-L-lysine (PLL), 70 pi de 1 mg / ml de laminine et 6230 pi de tampon phosphate salin (PBS).
  2. Enduire un plat de culture de 10 cm avec 7 ml de solution PLL / laminine pendant 2 h à 37 ° C.
  3. En utilisant une pipette sérologique de 10 ml, transférer toutes les neurosphères cultivées en vrac à un tube de 15 ml conique de centrifugeuse. Centrifuger les neurosphères à 171 g pendant 1 min à température ambiante et retirer le surnageant complètement.
  4. Préparer le milieu de différenciation NSC en combinant milieu DMEM / F12 avec B27 (concentration finale: 1x) et de sérum bovin fœtal (FBS) (concentration finale: 0,5%) Add 10 ml de NSC milieu de différenciation pour neurosphères. Pipeter haut et en bas à quelques reprises pour remettre en suspension les neurosphères.
  5. Aspirer PLL / laminine de la boîte de culture de 10 cm et laver une fois avec 10 ml de PBS. Transférez tous les neurosphères à la boîte de culture 10 cm PLL / laminine-enduit. Incuber O / N à 37 ° C, 5% de CO 2 pour les neurosphères à adhérer à plat.

4. Détermination de la NFU de l'échantillon Neurosphères (Jour 8)

  1. Comptez le nombre de neurosphères (ensemencées le jour 1, la section 1) formée dans chaque puits sous un microscope.
    NOTE: Déterminer le nombre de neurosphères formés pour 100 cellules étalées, qui donne la NFU.

5. Transfert de Neurosphères exemples à 50 puits Chambered Coverslip (Jour 8)

  1. Enrober chaque puits d'une lamelle 50 puits chambré avec 10 pi de solution de revêtement PLL / laminine pendant 2 h à 37 ° C.
    NOTE: Préparer la solution de revêtement comme décrit dansl'étape 3.1.
  2. Préparer 3 x 50 ml tubes coniques à centrifugation contenant 30 ml de PBS chacun. En utilisant des pinces stériles, retirer le enduit lamelle 50 puits chambré. Tremper la lamelle chambré dans le premier tube de PBS, puis la seconde, puis la troisième tube de PBS pour éliminer par lavage la solution de revêtement.
  3. Aspirer tout liquide restant dans les puits de la lamelle couvre-objet chambré.
  4. pipette doucement tout moyen et neurosphères de chaque puits du plat de 96 puits et de le transférer à une seule boîte de culture de 10 cm.
  5. Sous un microscope, choisir un Neurosphère d'échantillon à l'aide d'une micropipette P10 équipée d'une pointe de pipette 10 pi. Faire en sorte que seulement une seule neurosphères est prélevée à chaque fois par le réglage de la colonne de pipette à 2 pi. Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque Neurosphère.
  6. Transférez le Neurosphère sur le centre d'un puits de la enduit lamelle 50 puits chambré.
  7. Répétez les étapes 5.5 et 5.6 jusqu'à ce que chaque puits de la lamelle conta chambréins un Neurosphère.
    REMARQUE: Les neurosphères peuvent être pris sous un microscope placé dans une hotte à flux laminaire ou sur une paillasse.
  8. Ajouter 10 pi de NSC milieu de différenciation à chaque puits de la lamelle chambré. Placez la lamelle chambré dans une boîte de culture de 10 cm et la pipette PBS le long des bords du plat pour éviter le dessèchement du milieu de différenciation NSC. Placez jusqu'à deux lamelles chambrés en une boîte de culture de 10 cm. Incuber la lamelle couvre - chambré (contenues dans la boîte de culture de 10 cm) pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2.

6. Différenciation des exemples Neurosphères (Jour 9)

  1. Transférer le milieu de différenciation des neurosphères cultivées en vrac (à partir de la section 3) à un tube de 15 ml conique de la centrifugeuse. Assurez-vous que 2-3 ml de milieu de différenciation reste dans la boîte de culture pour empêcher les cellules de se détacher adhérées. En utilisant une seringue stérile de 20 mL, passer le milieu de différenciation par un 0,2 μm filtre pour éliminer les cellules ou les débris.
  2. Transférer le milieu de différenciation filtrée revenir à la boîte de culture de 10 cm contenant les cellules adhérentes.
  3. À l'aide d'une pince stérile, placez doucement la lamelle chambré sur le milieu de différenciation d'une manière inversée de sorte que les neurosphères d'échantillons sont orientés vers le bas. Incuber la lamelle couvre - chambré avec le milieu de différenciation pendant 3 jours à 37 ° C, 5% de CO 2.
    REMARQUE: Les échantillons neurosphères sont en contact avec le milieu de différenciation, mais pas en contact avec les cellules qui se différencient en dessous.

7. Fixation de Différenciation Neurosphères (Jour 12)

  1. Retirez délicatement la lamelle chambré de la boîte de culture de 10 cm à l'aide de pinces stériles. tremper délicatement la lamelle dans du PBS pour laver le milieu conditionné.
  2. Décoller le joint de silicone de la lamelle. Effectuez cette doucement et lentement pour éviter de casser la lamelle. Prendre note du côté où the différencié neurosphères sont respectées.
  3. Introduire à la pipette 1 ml de paraformaldehyde à 4% (PFA) sur un morceau de film coupé de la paraffine à la taille de la lamelle. Placez délicatement la lamelle sur le film de paraffine avec les neurosphères tournés vers le bas en contact avec la PFA. Fixer les neurosphères pendant 20 min à température ambiante.
    Attention: PFA est toxique à la fois sous forme liquide et de vapeur et est inflammable. Éviter l'inhalation de vapeurs et le contact avec la peau et les yeux. Toujours manipuler PFA dans une hotte ventilée.
  4. Introduire à la pipette 1 ml de PBS sur un morceau de pellicule de paraffine. Laver les neurosphères en plaçant doucement la lamelle couvre-objet avec les neurosphères vers le bas en contact avec du PBS pendant 10 min à température ambiante.
  5. Répétez l'étape 7.4 deux fois plus.

8. O4 Coloration de Différenciation Neurosphères (Jour 12)

  1. Préparer 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS. Introduire à la pipette 1 ml de BSA à 3% sur un morceau de pellicule de paraffine. Bloquer les neurosphères par Placin doucementg la lamelle couvre-objet (avec les neurosphères vers le bas) en contact avec la BSA pendant 30 minutes à température ambiante.
  2. Introduire à la pipette 1 ml d'anticorps de souris anti-IgM O4 (dilution 1: 300 dans la BSA à 3%) sur un morceau de film de paraffine et placer la lamelle couvre-objet sur la pellicule de paraffine, les neurosphères tournés vers le bas en contact avec l'anticorps. Permettre O4 coloration se produise pendant 2 h à température ambiante.
  3. Laver la lamelle à deux reprises avec du PBS comme décrit dans l'étape 7.4.
  4. Introduire à la pipette 1 ml de conjugué anti-anticorps de souris vert colorant fluorescent d'IgM secondaire (dilution 1: 500 dans la BSA à 3%) sur un morceau de film de paraffine et placer la lamelle couvre-objet sur la pellicule de paraffine, les neurosphères tournés vers le bas en contact avec l'anticorps . Laisser pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
    REMARQUE: Effectuer immunocoloration dans un environnement sombre de cette étape en avant.
  5. Laver la lamelle à deux reprises avec du PBS comme décrit dans l'étape 7.4.

9. Tuj1 et fibrillaire gliale protéine acide (GFAP) Colorationde Différenciation Neurosphères (Jour 12)

  1. Préparer perméabilisation solution en ajoutant du Triton X-100 (concentration finale: 0,5%) à 3% de BSA. Introduire à la pipette 1 ml de solution de perméabilisation sur un morceau de pellicule de paraffine. Placer lamelle couvre-objet sur la pellicule de paraffine, les neurosphères tournés vers le bas en contact avec la solution de perméabilisation pendant 20 minutes à la température ambiante.
  2. Laver la lamelle à deux reprises avec du PBS comme décrit dans l'étape 7.4.
  3. Introduire à la pipette 1 ml de souris anti Tuj1-anticorps IgG2a (dilution 1: 500 dans la BSA à 3%) et de lapin anti GFAP anticorps IgG (1: 1000 dilution dans 3% de BSA) sur un morceau de film de paraffine et placer lamelle couvre -objet sur le film de paraffine, les neurosphères tournés vers le bas en contact avec les anticorps. Et permettent Tuj1 coloration GFAP se produire pendant 2 h à température ambiante.
    REMARQUE: Les deux anticorps peuvent être préparés sous forme d'une solution unique.
  4. Laver la lamelle à deux reprises avec du PBS comme décrit dans l'étape 7.4.
  5. Pipette 1 ml de colorant fluorescent rougeconjugué anti-souris IgG 2a (dilution 1: 500 dans la BSA à 3%) et du rouge lointain colorant fluorescent conjugué anti-IgG de lapin (dilution 1: 500 dans la BSA à 3%) des anticorps secondaires sur un morceau de film de paraffine et placer lamelle couvre-objet sur la pellicule de paraffine, les neurosphères tournés vers le bas en contact avec les anticorps. Laissez pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE: Les deux anticorps peuvent être préparés sous forme d'une solution unique.
  6. Laver la lamelle à deux reprises avec du PBS comme décrit dans l'étape 7.4.
  7. Diluer la solution 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) disponible à 300 nM dans du PBS. Introduire à la pipette 1 ml de DAPI sur un morceau de film de paraffine et placer lamelle couvre-objet sur la pellicule de paraffine avec les neurosphères tournés vers le bas en contact avec le DAPI pendant 2 minutes à température ambiante pour la coloration des noyaux.
  8. Laver la lamelle une fois avec PBS et deux fois avec de l'eau déminéralisée comme décrit dans l'étape 7.4. Monter la lamelle sur une lame de verre à l'aide d'un support de montage approprié et laisser sécher O / N à la température ambiante.

10. Imaging de Différenciation Neurosphères (Jour 13)

  1. neurosphères Image sous un microscope confocal en utilisant un 40X. Utilisez les lasers à 488 nm, 594 nm et 647 nm pour détecter les oligodendrocytes et les astrocytes, neurones, respectivement.
  2. Déterminer le pourcentage de unipotents, bipotentes et tripotent neurosphères.
    REMARQUE: L' activité est déterminée par la capacité de se différencier en neurosphères les trois lignées neurales - oligodendrocytes, des neurones et des astrocytes 5,14,15,26. Les oligodendrocytes sont identifiés par une coloration positive pour O4 (section 8). Les neurones sont identifiés par une coloration positive pour Tuj1 (article 9). Les astrocytes sont identifiés par une coloration positive pour GFAP (article 9). A Neurosphère unipotent se différencie en un seul de la lignée et devrait positivement tacher soit pour O4, GFAP ou Tuj1. Un Neurosphère de bipotente différencie en tout deux lignées et devrait positivement tacher pour O4 et GFAP ou O4 et Tuj1 ou GFAP et Tuj1. A Neurosphère de tripotent différenteIates dans les trois lignées et devrait positivement tacher pour O4, GFAP et Tuj1.
  3. Déterminer la fréquence NSC dans la population d'intérêt en utilisant la formule suivante:
    fréquence NSC = (NFU x% de neurosphères de tripotent) / 100%.

Representative Results

Nous avons utilisé ce protocole pour évaluer la capacité de LeX, une surface cellulaire connue NSC marqueur 7, pour enrichir NSCs. Les données de cette étude seront utilisés pour illustrer comment NSCs sont énumérés en utilisant les analyses clonales dans le protocole. les cellules de neurosphères de souris E14.5 ont été incubées avec un anticorps anti-LEX. Par la suite, les cellules qui expriment LeX (LEX +) et des cellules qui ne se traduit pas LeX (LEX -) ont été ensemencées à raison de 50 cellules / ml par cellule activé par fluorescence (FACS) et gauche pour générer neurosphères clonales pendant 1 semaine. Imagerie time-lapse montre que les neurosphères générés à 50 cellules / ml sont clonale (figure 2). La NFU pour LeX + et LeX - cellules a été déterminée. Il est montré que les cellules LEX + ont une capacité nettement plus élevée de formation de neurosphères par rapport à LEX - cellules (figure 3g). Les neurosphères générés ont ensuite été différenciéesdans des conditions clonales, par la suite immunocolorées et imagée (Figure 3a-e). Cellules LEX + génèrent beaucoup plus de neurosphères de tripotent que LEX - cellules (Figure 3f). La fréquence NSC a ensuite été calculée sur la base du NFU et% des neurosphères de tripotent (figure 3g). Sélection basée sur LeX, enrichit la fréquence NSC de plus de 14 fois, la validation LeX comme marqueur NSC. Nous avons également déterminé la fréquence NSC de neurosphères de souris E14.5 utilisant ce protocole 27 et NCFCA 28. Les deux méthodes indiquent la fréquence NSC comparables d'environ 2% en neurosphères de souris E14.5.

Figure 1
Figure 1. Protocole pour Neurosphère Différenciation sous conditions clonales. Neurosphères des échantillons cultivés dans des conditions clonales sont placés individuellement dans chaque PLL / laminine-coated puits d'une lamelle 50 puits chambré, et a permis d'adhérer O / N. Le même jour, les neurosphères cultivées en vrac sont étalées dans un milieu de différenciation dans une PLL / laminine revêtu de 10 cm, et on les laisse adhérer O / N. Le lendemain, le milieu conditionné à partir des neurosphères cultivées en vrac est filtré et replacé dans la boîte de 10 cm. Les neurosphères échantillons sont ensuite inversées sur le milieu conditionné et ont permis de faire la différence pendant 3-4 jours 28. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Croissance d'un clonale Neurosphère. Les cellules dérivées de neurosphères E14.5 ont été dissociées et ensemencées à 50 cellules / mL dans un plat de 96 puits. Les cellules individuelles ont été suivis pendant 6 d par imagerie time-lapse. Images de one telle cellule croissante dans un Neurosphère est affiché. Notez que le Neurosphère maintient clonalité. (A) 0 jours; (B) 19.01.45; (C) 2.95.37; (D) 3.32.76; (E) 4.46.53; (F) 5.61.44; où le premier numéro fait référence à la journée, deuxième numéro fait référence à la fraction de la journée, et le troisième numéro fait référence à la fraction du h. grossissement 10X. Barre d'échelle, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Différenciation des clonale Neurosphères et Numération de NSC Fréquence. Neurosphères simples ont été prélevées et différenciés en lamelle 50 puits chambré pour 3 d. Une image représentative d'une sta tripotent Neurosphèreiné avec (a) et DAPI immunocolorées pour (b) , GFAP (c) Tuj1 et (d) O4. (E) Affiche la superposition de (a) - (d). Barre d'échelle, 65 pm. (F) Le% de unipotents, bipotentes et tripotent neurosphères générés par LeX + et LEX - cellules (moyenne ± SEM; n = 3). (G) la fréquence NSC dans LeX + et LeX -. Cellules calculées comme le produit de NFU et% de neurosphères de tripotent S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Nous décrivons hee l'énumération des NSCs dans des conditions clonales. Les étapes critiques comprennent l'utilisation d'un milieu frais de croissance et de différenciation NSC, ainsi que l'utilisation d'une solution fraîchement préparée de PLL / laminine pour enrober les lamelles chambré, ainsi que des boîtes de culture. Ceci garantit des conditions de croissance et de différenciation optimales des neurosphères. L'utilisation de bonnes qualité d'anticorps pour détecter efficacement les neurones et les cellules gliales, ainsi que le prélèvement sélectif de neurosphères clonales qui ne sont pas en contact avec d'autres neurosphères, sont critiques. En outre, il est important de garantir que les neurosphères cueillies ne tarissent pas. Il est recommandé d'ajouter 10 pi de milieu de différenciation à chaque puits après la cueillette tous les 10 neurosphères. Il est important d'utiliser une lamelle chambré dans un plat de 10 cm par échantillon pour éviter la diaphonie entre neurosphères de différents échantillons. Si deux lamelles (contenant chacun neurosphères à partir de différents échantillons) sont placés dans lemême boîte de 10 cm, neurosphères de l'une lamelle pourrait libérer des facteurs qui peuvent modifier la propension des neurosphères dans l'autre lamelle de se différencier en lignées spécifiques. Deux lamelles couvre-objet dans la même boîte de 10 cm peuvent également entraîner confusion entre les échantillons.

Dans le cas où le NFU ou la fréquence NSC est plus faible que prévu, veiller à ce que nombre faible passage neurosphères sont utilisés. Il est également important que neurosphères bas de passage en bonne santé sont utilisés pour produire un milieu conditionné. Ensuite, si les neurosphères sont cultivées dans des puits de petit diamètre, comme dans un plat de 96 puits, alors il sera difficile à manœuvrer et choisir neurosphères en utilisant une micropipette. Dans ce cas, transférer les neurosphères à une boîte de culture plus vaste, comme un plat à 6 puits, avant la cueillette. Certains des neurosphères cueillies peut décoller de la lamelle chambré pendant la culture et immunocoloration. Minimiser le mouvement de la lamelle chambré pendant la culture, et lavage moins intensiveing pendant immunocoloration, contribuerait à éviter le détachement de neurosphères.

Les premières études quantifiées NSCs en utilisant uniquement la NFA 7,11,13. Cependant, la NFA surestime la fréquence NSC à la fois comme NNC et au début des NPs génèrent neurosphères 5. Louis et al. A développé une autre méthode pour quantifier NSCs connu sous le nom NCFCA 21,22. La NCFCA consiste à cultiver des cellules individuelles dans une matrice à base de collagène pour assurer la clonalité, et il a été montré que neurosphères au-dessus de 2 mm de diamètre sont formés uniquement par NNC. Semblable à la NCFCA, clonalité est assurée tout au long de ce protocole. Ce résultat est obtenu en générant des neurosphères à une densité clonale et la différenciation des neurosphères à lamelles chambré. L'utilisation de lamelles chambré confère un certain nombre d'avantages. La lamelle chambré permet à chaque échantillon Neurosphère de différencier sans avoir un contact physique avec d'autres neurosphères d'échantillons, assurant ainsi clonalité lors de la différenciation.La lamelle couvre-chambré peut être mis en suspension dans le milieu de différenciation pour permettre neurosphères échantillon à conditionner en continu et pour assurer une différenciation maximale. En l'absence de milieu conditionné et le sérum pendant la différenciation, la survie des neurosphères diminue et que la plupart des neurosphères générer astrocytes (M Tham et Ahmed S, non publié). En outre, les neurosphères immunocolorées peuvent être facilement stockés pendant une longue période de temps et les lamelles chambré peuvent être montés directement sur les lames de verre de microscope. En outre, l'imagerie des neurosphères immunocolorées est facile comme on peut rapidement localiser l'Neurosphère dans le petit puits chambré, capturer une image, et de passer à la prochaine bien.

Nous avons déterminé la fréquence NSC dans E14.5 culture de neurosphères de souris à l' aide à la fois le protocole décrit dans ce manuscrit 27 et NCFCA 28. La fréquence NSC en neurosphères de souris E14.5 déterminé à la fois par moithodes sont comparables. Le NCFCA énumère NSCs qui sont multipotentes et ont la capacité d'auto-renouvellement à long terme. Comme la fréquence NSC à partir de notre méthode est comparable à celle de NCFCA, la lecture de notre protocole ne semble pas surestimer la fréquence NSC. Le NCFCA nécessite trois semaines à remplir et concerne principalement le placage cellulaire et reconstitution moyenne. Le protocole décrit ici nécessite 13 jours pour réaliser et implique une autre série d'étapes, par exemple, Neurosphère picking et immunocoloration. Ce protocole pourrait servir comme une méthode alternative pour énumérer NSCs. Les chercheurs peuvent utiliser à la fois NCFCA et ce protocole pour vérifier la fréquence NSC dans leurs échantillons.

Une limitation de ce protocole est qu'une série de mesures importantes doivent être toutes effectuées le jour 8. La préparation du milieu conditionné, la détermination de NFU de neurosphères de l'échantillon, et le transfert de neurosphères de l'échantillon à la lamelle 50 puits chambré doivent être réalisée sur day 8. On peut prendre du temps pour effectuer ces étapes. En outre, il exige de la pratique pour effectuer ces étapes d'une manière efficace.

Neurosphères ont été largement utilisés pour étudier la fonction NSC et de comportement. Cependant, neurosphères se composent de deux NNC et NPs. Par conséquent, il est important d'enrichir NSCs de neurosphères pour étudier la biologie NSC. À l' heure actuelle, les marqueurs de surface cellulaire, des propriétés d'exclusion de colorant ainsi que la taille des cellules et la granularité ont été utilisées pour enrichir NNC 6,7,9-13,29,30. Ce protocole peut être utilisé pour quantifier l'enrichissement de NNC par des marqueurs potentiels NSC, et de faciliter la recherche d'un marqueur NSC définitif. Quatre études récentes ont utilisé ce protocole pour énumérer la fréquence NSC 5,14,15,26.

Acknowledgments

Nous remercions l'Agence pour la science, la technologie et la recherche (A * STAR), Singapour pour financer cette recherche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes  BD 352096
50 mL conical centrifuge tubes  BD 352070
20 mL sterile syringe   BD 300141
50 mL sterile syringe  BD 300144
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biowest S1810
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody Covance MMS-435P-100
Rabbit anti-GFAP IgG antibody Dako Z033401
Hemocytometer  Hausser Scientific 3100
Microscope fitted to laminar flow hood  Leica MZ6
Glass slides Marienfeld-superior 1000200
Mouse anti-O4 IgM antibody  Merck Millipore MAB345
Hydromount National Diagnostics HS-106
Microscope Nikon Eclipse TS100-F
Laminar flow hood NuAire NU-543
96-well culture dishes NUNC 167008
10-cm culture dishes  NUNC 150350
Paraffin film Parafilm PM999
Human Epidermal Growth Factor (EGF)  Peprotech AF-100-15
Recombinant human basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)  Peprotech 100-18B
0.2 µm filter  Sartorius Stedim 16534-K
0.45 µm filter Sartorius Stedim 16555-K
1.0 N Sodium Hydroxide (NaOH)  Sigma-Aldrich S2770
1.0 N Hydrochloric acid (HCl)  Sigma-Aldrich H9892
Trypan Blue  Sigma-Aldrich T8154
Poly-L-Lysine (PLL)  Sigma-Aldrich P8920
Paraformaldehyde (PFA) powder  Sigma-Aldrich P6148 Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) powder  Sigma-Aldrich A7906
50-well chambered coverslips  Sigma-Aldrich C7735
Stir plate with heat function  Stuart UC152
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320-033
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140-122
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
1x Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190144
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific A21042
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific A21135
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody Thermo Fisher Scientific A31573
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)  Thermo Fisher Scientific D3571
Cell-culture centrifuge Thermo Fisher Scientific  RT1 75002383
Pasteur pipettes Thermo Fisher Scientific 10006021
CO2 incubator
Ventilated fume-hood
Aspirator
Confocal microscope
Micropipettes
Micropipette tips
Plastic pipettes
Multichannel pipettes
Glass beaker
Sterile forceps
pH meter

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References

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Énumération des cellules souches neurales utilisant clonales Assays
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Narayanan, G., Yu, Y. H., Tham, M., Gan, H. T., Ramasamy, S., Sankaran, S., Hariharan, S., Ahmed, S. Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays. J. Vis. Exp. (116), e54456, doi:10.3791/54456 (2016).

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