Summary
Um protocolo para perfis metabólicos de amostras biológicas por capilar espectrometria de eletroforese em massa usando um design de interface ponta porosa sheathless é apresentado.
Abstract
Em metaboloma, uma vasta gama de técnicas de análise é utilizado para o perfil global (endógenas) metabolitos em amostras complexas. Neste trabalho, um protocolo é apresentado pela análise de metabolitos aniónicos e catiónicos em amostras biológicas por electroforese capilar de espectrometria de massa (CE-MS). CE está bem adequada para a análise de metabolitos altamente polares e carregados como os compostos são separados com base na sua razão de carga-a-tamanho. Um design sheathless interface desenvolvida recentemente, ou seja, uma interface de ponta porosa, é usado para o acoplamento de CE em ionização por electrospray (ESI) MS. Esta abordagem interface permite o uso eficaz da propriedade intrínseca de baixo fluxo de CE em combinação com MS, resultando em limites de detecção nanomolares para uma ampla gama de classes de metabolitos polares. O protocolo aqui apresentado é baseado no emprego de um nu capilar de sílica fundida com um emissor de ponta porosa em condições de separação de pH baixo para a análise de umampla gama de classes de metabolitos em amostras biológicas. Demonstrou-se que o mesmo método sheathless CE-MS pode ser usado para a caracterização de metabolitos catiónicos, incluindo aminoácidos, nucleósidos e péptidos pequenos, ou metabolitos aniónicos, incluindo fosfatos de açúcar, nucleótidos e ácidos orgânicos, por única interrupção da detecção por MS e separação polaridade da tensão. Altamente rico em informação perfis metabólicos em várias amostras biológicas, tais como a urina, fluido cerebrospinal e extractos da linha de células de glioblastoma, pode ser obtido por este protocolo em menos de 1 hora de análise CE-MS.
Introduction
Em metabolômicas contemporâneas, sofisticadas técnicas de separação analítica são utilizados para analisar uma ampla gama de classes de metabolitos, a fim de obter uma leitura representativa para fora do estado fisiológico de um organismo 1. O objectivo final de um estudo metabolômica é a obtenção de uma resposta a uma dada questão biológica / clínica. Actualmente, a base de dados Metaboloma humano é composto por mais de 40.000 entradas de metabolitos que representam compostos endógenos e exógenos (o último originários de nutrientes, microbiota, drogas e outras fontes) 2. Dada a diversidade enorme das propriedades físico-químicas e gama de concentrações destes metabolitos, várias técnicas analíticas com diferentes mecanismos de separação deve ser usado em conjunto, a fim de perfil como muitos metabolitos possíveis numa dada amostra biológica. Por exemplo, Psychogios et al., Utilizando uma combinação de técnicas de separação de cinco analíticas para prof metabólicailing de soro humano, resultando na detecção de mais do que 4.000 quimicamente diversos metabolitos 3.
Neste trabalho, será dada atenção às estratégias CE-MS recentemente desenvolvidos para o perfil metabólico de amostras biológicas 4,5. Em CE, electroforese mais especificamente capilar de zona (CZE, normalmente referido como o CE), os compostos são separados com base na sua razão de carga-a-tamanho e, portanto, esta técnica analítica é altamente adequado para a análise de metabolitos polares e carregados. O mecanismo de separação da CE é fundamentalmente diferente de técnicas baseadas em cromatográficas, proporcionando assim uma visão complementar sobre a composição metabólica de 6-8 amostras biológicas. Soga e colaboradores foram os primeiros a mostrar a utilidade do CE-MS para o perfil global de de metabolitos em amostras biológicas 9,10. Até agora, a viabilidade ea utilidade da CE-MS para metabolômica tem sido amplamente demonstrado 11-15.CE está geralmente acoplado a MS através de um invólucro de líquido interface técnica 16,17; No entanto, devido à diluição do efluente capilar pela bainha-líquido, a sensibilidade de detecção é intrinsecamente comprometida.
Recentemente, demonstrou-se que o uso de uma interface sheathless melhorou significativamente a área de detecção de metabolitos presentes em várias amostras biológicas, em comparação com CE-MS, utilizando uma interface líquido-bainha clássica 5,18,19. Por exemplo, cerca de 900 características moleculares foram detectadas em urina humana por sheathless CE-MS passo que cerca de 300 características moleculares foram observados com bainha-líquido CE-MS 5. A interface sheathless utilizado foi baseado em um emissor de ponta porosa, que foi inventado por Moini 20, permitindo o uso eficaz da propriedade intrínseca de baixo fluxo de CE em combinação com nano-ESI-MS.
A fim de estimular o uso de sheathless CE-MS no campo da metabolômica,um protocolo é apresentada descrevendo como esta abordagem pode ser utilizada para a análise de metabolitos altamente polares em amostras biológicas, tal como exemplificado para a análise de extractos da linha de células de glioblastoma. Mostra-se que o método de CE-MS sheathless para o perfil de metabolitos catiónicos também podem ser utilizados para a caracterização de metabolitos aniónicos utilizando exactamente as mesmas condições de capilares e de separação, reduzindo assim o tempo de análise e fornecendo uma plataforma analítica único para o perfil global metabólitos carregada. O protocolo também descreve uma estratégia para o alinhamento eficaz do emissor sheathless ponta porosa com o instrumento de MS.
Protocol
NOTA: O protocolo descrito aqui para o uso de sheathless CE-MS para estudos perfil metabólico é apenas para uso em laboratório. Os procedimentos descritos abaixo são baseados em 4,5 trabalho recentemente publicado. Mais detalhes experimentais podem ser encontrados nestes documentos. Antes de usar este protocolo, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS). Por favor, use todos os procedimentos de segurança laboratoriais adequados, incluindo óculos de segurança, jaleco e luvas, quando da realização dos experimentos descritos neste protocolo.
1. Preparação dos reagentes e amostras Solutions
- Preparação do electrólito de fundo (BGE)
- Prepara-se uma nova solução de BGE (10% (v / v) de ácido acético, pH 2,2) a cada dia.
- Adicionar 9,0 ml de água num frasco de vidro de 10 ml e adicionar 1.0 ml de ácido acético à água numa hotte. Misturar a solução, cuidadosamente, com um vórtice.
- Preparação de standar metabolitomistura d
- Dissolver 50 ul de uma mistura padrão de 50 mM cação contendo 60 metabólitos catiônicos em 50 ul de água e misturar a solução completamente. Armazenar a -80 ° C quando não estiver em uso.
- Dissolve-se 50 ul de uma mistura padrão contendo anião 50 uM 30 metabolitos aniónicos em 50 ul de água e misturar a solução completamente. Conserva-se a solução, em alíquotas para evitar ciclos de congelamento / descongelamento do mesmo padrão de mistura, a -80 ° C quando não estiver em uso.
NOTA: O metabolito misturas padrão são estáveis durante 3 meses, quando armazenado adequadamente a -80 ° C.
- Preparação de extractos a partir da linha celular de glioblastoma
- Lavam-se as células U-87 MG de glioblastoma humanas aderentes três vezes com solução de cloreto de sódio a 1 ml de gelo-frio 0,9% 21.
- Adicionar 2 ml de solução de metanol / água gelada (8/2, v / v) para as células aderentes e raspar usando um raspador de células de borracha com ponta 21. Recolher a solução de metanol / água em um tubo e ultrasonicate durante 2 min.
- Adicionar clorofórmio para a fracção de metanol / água (proporção final 8/8/2, v / v / v) e centrifuga-se a amostra durante 10 min a 16100 xg e 4 ° C.
- Recolher a camada de metanol / água e evapora-se esta fracção com um concentrador de vácuo. Reconstituir o material seco em 50 ul de água, para análise por sheathless CE-MS. Quando não estiver em utilização armazenar a amostra a -80 ° C.
2. Configurando o CE-MS Sistema Sheathless
- Instalação do cartucho de sílica fundida nua com o emissor ponta porosa
- Coloque um novo cartucho de sílica fundida nua com um emissor de ponta porosa (comprimento 30 mm de diâmetro interno x 90 cm total) no instrumento CE.
- Aplicar uma lavagem para a frente a 50 psi durante 15 min com o software que controla o instrumento CE utilizando metanol a 100% e verificar visualmente se o líquido flui para fora da capiltomada lary durante esta etapa de lavagem. Além disso executar uma lavagem no sentido oposto a 50 psi durante 5 min, utilizando a solução BGE para examinar visualmente se o líquido flui para fora do capilar condutora.
- Repetir o passo 2.1.2, a uma pressão de 100 psi no caso de não formação da gota de líquido ter sido observada na saída do tubo capilar. Instalar um novo cartucho de sílica fundida nu se sem formação de gota de líquido foi observada durante este passo.
- Enxaguar o capilar de separação com água a 50 psi durante 10 min, seguido de NaOH 0,1 M a 50 psi durante 10 min, em seguida, por água a 50 psi durante 10 min e, finalmente, com BGE a 50 psi durante 10 min.
NOTA: As etapas 2.1.1 2.1.4 até que só são necessários para a instalação de um cartucho novo capilar.
- Acoplamento do capilar porosa emissor dica para ESI-MS
NOTA: antes do acoplamento do capilar para o MS CE, assegurar que o instrumento de MS foi calibrado e conectado ao sistema CE. Definir a tensão ESI para0. Montar o instrumento MS com uma fonte nanospray. Gas 1, gás 2 e temperatura do aquecedor de interface não foram aplicados como ESI em taxas de fluxo muito baixas ocorre por apenas aplicando a tensão de pulverização iónica definir a 1500 V. Set a cortina a 5 psi.- Remover a ponta do pulverizador do cartucho de sílica fundida a partir do tubo de água e instalá-lo no adaptador de origem de nanospray para acoplamento com o instrumento de MS. Certifique-se de que a altura dos frascos BGE no instrumento CE coincidir com a altura da ponta do pulverizador.
- Entrada para o fluxo de líquido através do capilar condutora por lavagem com BGE a 50 psi durante 5 min. Durante este passo de lavagem uma formação de gotas na base da agulha pulverizador ESI deve ser observada.
- Lave o capilar de separação com BGE a 50 psi durante 10 min na direção de avanço. formação da gota deve ser observado na ponta do bico emissor poroso (ponta do pulverizador) durante este passo.
- Posicionar o emissor de ponta porosa para a entrada da entrada MS a uma distância de cIRCA 2 a 3 mm.
- Aplicada uma tensão de 30 kV, utilizando um tempo de rampa de 1 min e iniciar a aquisição de dados de MS na gama de m / z de 65 a 1000 m / z para estudos perfil metabólico usando primeiro uma voltagem ESI de 0.
NOTA: O espectro de massa deve ser desprovido de sinal como não deve haver electropulverização. - Definir a tensão ESI a 1.000 V, enquanto continuar a medição de dados. Aumentar a tensão de ESI com incrementos de 200 V até que um sinal de fundo constante é observada durante pelo menos 15 min.
- Optimizar a posição do emissor ponta porosa com respeito ao centro da entrada de MS, movendo-o em x, y, ou z-sentido, a fim de ver qual a posição que proporciona o sinal de máxima e MS mais estável (electroferograma iónico total).
- Depois de optimizar a posição do emissor de ponta porosa e determinando a tensão óptima ESI, definir a tensão ESI de 0 V e diminuir a tensão de CE de 30 kV a 1 kV, utilizando um tempo de rampa de 5 min.
- Crie um método usin MSg a tensão ESI óptima e um método de CE sobre o instrumento CE para a análise de padrões de metabolitos e amostras biológicas.
3. Análise do metabolito Padrões e amostras biológicas
- A avaliação do desempenho do sistema sheathless CE-MS
- Transferir 20 uL da mistura padrão metabolito aniónico num microtubo 100 ul vazio (tubo de PCR) que se encaixa dentro de um frasco CE e colocar esse frasco no tabuleiro das amostras de entrada.
NOTA: O volume mínimo exigido no microtubo para uma injecção de confiança é de 2 mL.- Iniciar a aquisição MS método modo de ião negativo criado durante o passo 2.2.9 e subsequentemente iniciar a sequência CE usando o software que controla o instrumento CE.
- Lavar a separação capilar com BGE a 50 psi durante 3 min, seguido por injecção de 2,0 psi durante 60 seg (20 nl correspondente a 3% do volume capilar) e depois por injecção BGE a 1,0 psi durante 10seg.
NOTA: Posteriormente, a aquisição de dados MS é acionado. - Aplicada uma tensão de -30 kV com um tempo de rampa de 1,0 min com uma pressão de 0,5 psi durante 30 min na entrada. Depois de 30 minutos de separação electroforética, pare de aquisição de dados de MS e diminuir a tensão CE para -1 kV utilizando um tempo de rampa de 5 minutos (uma diminuição gradual da tensão de EC após a separação electroforética melhora a durabilidade do emissor capilar ponta porosa).
- Entre as injecções de amostra, lavar o capilar com água, hidróxido de sódio 0,1 M, água e BGE cada a 30 psi durante 3 min.
- Analisar os dados registados mediante a determinação dos tempos de migração e a intensidade do sinal da mistura metabolito aniónico analisados.
- Avaliar se os padrões de metabolitos aniónicos aparecem na região entre 10 e 28 min.
- Verificar se três isómeros estruturalmente relacionados, isto é, D-glucose-1-fosfato, D-glicose-6-fosfato e D-frutose-6-fosfato sãoparcialmente separada, ou seja, a resolução entre os dois primeiros picos é cerca de 0,75 e dos dois últimos picos é cerca de 0,50 (ver Figura 1).
NOTA: A resolução de 1.5 indica uma separação da linha de base de dois picos adjacentes. - Repita os passos 3.1.1 e 3.1.2 para a mistura metabólito catiônica. Certifique-se de que a detecção MS está agora no modo de iões positivos e tensão CE é 30 kV.
- Analisar os dados registados mediante a determinação dos tempos de migração e a intensidade do sinal da mistura metabolito catiónico analisados.
- Avaliar se os padrões de metabolitos catiônicos aparecem na região entre 8 e 22 min. Verifique se isoleucina e leucina estão migrando entre 15 e 15,5 min e determinar se a resolução é de cerca de 0,5.
- Transferir 20 uL da mistura padrão metabolito aniónico num microtubo 100 ul vazio (tubo de PCR) que se encaixa dentro de um frasco CE e colocar esse frasco no tabuleiro das amostras de entrada.
- Análise de amostras biológicas
- Repita os passos 3.1.1 e 3.1.2 para perfis metabólicos aniônica do extrato da linha de células de glioblastoma.
NOTA: O con metabólicatenda obtida após pré-tratamento de amostra corresponde a uma densidade celular de cerca de 20 células / NL, por conseguinte, uma injecção de 20 nl é o equivalente a 400 células por análise. . - Criar um electrofograma ion extraído para o ácido láctico metabolito (m / z 89,0243) usando 5 precisão em massa o MDA e verificar se a intensidade do sinal é acima de 100.000 contagens.
- Repita os passos 3.1.1 e 3.1.2 para perfis metabólicos catiônica do extrato da linha de células de glioblastoma.
NOTA: A electrofograma total de iões altamente rico em informações devem ser observados durante uma injeção de 20 nl neste modo. - Após as análises, ou quando não estiver em uso, enxaguar o capilar com água a 50 psi durante 15 min e armazenar a parte de entrada do capilar num frasco para injectáveis contendo água e a secção poroso (parte de saída) num tubo também contendo água.
- Repita os passos 3.1.1 e 3.1.2 para perfis metabólicos aniônica do extrato da linha de células de glioblastoma.
Representative Results
O método sheathless CE-MS proposto é capaz de proporcionar alta eficiência, isto é, números de placas que variam de 60000 a 400000, os perfis de metabolitos aniónicos e catiónicos em limites de detecção nanomolares usando 10% de ácido acético (pH 2,2) como BGE. O desempenho da separação do método para a análise de metabolitos altamente polares aniónicos é demonstrada por três isómeros de fosfato de açúcar estruturalmente relacionados (Figura 1). Embora uma separação da linha de base não foi obtido para estas três analitos, uma separação parcial é suficiente para permitir a sua detecção selectiva por EM uma vez que estes analitos têm o mesmo massa exacta. O potencial do método de EC-MS sheathless para o perfil metabólico do número limitado de células, isto é, uma injecção nl 20 corresponde a 400 células (densidade de células é de cerca de 20 células / nl), é demonstrada pela análise de metabolitos catiónicos num extracto da linha celular de glioblastoma (Figura 2), em que mais do que 300 características moleculares foram detectados acima de um ≥ S / N-proporção de 5.
Figura 1. Análise de isómeros de fosfato de açúcar por sheathless CE-MS. Electrofograma ion extraído para os três isômeros de fosfato de açúcar (25 um) obtidos com sheathless CE-MS no modo de iões negativos. Condições experimentais: BGE, 10% de ácido acético (pH 2,2); tensão de separação, -30 kV (0,5 psi aplicada na entrada do capilar CE); injecção da amostra, 2,0 psi durante 60 seg. Reproduzido com permissão 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise de isoleucina e Leucine por CE-MS sheathless. electroferograma ião Extraído de dois isómeros de aminoácidos (25 um) obtidos com sheathless CE-MS em modo de ião positivo. Condições experimentais: BGE, 10% de ácido acético (pH 2,2); tensão de separação, 30 kV; injeção da amostra, 2,0 psi para 60 seg. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Potencial de sheathless CE-MS para perfilar metabolitos catiónicos em um extrato de linhagem de células. Perfil metabólico (electroferograma iónico total) observada no extracto de uma linha celular de glioblastoma com sheathless CE-MS em modo de ião positivo. Condições experimentais: BGE, 10% de ácido acético (pH 2,2); tensão de separação, 30 kV; injecção da amostra, 2,0 psi durante 60 seg. Reproduzido com permissão 4 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Um método sheathless CE-MS empregando um emissor de ponta porosa foi apresentado para a análise de metabolitos altamente polares e carregados. Uma característica única desta abordagem é que os metabolitos aniónicos ou catiónicos podem ser perfilado por única interrupção da tensão e detecção do CE polaridade MS. Uma grande variedade de metabolitos altamente polares e carregados em amostras biológicas podem ser analisadas com uma eficiência de separação elevada, que é crucial para metabolitos estruturalmente semelhantes, e com limites de detecção da (baixa) gama nanomolar. O protocolo apresentado centrado na utilização de sheathless CE-MS para perfis metabólicos de extractos de células, de modo a exemplificar a utilidade do método para o perfil metabólico de uma amostra biológica. A abordagem aqui descrita pode também ser utilizado para perfis metabólicos de outros tipos de amostras biológicas, tais como a urina humana 5, dado que um processo de pré-tratamento adequado da amostra é utilizado.
O sheathless CE-MS metod baseia-se um emissor de ponta porosa que permite o uso da propriedade intrínseca de baixo fluxo de CE. Neste contexto, um sinal ESI estável é um pré-requisito para os estudos de perfis metabólicos reprodutíveis. Assim, é importante que a ponta do pulverizador está correctamente posicionado em frente da entrada de MS. Nesta configuração, o processo de ESI é principalmente dependente da natureza do BGE e, por conseguinte, a optimização BGE é crítica. A configuração sheathless é menos versátil em comparação com os sistemas líquidos de revestimento-CE-MS, onde todos os tipos de composições de revestimento-líquido podem ser adicionados para melhorar a eficiência de ionização. A agulha sheathless pulverizador ESI precisa de ser completamente cheia com líquido condutor (isto é, solução de BGE). Um sinal ESI instável pode resultar de um capilar parcial ou totalmente conectado. Enxaguar a altas pressões com BGE pode resolver este problema. Caso contrário, o capilar de separação tem de ser substituído. Antes da avaliação do desempenho analítico, um sinal de fundo ESI estáveldeve ser gerada em primeiro lugar, que é consistente de um dia para o outro.
O desempenho analítico do método sheathless CE-MS para estudos de perfis metabólicos precisa ser verificada diariamente utilizando misturas padrão metabólito. Sob as mesmas condições experimentais, os tempos de migração consistentes, ou seja, a variação inferior a 3% para dentro-dia (n = 10) e entre-dias (n = 5), utilizando uma injecção de 20 nl de uma mistura padrão de metabolito (12,5 uM), pico devem ser obtidas alturas / áreas (variação abaixo de 15%) e números de placas (variando entre 60.000 e 400.000). Os limites de detecção deve ser na gama nanomolar para a maioria dos padrões de metabolito. Somente quando esses critérios forem cumpridos é o método pronto para perfis metabólicos de amostras biológicas. Se não, o instrumento MS necessita de ser ajustado e re-calibrados ou o emissor de ponta capilar poroso necessita de ser alterada.
Um passo de lavagem eficaz entre CE-MS análise é de grande importância, não só paraevitar efeito residual, mas também para manter o desempenho de separação. transição potencial pode ser causada por frascos BGE contaminados com a amostra e, portanto, resolvido por substituição com novos frascos BGE. Quando o método sheathless CE-MS não está em uso, é importante para desconectar o capilar de separação e para armazenar o lado de entrada do capilar em água e o exterior submersa com a manga de protecção num tubo contendo água para prolongar a vida útil capilar.
Em resumo, o método de CE-MS sheathless proposto apresenta um forte potencial para o perfil metabólico de amostras biológicas, quando utilizado de acordo com os procedimentos relatados neste protocolo. Nesta fase, os dados de comparação inter-laboratoriais são definitivamente necessário para sheathless CE-MS, a fim de avaliar o (longo prazo) reprodutibilidade ea robustez desta abordagem para metabolômica. Este protocolo pode estimular um tal estudo. Vários desafios analíticos ainda precisa ser considerado. Para perf idealormance, a corrente CE deve ser mantido de preferência abaixo de 5 mA e, nesta fase, os capilares emissores de ponta porosa são fornecidos apenas em um comprimento de 91 cm, que podem dificultar o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento. Além disso, um tampão de baixo pH separação foi usada para perfis metabólicos aniónico que pode não ser o mais óptimo para a obtenção de uma separação da linha de base de fosfatos de açúcar relacionados estruturalmente. Também é importante que só os metabolitos aniónicos podem ser analisadas e que são (parcialmente) carregada negativamente sob as condições de separação utilizadas. O próximo passo é avaliar a utilidade do método de EC-MS sheathless para estudos clínicos perfil metabólico, tal como actualmente, um único emissor de ponta capilar porosa só pode ser utilizado para a análise de mais de 100 amostras biológicas.
No geral, um maior desenvolvimento da abordagem sheathless CE-MS irá abrir uma nova direção no campo da metabolômica, ou seja, no sentido de uma compreensão mais profunda das funções biológicas em samplas-restrito casos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | OptiMS adapter required to couple CESI to MS |
| OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 μm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
| OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | |
| CESI vials | Sciex | B11648 | |
| Micro vials | Sciex | 144709 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | A6283 | Use in fume hood |
| Cationic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-3034 | |
| Anionic metabolite mixture | Human Metabolome Technologies | H3304-1031 | |
| Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv) | Sigma | 14262 | Use in fume hood |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72079 | 0.1 M |
| U-87 MG Glioblastoma cell line | Sigma | 89081402 | |
| Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic; use in fume hood |
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