Viene presentato un protocollo per la produzione, la purificazione e l'uso di vescicole di membrana esterna confezionate con enzimi (OMV) che forniscono una maggiore stabilità enzimatica per l'implementazione in diverse applicazioni.
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Articolo metodologico
Packaging proteine diretto all'interno della membrana esterna vescicole da
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un crescente interesse per l'applicazione di tecniche di biologia sintetica per programmare vescicole membrana esterna (OMV) stanno portando ad alcune applicazioni molto interessanti e uniche per OMV in cui le nanoparticelle tradizionali si stanno rivelando troppo difficili da sintetizzare. Ad oggi, tutti i batteri Gram-negativi hanno dimostrato di produrre OMV confezionamento dimostrazione di una varietà di carico che comprende piccole molecole, peptidi, proteine e materiale genetico. Sulla base della loro diversa carico, OMV sono implicati in molti processi biologici che vanno dalla comunicazione cellulare per il trasferimento genico e consegna dei fattori di virulenza seconda di quale batteri producono l'OMV. Solo di recente sono batterica OMV diventati accessibili per l'uso in una vasta gamma di applicazioni attraverso lo sviluppo di tecniche per il controllo e il confezionamento diretta di proteine ricombinanti in OMV. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione, purificazione, e l'uso di enzima confezionato OMV prevede migliorata overala produzione ll di enzima ricombinante, aumento vescicole, e una maggiore stabilità dell'enzima. utilizzazione di successo di questo protocollo comporta la creazione di un ceppo batterico che produce contemporaneamente una proteina ricombinante e la dirige per OMV incapsulamento attraverso la creazione di un collegamento sintetica tra la proteina ricombinante e una proteina della membrana esterna di ancoraggio. Questo protocollo dettagli anche i metodi per isolare OMV da colture batteriche così come le tecniche di manipolazione e cose da considerare quando si adattare questo protocollo per l'uso per altre applicazioni uniche quali: la consegna della droga farmaceutica, diagnostica medica e risanamento ambientale.
Introduzione
Qui presentata è un metodo per la progettazione, produzione e purificazione di vescicole enzimi batterici caricato membrana esterna (OMV). OMV sono piccole, soprattutto unilamellare, proteoliposomi che variano nel formato 30-200 nm 1,2. Tutti i batteri Gram-negativi e Gram-positivi che sono stati studiati fino ad oggi hanno dimostrato rilascio di una OMV o vescicole extracellulari (EV) dalla loro superficie 3,4. Il meccanismo preciso con cui sono prodotti OMV devono ancora essere completamente chiarito causa delle diverse popolazioni batteriche che loro così come le funzioni diverse che servono secernono. OMV hanno dimostrato di trasportare una ....
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Protocollo
1. Preparazione di plasmidi
- Preparare un plasmide (ad esempio, pET22) contenente la proteina di ancoraggio (OmpA) fusa a un dominio di legame biortogonale (di cui al presente protocollo come anchor-ST), tag epitopo (come 6xHis, myc o la bandiera tag per la purificazione e identificazione), tag periplasmic localizzazione, la resistenza agli antibiotici, e l'origine appropriata di replica in base al ceppo batterico selezionato 7.
- Estrarre il DNA plasmide da culture durante la notte utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore.
- Preparare un plasmide....
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Risultati
L'espressione simultanea di due proteine ricombinanti, come è richiesto per la strategia di imballaggio OMV descritto in questo protocollo, può essere realizzato attraverso diverse vie. Qui, un sistema a due vettoriale è stato utilizzato con origini compatibili di replicazione e cassette geniche inducibili separati. Per l'espressione del PTE-SC costruire un backbone plasmide commerciale (pACY184) è stato progettato per includere una arabinosio inducibile cassetta genica e una d.......
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Discussione
Questo funzioni di protocollo per dimostrare un rappresentante dirette tecnica imballaggio in cui viene prodotto e confezionato in OMV da E. coli un enzima di interesse. Come per molte tecniche complesse ci sono più aree in cui il protocollo può essere modificato per ospitare per l'utilizzo in diverse applicazioni uniche, alcune delle quali sono descritte di seguito. Mentre il meccanismo di imballaggi OMV e l'enzima incapsulamento può essere adattata alle esigenze specifiche ci sono diversi passaggi all.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata dall'Office of Naval Research attraverso i fondi Core forniti al Naval Research Laboratory.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| IPTG | Qualsiasi | Preparare sempre fresco o aliquota e congelare. | |
| L-arabinosio | Qualsiasi | Può essere preparato in anticipo e conservato a 4 °C. | |
| Ampicillina | Qualsiasi | aggiungere immediatamente prima dell'uso dopo che il terreno si è sufficientemente raffreddato dall'autoclave. | |
| Cloramfenicolo | Qualsiasi | aggiunta immediatamente prima dell'uso dopo che il supporto si è sufficientemente raffreddato dall'autoclave. | |
| TB/LB Terreni di coltura | Qualsiasi | altro terreno di coltura funzionerà probabilmente in modo simile. | |
| Triton X-100 | Uno dei | tanti potenziali tensioattivi adatti. | |
| Palloni di coltura sconcertati | Qualsiasi | I deflettori promuovono livelli più elevati di aerazione. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Tampone ottimale utilizzato per la degradazione del paraoxon (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Sostanza molto tossica da maneggiare con cura e smaltire correttamente. |
| Filtro per siringa 0,45 &; micro; m | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Il diametro del filtro dipenderà dal volume del campione. La membrana a basso legame proteico è fondamentale. |
| Incubatore a scuotimento | New Brunswick | Excella E24 | La temperatura e la miscelazione precise sono essenziali per la crescita batterica riproducibile. |
| Centrifuga per colture Sorvall | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Centrifuga per colture di grande volume (500 ml) in grado di produrre 7.000 x g. |
| Ultracentrifuga Sorvall | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capace di forze centrifughe ≥ 150.000 x g. |
| Rotore per ultracentrifuga | Thermo Scientific | AH-629 | Assicurarsi che vengano utilizzati il rotore e le provette corretti e che tutto sia correttamente bilanciato. |
| Provette per ultracentrifuga ultratrasparenti (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Assicurarsi che non siano presenti fratture da stress prima dell'uso e che le provette siano perfettamente bilanciate. |
| Spettrofotometro | Tecan | Infinite M1000 | Necessario per saggi cinetici enzimatici. |
| DLS/tracciamento delle particelle | NanoSight | LM10 | Necessario per la distribuzione dimensionale OMV e la determinazione della concentrazione. |
| BL21(DE3) | NEB | Ceppo di espressione batterica adatto. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Altri plasmidi possono essere utilizzati al loro posto. |
| pACYC184 | NEB | Altri plasmidi possono essere utilizzati al loro posto. | |
| Kit di estrazione del gel | Qiagen | 28704 | Kit di esempio. |
Riferimenti
- Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).....
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Ristampe e permessi
