Summary
我们描述了一个强大的基因替代策略，以基因操纵黑粉菌玉米黑粉菌 。该协议说明了如何生成缺失突变体研究感染表型。它可以扩展到修改的基因以任何期望的方式， 例如 ，通过添加编码荧光蛋白标记的序列。
Abstract
基因缺失在基因功能的分析的重要作用。其中最有效的方法来破坏有针对性地基因是通过同源重组的选择性标记的更换整个基因。在同源重组，DNA的交换以高相似度序列之间的地方。因此，侧翼的靶基因的线性基因组序列可用于特异性指示一个可选择的标记到所需的整合位点。缺失构建体的钝端激活细胞的DNA修复系统，从而或者通过同源重组或通过非同源末端接合促进构建体整合。在高效的同源重组微生物，成功的基因缺失的速率可以达到50％以上，使此策略的有价值的基因破坏系统。该黑粉菌玉米黑粉菌是表示该有效的同源recombinat真核微生物模式离子。其约6900个基因，许多已在功能上表征与缺失突变体的帮助下，在该基因的基本功能重复的基因置换的尝试点故障。通过与荧光标记或预测域的突变标记基因功能的后续特性也依赖于通过同源重组DNA交换。在这里，我们提出了U.用最简单的例子中，基因缺失详细小斑病菌应变生成策略。
Introduction
玉蜀黍黑粉菌是已经数十年1,2-广泛研究一个植物致病模型真菌。它存在于两个形态，酵母样的，非致病阶段和丝状，感染形式3。万向突破性发现诸如同源重组和DNA修复机制在这种真菌4的酵母样生长阶段进行的。此外，该形态切换到传染性长丝和毒力因子感染重要被充分表征5,6。这个黑粉菌生物学和毒力的日益分子知识依赖于一个优秀的基因组注释10和反向遗传学的使用简便， 例如 ，组织严密的质粒收集在我院（HTTP支持一个简单的基因替换策略7-9 ：//www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html）。玉米组织规范化，快速感染试验eedlings允许致病性的详细研究因素11。
美国的基因组玉米小斑病包含约6900个基因10。研究它们的功能，它们可以单独或组合由于一个高效的同源重组系统中删除。含完全同源末端的约1kb的侧翼区是理想的同源重组大于50％的比率，但已经250bp的非同源末端允许某种程度的正确整合的构建体9组成。目前，五个不同的抗性盒，hygR，cbxR，NATR，G418R，和phleoR介导针对潮霉素，萎，诺尔丝菌素，G418和腐草霉素抗性，被用来选择转化7,9。此外，潮霉素抗性已被开发成可回收盒（FRT-hygR），可以通过异源FLP重组酶12的瞬时表达被移除。这样做允许移除，从而在理论上无限的遗传修饰的抗性盒和。腐草霉素是诱变13，使之与新盒带，特别是可回收hygR盒，使用phleoR的正在减少。四倍突变体因此可利用其他四个盒产生，但对于五元组突变体中，FRT-hygR系统建议14。
这是一般的基因缺失策略已成功转移到其他黑穗病菌如丝黑穗病的 15 U.大麦 16，或U.星虫 17岁 ，因此提供了一个高效的同源重组系统，但转基因生物顽固进一步应用的潜力。此外，缺乏同源重组生物体可以被修饰以提高基因工程所涉及的基因的缺失例举非同源烯D-加盟链孢霉 18,19。
在这里，我们描述了U.公布的基因缺失策略实验细节7,9 玉米须 ，重点对考生的快速和准确的验证。作为一个例子，我们使用真菌几丁质酶和描绘单突变体的产生以及多个缺失菌株20,21。几丁质酶是有趣的例子，因为它们作用于刚性细胞壁甲壳素。细胞壁重塑需要细胞分裂过程中的形态变化，切换到丝状生长，孢子形成。因此，在缺失突变体在整个生命周期中的表型可以预期。
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Protocol
1.删除生成的构造
- 产生含有缺失构建体（ 图1），包括一个相应的1kb的上游侧翼（UF）和下游侧翼（DF），每个与由钝切割型限制性位点侧接的适当抗性盒的质粒。
注意：任何克隆策略可以使用（用于克隆见参考22），建议金门克隆这种质粒9。 - 切除删除使用钝刀具，以获得缺失1微克DNA构建从9质粒构建。净化的删除构建体，以消除酶，并通过使用商购试剂缓冲器22 例如并按照制造商的说明。
注：载体骨架可以保留在转化混合物。
2.原生质体的制备
注：在电子商务时刻保持无菌条件xperiment。细胞壁是限制分子的访问到质膜很强的保护屏障。以允许含有缺失构建体的DNA的摄取，细胞壁需要通过细胞壁的原生质体反应降解酶除去。在原生质体的制备关键步骤是：1）介质的渗透稳定和2）避免对原生质体的机械应力。
- 标记2ml管与圆底冻结原生质体并冷却下来在-20℃。从具有期望遗传背景的菌株的新鲜板开始在3ml YEPS光强的预培养。孵育在28℃的旋转轮24小时。
注：该菌株可以是solopathogenic应变SG200 10，野生型株，测试菌株如AB33 23，或用于产生双重突变体中的任何突变体的背景。确保应变是自由的所需阻力。 - 稀释在50毫升YEPS光强的文化在挡板FLASk和在28℃下用200rpm的定轨振荡器上孵育。
注：倍增时间是野生型菌株约2小时。允许3重复最小。 - 生长，直到指数期。确保光密度，在600nm（OD 600）的波长测量，大约是0.8（0.6至1.0是可接受的）。的OD 1.0 600对应于大约1至2×10 7个U.每玉米须毫升细胞。
- 检查污染的细胞在显微镜下。使用放大40倍。沉淀完全50ml培养的细胞5分钟，1500 xg离心并弃去上清液。重悬在25毫升的柠檬酸钠，山梨糖醇溶液（SCS），离心5分钟，1500 xg离心沉淀，并弃去上清液。
注：细菌污染物可确定为小，经常移动的细胞。真菌污染物可以基于不同的细胞的形状或大小相比U的雪茄形细胞被识别玉米小斑病 。 - 在岑trifugation制备原生质体溶液（12.5毫克/毫升木霉裂解酶，在SCS;制备每个细胞沉淀3毫升;过滤消毒通过一个22微米的过滤器;溶液是新鲜的最佳的酶活性）。 SCS是渗透稳定剂，以防止在除去细胞壁的原生质体的破裂。
- 悬浮颗粒在2毫升原生质体的解决方案。孵育5到20分钟，在RT和在显微镜下检查，直至细胞的30至40％是圆形或像猪头（ 图2）。
注意：请在冰上所有步骤从现在开始，并小心处理原生质体！ - 洗3次在10毫升冷（4℃）SCS，离心机在1000×g离心5分钟。
- 重悬在10ml冷山梨醇，TrisHCl， 氯化钙溶液（STC），旋粒料以1000×g离心5分钟，弃上清。重悬在1ml冷的STC沉淀，使在冷却管道100微升等分试样。在-80°C，直到进一步利用冻结等分。
3. U.改造玉米小斑病
注意：U的转化小斑病菌原生质依赖于聚乙二醇（PEG）介导的转化方法，该方法在技术上是简单和相对电穿孔或基因枪转化不需要专门的设备。
- 制备双层选择平板（每个转化反应2块板）。底层包含双倍浓度的抗生素。吸管12毫升RegLight的含有400微克/毫升潮霉素（或300微克/毫升诺尔丝菌素或4微克/毫升萎或1mg / ml的G418）成培养皿。避免气泡。
注：底层板可以存储在几天，在4℃，但转化过程中的新鲜制备的顶层（见下文）。 - 在冰上解冻原生质体（1管/转换）。加入1μl肝素（15毫克/毫升）。加入1微克DNA（线性结构）或10微升H 2
- 在此期间，为上层蔓延12毫升液化RegLight（煮沸，冷却至60°C）到RegLight底板。
注：此层不含有抗生素。 - 加入500微升STC / PEG（聚乙二醇）到变换管（3 2），并通过反相管小心混合。在冰上孵育15分钟。
- 分发两个双层RegLight板的各转化反应。用玻璃吸管小心缓慢地扩散。在28°C直立孵育板5〜7天，直到转化成长为殖民地。获取每盘约100-200菌落。
注：下数据可能通过“坏”原生质体，要么含有太多细胞壁，因此可以不占用DNA或不能再生而引起。前者可以通过转化具有自我复制的质粒，后者由平板上测试再生没有抗生素进行测试。 <利>准备含有适当抗生素YEPS-光板，在200微克/毫升潮霉素（或150微克/毫升诺尔丝菌素或2微克/毫升萎或500微克/毫升G418的;这些浓度用于底板的一个等于一半）。再净化部对这些板块至少24假定转化体菌落。单一菌落来获得。在非选择性培养基同时条纹出原始菌株。
注：将板可以储存在4℃下1-2周。
4.正确删除事件的验证
注：突变的三步骤过程中被验证（ 图1）。首先，含有该基因的野生型拷贝的候选人通过PCR排除。第二，电阻磁带插入基因座的整合通过PCR验证。第三，整合的抗性盒只成所需轨迹由Southern印迹分析证实。细心的应变验证ESSE微分方程边值问题的，使突变表型真正与缺失相关。
- 首先PCR诊断20
- 在基因设计的引物配对要删除该结果在250-600碱基（ 图1）的产物。这种小产品很容易在菌落PCR扩增，和足够长的检测标准凝胶电泳。
- 每个候选和原始菌株作为阳性对照，悬浮单个菌落的细胞材料一点点（针头量）与在20μl的0.02M的NaOH牙签。孵育在室温下进行30分钟。
注意：使用新的殖民地。如果这些板块都超过1周再连胜老年，获取新的殖民地。 - 立即使用1微升的细胞悬液用于PCR。运行标准PCR反应，分析产生的碎片。
注意：这些样品不能存储。
注：野生型基因的存在这个PCR试验，从而允许负C和快速鉴定在其中的感兴趣的基因没有被替换idates。产生在该PCR反应条带的克隆将被丢弃。一个这样的负面克隆无论如何都应该被一起作为一个额外的阴性对照进行。没有PCR产物考生必须进一步分析。对于基因无不利影响大约一半的候选应包含野生型基因，而另一半不应该在的频带造成的。这将对应于50％的同源重组率。
- 第二PCR诊断
- 基因组DNA的制备。
注：基因组DNA（gDNA的）可以用两种不同的协议来制备。第一个涉及毒性试剂像苯酚和氯仿，因此，应仅由有经验的研究人员（在4.2.1.1至4.2.1.5中描述），而第二也可以由经验较少的学生（4.2.1.6至4.2中所述进行处理来处理。 1.11）。这两个协议都可靠工作。步骤4.2.1.1是为protoc相同醇。- 接种5毫升YEPS光强与每个候选和在28℃在旋转轮孵育24小时。掉落在CM板2微升的文化。保持无菌的文化。
注：以下是一个标准协议（注意：有毒的步骤）。 - 把1勺（约200微升）的盐酸洗玻璃珠的2ml管。加入2毫升的U.玉米小斑病文化。自旋12000 xg离心5分钟。弃上清（颗粒可以在此阶段被冻结）。加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）进行沉淀。警告！苯酚是有毒的！
- 加入500μl拉贝裂解缓冲液1.摇为6至10分钟，在一个vibrax以1,000rpm。验证该细胞沉淀完全重悬，但避免延长摇动防止的gDNA的剪切。旋在12,000 xg离心15分钟。转移400微升的水相到新的反应管（请勿触摸相间）。
- 加入1ml 100％（体积/体积）乙醇。反转管3X混合，观察的C大声说前不久出现的DNA。旋在12,000 xg离心5分钟。除去上清并用200μl70％乙醇洗涤。不重悬在该阶段沉淀。
- 完全取出上清液（不要让小球完全干燥）。加入50μlTE / RNA酶。通过在50℃下以400rpm振摇10分钟溶解的gDNA。在0.8％琼脂糖凝胶上20分析2微升的gDNA的。
注：下面的步骤包括另一种无毒的协议。
- 接种5毫升YEPS光强与每个候选和在28℃在旋转轮孵育24小时。掉落在CM板2微升的文化。保持无菌的文化。
- 基因组DNA的候补制备
- 把1勺（约200微升）的盐酸洗玻璃珠的2ml管。加入2毫升的U.小斑病菌培养和自旋在12,000 xg离心5分钟。弃上清（粒料可以在此阶段被冻结）。
- 加入500微升拉贝裂解缓冲液2到沉淀。以1000rpm摇动5至15分钟，在一个vibrax。验证该细胞沉淀完全重悬。
- 在65℃下进行15至20分钟孵育的管子。 Appro公司使用旨在承载2ml管priate孵化器是至关重要的。然后，将其放置在冰上5分钟。
- 加入100微升8M的乙酸钾，涡旋或反转8至10倍。自旋12000×g离心在RT 15分钟。
- 转移500μl的上清液至新的1.5毫升管，并添加400μl的异丙醇。涡流或倒置8到10倍。自旋12000×g离心15分钟。除去上清并用500μl70％乙醇洗涤。自旋12000 xg离心5分钟。
- 完全浸泡过上清！最终，添加短的自旋（10秒），以去除残留的液体。让为3至5分钟，将DNA沉淀干燥。加入50μl的TE / RNA酶，并在50℃下孵育10至15分钟，在400rpm。
- PCR
- 设计2种引物对，在侧翼外其中之一的结合和中相应的一个的抗性盒内结合（UF-F，RC-R; RC-F，DF-R， 图1）9。
- 使用1微升1:10稀释每一个C的基因组DNA的andidate如2 PCR反应的模板验证正确的插入上游和下游9。
- 使用每个候选标准PCR反应，并分析产生的碎片22。
注意：这些的PCR测试对于抗性盒在正确的基因组基因座的插入。如果产品是双方获得，候选人可能是一个正确的插入。然而，考生也只有一个侧（上游或下游），可以确认应沿的情况下，进一步的分析，认为PCR反应根本没有一个侧面进行。
- 基因组DNA的制备。
- 通过Southern印迹分析22基因正确插入的验证
- 消化突变体候选的gDNA的15微升（4.2.1）和相应的野生型/祖应变与轨迹外切割/构造，另外，切割无论是在基因或抗性盒导致清楚地区的适当的酶inguishable图案（ 图1）8。
注：预期的条带中没有应大于10kb的，以使它们从未消化的DNA有明显的区别。 - 使用上游和下游侧翼作为探针。要贴上标签，例如使用PCR DIG标记试剂盒或任何类似的标准方法。在一个1混合上述标记探针：1摩尔比，并进行Southern印迹。保持在至少两个独立的正确转化体。
注：野生型图案应在原始菌株清楚地检测和正确的克隆只包含预期带。只存在于候选额外条带表明在一个错误的轨迹构建体的其他插入。这种克隆应该被丢弃。在第一次诊断PCR鉴定负候选人应包含集成错误删除结构的野生型带和条带（尺寸不可预测）。
- 消化突变体候选的gDNA的15微升（4.2.1）和相应的野生型/祖应变与轨迹外切割/构造，另外，切割无论是在基因或抗性盒导致清楚地区的适当的酶inguishable图案（ 图1）8。
- 甘油股票
注：甘油股起到维持克隆多年来在应变集合。至少两个独立的转化体应当保持对于每个突变体。这允许比较表型应是相同的。- 生长5毫升培养物在YEPS-光确认的突变株上的旋转轮24小时，在28℃混合500微升每种培养物用500μlNSY-甘油的培养基。反转管，直到文化和中充分混合。甘油培养基中防止冰晶的形成。
- 冻结在-80℃。重新连胜冷冻文化的一部分来测试，如果股票是功能。
5.显微表型
- 生长5毫升培养野生型和突变株在YEPS-光对旋转轮12小时在28℃。
- 第二天，稀释培养至约0.1的OD 600和成长它，直到0.5和0.7之间的OD 600。 1.0 corresp的OD 600哔声至约1至2×10 7个U.每玉米须毫升细胞。
- 显微镜检查细胞形态学。
注：健康的细胞出现雪茄形（ 图4，WT）。发音的空泡或丝的形成表明，所述细胞强调。
注意：根据预期的突变表型，分析可以适于， 例如 ，如果使用的话记者菌株的合适的测定可以在此阶段进行。如果细胞形态改变的统计分析应进行， 例如 ，以确定平均细胞长度。
6.感染测定
注：苗感染试验已经在本杂志11先前可视化。它可以是使用一个单倍体，solopathogenic菌株背景如SG200 10或通过混合兼容交配伙伴其中两个携带突变进行。
- 每增长至少40玉米幼苗应变7天16小时，200μE，28℃/ 22℃（昼/夜）的光周期。它们应在3叶阶段和10-15厘米高在感染一天。
- 感染前两天，在28°C开始菌株的预培养5毫升YEPS光强在一个旋转的车轮24小时。种植主培养在50毫升YEPS光强可达600 OD = 1.0（细胞分裂率= 2小时，允许3师最小，可以做到O / N）。
- 降速50ml培养的细胞在1,500×g离心5分钟并弃上清。洗3次，用无菌H 2 O悬浮细胞在无菌H 2 O操作的外径为3.0 600。如果需要的话，混合交配伙伴。
- 注入250 - 500微升细胞悬浮液成采用一个小注射器7天老玉米幼苗的茎。使用无菌H 2 O作为对照。保持感染幼苗在相同光照和温度条件下的额外7-14天。分数每个工厂的表型ccording健康，萎黄，花青素的形成，小的肿瘤，肿瘤大，植株枯死10。
注：评分可以早7天完成，14天重复遵循感染随着时间的推移。
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Representative Results
缺失构建在U.编码的所有四个基因几丁质通过使用hygR盒为CTS1缺失金门克隆生成小斑病菌的基因组中，NATR为CTS2的删除，则G418R盒为CTS3的删除和cbxR为CTS4 20的删除。该基因替换策略的概述由缺失CTS3的（ 图1）举例说明。与第二个几丁质基因CTS1的单，双突变体在几丁质酶的毒力中的作用分析两种不同的遗传背景生成顺序用相同的结构。采用两种不同的菌株背景下：AB33允许丝状生长的诱导，对致病23的第一步，SG200是独奏致病株，使快速疾病得分10 CTS3转化-deletion构建成适当的菌株背景后，将第二选择板的单菌落用于通过诊断PCR反应（ 表1）和Southern印迹（ 图3）正确缺失进行了测试。有趣的是，对于CTS3同源重组率为SG200比AB33高得多，但这种差异不是始终如一的其他几丁质酶的缺失观察到。
严格的应变验证确保了缺失的单个插入构造在所需的位置。然而，更多的修改，如点突变可以保持未被发现，这可能会误导表型的解释。因此，至少有两个独立的转化表型。
图 URE 1. CTS3 例举的删除策略的概述 ，该示意图包括删除与上游侧翼（UF），下游侧翼（DF）和遗传霉素抗性盒（G418R），野生型的基因组基因座构造（WT ）和CTS3缺失突变体和所有的引物以及在应变验证中使用的限制性位点。在一个产品的第一个诊断性PCR的结果仅在野生型基因拷贝存在时，两个第二诊断PCR反应导致产品如果抗性盒已被正确地整合。用于Southern印迹的基因组DNA消化用PstI，探针跨越UF和DF（红色条），从而导致检测到6.7 kb的频带的在野生型和5.6 kb的两条带和在突变2.0kb的。此外，DF探测弱识别2.6 kb的产品。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.原生质体反应的微观验证。（A）未处理野生型细胞（FB2）出现雪茄形。 （b）在治疗与细胞壁降解酶（此处，30分钟），圆球形的一端（S）和棒状钟状结构的外观（b）表示该细胞壁降解已经开始。最后将原生质体是完全圆（R），这是由于缺少细胞壁的。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3 URE。为CTS3 删除。基因组DNA Southern印迹用PstI消化。两侧翼被标记，混合等摩尔的比率，并用作单个探针。在野生型SG200和几丁质酶CTS1和CTS2的缺失，检测6.7 kb的的单一条带。在CTS3缺失（G和K），5.6 kb的两条带和2.0 kb的指示CTS3正确的缺失可见。的2.6kb的额外频带可以通过大规模的过度曝光可视化。这相当于由100只在下游侧翼探头bp的重叠公认的一个片段。 请点击此处查看该图的放大版本。
一些突变导致可显微镜来检测明显的生长缺陷。在几丁质酶的缺失，单突变体不显示任何明显的缺陷，而CTS1 / 2双突变体显示出明显的细胞分离缺陷20。隔染色显示胞质分裂完成，但细胞（从兰纳等，2015年图4）通过保持甲壳素残留可能连接。类似的微观生长表型而闻名khd4 24的缺失，编码RNA结合蛋白介导参与形态和致病25个基因的转录后的RNA周转的基因。
图4. 缺失突变体的显微分析。几丁质酶缺失菌株的细胞形态和隔片形成。CTS1 / 2Δ菌株表现出的细胞分离缺陷，并形成大的聚集体，这不是由于缺乏隔膜形成。小学和中学隔（见插图5倍放大）与Calcofluor白色（CW）以镜检前染色。比例尺= 10微米。这个数字转载来自兰纳等。2015年真核细胞20的许可。 请点击此处查看本图的放大版本。
为了测试几丁质酶以毒力的贡献，幼苗感染测定法进行了使用在SG200菌株背景的突变体。而在khd4突变体的毒力均降低，几丁质酶的缺失不影响玉米幼苗感染（ 图5）20,25。
图5. 感染缺失突变体的检测。病评级玉米苗期感染与各自的U. 9天后株玉米须 。 （ 一 ）被用于疾病得分宏观症状。 （B）的两个独立的转化体的每个菌株（N> 100）测试。所有几丁质酶缺陷型突变体（1/2 /3Δ：三重突变endochitinases，4Δ：单突变体N-乙酰氨基，1/2/3 /4Δ：四重突变体）感染的宿主植物，导致重肿瘤形成如在野生型感染观察在solopathogenic应变SG200。与此相反，携带缺失编码RNA结合蛋白Khd4的基因的菌株的毒力降低如先前24报告。误差棒表示三次独立实验的标准偏差。这个数字被修改，从兰纳等人的许可。2015年真核细胞20。 请点击此处查看大- [R版本这个数字。
| 遗传背景 | 1 日 DIAGN。 PCR （不含/测试） | 第二 DIAGN。 PCR （确认/测试） | 南部的 （确认/测试） | ％recomb。 |
| AB33 | 7/22 | - | 7/15 | 32 |
| AB33 CTS1Δ | 19/24 | - | 5/5 | 21 |
| SG200 | 0/10 | 8/10 | 7/8 | 70 |
| SG200 CTS1Δ | 0/20 | 19/20 | 14/19 | 70 |
表1：菌株验证CTS3缺失的几丁质酶基因CTS3在四个不同的遗传背景已被删除，以允许在单个和多个缺失丝状生长（AB33）和感染（SG200）的研究。
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Discussion
本协议描述了如何为在美国反向遗传学研究的缺失突变体玉米小斑病 。起点是缺失构建体，其中包含基因的感兴趣含有的约1kb的开始的上游和终止密码子的下游，以及适当的抗性盒序列的侧翼序列，因为它先前优化7,9- 。该构建体已经为每个基因单独生成并认真核实为之前删除该基因序列的错误。在侧翼点突变可以导致在基因组序列不需要的改变，特别是如果侧面伸入相邻基因或突变修改调控元件。这会影响所有的转化体，并可能导致表型和副作用无关的期望的基因缺失。
当规划删除策略，预期的表型，必须考虑选择遗传背景。在目前的情况下，AB33 23和SG200 10被选择，以允许在形态学开关和植物感染测试表型。同样地，许多其它的读取超时可能会感兴趣， 例如 ，使用CTS1融合于异源蛋白质14,26的出口被采用，和一个应变背景荧光标记rrm4允许在内涵体27,28的RNA运输的分析。
期间应变验证中，高通量诊断PCR的允许候选的数目的快速减少到相当费力的Southern印迹试验。特别是，在第一诊断性PCR允许仍含该基因的野生型拷贝的候选人的排斥，从而防止在基因组DNA制剂中的大规模使用有毒的苯酚。在与非必需基因的标准的情况下，大约一半的菌落可包含野生型基因。该预筛分可以是用于基因极大的兴趣具有潜在的有害生长的表型。数百名考生能够迅速进行筛选。
如果所有候选人含有野生型副本，该基因缺失很可能是致命的。这可以通过在冬孢子发芽29后二倍体菌株背景（ 例如 D132）和偏析分析删除一个副本来确认。可替代地，使用可诱导启动子的条件删除策略可以选择遵循突变表型。然而，还污染从基因组DNA的制备将粗基于氢氧化钠法所得可以与PCR干扰，并导致假阴性，即候选不显示的频带，因此被保持，即使它们包含的基因。这可以通过与用于控制基因在两个基因特异性引物和引物导致更大的片段在一个独立的PCR反应或通过多重PCR具有可比尺寸产品测试的控制基因被排除。
内容“>如果一个突变体已被使用， 例如 ，CTS1Δ30或rrm4Δ，应变产生标记的版本可通过在基因组中具有新颖构造替换基因缺失抗性盒（ 例如hygR）含有， 例如 ，加速荧光标记rrm4和不同的抗性标记（ 例如 NATR）。在这种情况下，转化体可以由初始抗性标记9的损失进行筛选。正确的候选只是对新抗生素（诺尔丝菌素）抗性和已经失去其初始电阻（潮霉素）。此外，在反式的突变表型的互补可以进行验证标记的构建体30,31的功能。在此描述的基因删除和修改策略提供了在美国的遗传分析的可靠和详细的工具玉米小斑病 。然而，对于多重缺失，应变GEneration可以获得费时，由于改变必须依次进行。因此，作为一种辅助工具，去年CRISPR-CAS系统已经建立了U. 32 玉米须 。它提供了可能性，同时破坏多个基因，是一个极好的补充U.的遗传工具箱玉米小斑病 。
总之，该协议对于遗传操作及U.这里描述小斑病菌变形产生是已经广泛使用的社区多年健壮方法。与各自的抗性盒模块的全面收集在一起，它允许各种基因工程在这种真菌，涉及从基础到应用研究不同的问题。
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Acknowledgments
特别感谢本尼迪克特Steuten博士的手稿的批判性阅读。在几丁质酶的原创作品是由和Thorsten兰纳博士进行。 VG的实验室是由卓越的植物科学（CEPLAS，DFG EXC 1028）和BioSC的群集支持，堪萨斯州的实验室是由BioSC支持。 KB由BioSC支持。生物经济科学中心（BioSC）的科学活动是由财政创新，科学和研究部的NRW Strategieprojekt BioSC（313号/ 323-400-00213）的框架内支持。 LF是由东风集团国际研究培训集团1525 iGRADplant的博士生奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminobenzoeic acid (Free Acid) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | alternatively use local supplier |
| Bacto peptone | BD | 211677 | alternatively use local supplier |
| Bacto yeast extract | BD | 212750 | alternatively use local supplier |
| CaCl2*2H2O | Grüssing GmbH | 10234 | alternatively use local supplier |
| Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | Sigma Aldrich | 45371 | |
| Casamino acids | BD | 223050 | |
| Cholinchlorid | Sigma Aldrich | C-1879 | |
| Citric acid | ChemSolute | 24,321,000 | alternatively use local supplier |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | alternatively use local supplier |
| D(+)Sucrose | Roth | 4621.1 | alternatively use local supplier |
| DNA degr. free acid | Sigma-Aldrich | D-3159 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grüssing GmbH | 10288 | alternatively use local supplier |
| Geneticin (G418) disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | alternatively use local supplier |
| Glycerin | Fisher Chemical | G065015 | alternatively use local supplier |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | Dangerous substance. |
| KCl | VWR | 26764298 | alternatively use local supplier |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | alternatively use local supplier |
| MgSO4 waterfree | Merck | 7487-88-9 | Water free is critical. Alternatively use local supplier |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | alternatively use local supplier |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | alternatively use local supplier |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | alternatively use local supplier |
| Na2SO4 | Grüssing GmbH | 12174 | alternatively use local supplier |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | alternatively use local supplier |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | alternatively use local supplier |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | alternatively use local supplier |
| Nicotinic acid (Free acid) | Sigma Aldrich | N-4126 | |
| Nourseothricin dihydrogen sulfate | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| Nutrient broth | Difco | local suppliers | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7 | Sigma Aldrich | P3803 | Dangerous substance. Please check manufacturer's safety instructions. |
| polyethylene glycol (PEG) | Sigma Aldrich | P-3640 | |
| Potassium acetate | AppliChem | 121479 | alternatively use local supplier |
| Pyridoxin (monohydrochlorid) | Sigma Aldrich | P-9755 | |
| Riboflavin | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | alternatively use local supplier |
| small syringe | BD | 300300 | alternatively use local supplier |
| sterile filter, 22 µm | VWR | 28145-477 | alternatively use local supplier |
| Sorbitol | Roth | 6213.1 | alternatively use local supplier |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | alternatively use local supplier |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | alternatively use local supplier |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | alternatively use local supplier |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | alternatively use local supplier |
| Triton X-100 | Serva | 37240 | alternatively use local supplier |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | alternatively use local supplier |
| Composition of solutions/preparation of material | Composition of solutions | ||
| Carboxin | Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 µg/ml | ||
| CM plates | 0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH4NO3, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose | ||
| Geneticin (G418) | Stock: 50 mg/ml in H2O, final concentration: 500 µg/ml | ||
| HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm) | Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H2O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 °C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal. | ||
| Heparin | Stock: 15 mg/ml | ||
| Holliday salt solution | 16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) trace elements, 2.0 ‰ (w/v) MgSO4; sterile filtrate | ||
| Holliday vitamin solution | 0.1‰ (w/v) Thiamin, 0.05‰ (w/v) Riboflavin, 0.05‰ (w/v) Pyridoxin, 0.2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05‰ (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2‰ (w/v) Nicotinic acid, 0.2‰ (w/v) Cholinchlorid, 1.0‰ (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 °C | ||
| Hygromycin | Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 µg/ml | ||
| Nourseothricin | Stock: 200 mg/ml in H2O, final concentration: 150 µg/ml | ||
| NSY-glycerol-medium | 0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose, 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) Yeast Extract 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave | ||
| STC, pH 8 | 1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl2; filter sterile | ||
| STC/PEG | 40 % (v/v) PEG in STC-buffer | ||
| TE buffer, pH 8 | 1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 µg/ml RNaseA in TE buffer | ||
| Trace elements | 0.06‰ (w/v) H3BO3, 0.14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0.4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (w/v) CuSO4*5H2O | ||
| Trichoderma lysing enzymes solution | 12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave | ||
| Usti-lysis buffer 1, pH 8 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter. | ||
| Usti-lysis buffer 2 | mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio | ||
| YEPS-Light medium | 1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar |
References
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