Dit protocol beschrijft het enten van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) en interferon-γ (IFN-γ) responsen door natuurlijke killer (NK) cellen, natuurlijke killercellen (NKT) cellen te meten, en adaptieve T-lymfocyten na de infectie. Dit protocol beschrijft ook hoe om te overleven onderzoek bij muizen na infectie met een aangepaste LD 50 dosis van de ziekteverwekker.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Experimentele infectie met
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
L. monocytogenes is een gram-positieve bacterie die een oorzaak van voedsel overgedragen ziekte bij mensen. Experimentele infectie van muizen met deze ziekteverwekker zeer informatief over de rol van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem cellen en specifieke cytokinen in gastheer immuniteit tegen intracellulaire pathogenen zijn. Productie van IFN-γ door aangeboren cellen tijdens subletale infectie met L. monocytogenes is belangrijk voor het activeren van macrofagen en snelle bestrijding van het pathogeen 1-3. Bovendien, IFN-γ productie door adaptieve geheugen lymfocyten is belangrijk voor het vullen van de activering van het aangeboren cellen na 4 herinfectie. L. monocytogenes infectie model vormt dus een groot hulpmiddel voor het onderzoeken of er nieuwe therapieën die zijn ontworpen om IFN-γ verhogen van invloed zijn op IFN-γ responsen in vivo en zijn productieve biologische effecten zoals het verhogen van bacteriële verwijdering en overleving verbeteren muis vaninfectie. Hier beschreven is een eenvoudig protocol voor hoe intraperitoneale infectie van C57BL / 6J muizen met de EGD stam van L. monocytogenes te voeren en IFN-γ productie door NK-cellen, NKT-cellen en adaptieve lymfocyten door flowcytometrie gemeten. Bovendien worden procedures beschreven: (1) groeien en voorbereiden van de bacteriën voor inoculatie (2) meten bacteriële verontreiniging in de milt en lever, en (3) overleving maatregel dier eindpunten. Representatieve gegevens worden ook verschaft om te illustreren hoe deze infectie model kan worden gebruikt om het effect van specifieke middelen die IFN-γ reacties op L. monocytogenes en overleving van muizen uit deze infectie te testen.
Inleiding
IFN-γ is een cytokine die cruciaal is voor het mediëren van immuniteit tegen intracellulaire pathogenen en voor het regelen tumorgroei 5. Het belang van deze cytokine in bacteriële resistentie blijkt uit de observatie dat de mens met mutaties in de IFN-γ signaalweg zijn zeer gevoelig voor infectie met mycobacteriën en Salmonella 6. Evenzo muizen die zowel IFN-γ of IFN-γ receptor vertonen defecten in weerstand tegen mycobacteriën 7-9 en andere intracellulaire pathogenen waaronder L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13 en 11 bepaalde v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
veiligheid Verklaring
Dit protocol beschrijft infectie van muizen met levende L. monocytogenes. De ziekteverwekker wordt veilig behandeld onder BSL2 omstandigheden door getraind personeel die niet immuungecompromitteerd. Immunogecompromitteerde mensen onder zwangere vrouwen, ouderen en mensen die HIV-geïnfecteerde of chronische aandoeningen die behandeling met immunosuppressieve therapie nodig hebben. Het personeel moet een beschermende lab jas of jurk, handschoenen, masker en oogbescherming te trekken tijdens het hanteren van besmette monsters. De hierin beschreven werk werd uitgevoerd onder BSL2 voorwaarden waaronder een certific....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 3 toont enkele typische flowcytometrie kleuring van IFN-γ in milt NK en NKT cellen op 24 uur na infectie met 10 5 CFU van het pathogeen. Deze figuur illustreert ook de gating strategie voor de kleuring paneel in Tabel 2 beschreven. Figuur 4 toont enkele representatieve gegevens die in een experiment waarbij mannelijke muizen werden behandeld met de PPARa antagonist IS001 of dragercontrole verkregen, geïnfecteerd met 10 .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een protocol van hoe een eenvoudige experimentele besmetting uit te voeren met de EGD stam van L. monocytogenes 25 in mannelijke of vrouwelijke C57BL / 6J muizen. Dit protocol werd opgezet met het oog op het bestuderen van het effect van een unieke chemische IS001 IFN-γ productie door aangeboren en adaptieve lymfocyten in vivo 31. Door het monitoren bacteriële verwijdering en overleving na infectie werden inzichten in hoe deze veranderingen in IFN-γ beïnvloed v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
De ontwikkeling van dit protocol werd ondersteund door een subsidie van CIHR (MOP97807) aan SED.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| Agar | BD | 214010 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| 1x PBS | Sigma | D8537 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| KHCO3 | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Na2EDTA | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Voor gebruik, inactief maken door verhitting op 56 °C gedurende 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | elke merk zou geschikt moeten zijn |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Gebruik 4 μl in 6 ml celcultuur |
| 16% Paraformaldehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Verdun tot 4% PFA in ddH2O of 1x PBS |
| 10x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Verdun 1x in ddH2O |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Verdun 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Verdun 1:1.000 (we hebben ook gebruik gemaakt van vitaliteitskleuren van Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | De fabrikant raadt een bepaalde testgrootte aan; deze moet echter worden getitreerd voor gebruik. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | De fabrikant raadt een bepaalde testgrootte aan; deze moet echter worden getitreerd voor gebruik. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Ontvangen als een geschenk van de faciliteit |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | De fabrikant raadt een bepaalde testgrootte aan; deze moet echter worden getitreerd voor gebruik. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | De fabrikant raadt een bepaalde testgrootte aan; deze moet echter worden getitreerd voor gebruik. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | De fabrikant raadt een bepaalde testgrootte aan; deze moet echter worden getitreerd voor gebruik. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | De fabrikant raadt een bepaalde testgrootte aan; deze moet echter worden getitreerd voor gebruik. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Gebruik een druppel per kleuring |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Gebruikt voor het meten van het interferon gamma in het cultuursupernatant |
| 50 ml geventileerde buizen voor cultuur | Gebruikt voor het kweken van de bacteriën, elk merk zou geschikt moeten zijn | ||
| 1,5 ml microcentrifugebuizen | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| bacteriële petrischalen | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| 2 ml cryobuisjes | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| UV-spectrometer | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| veiligheidstechnisch ontworpen naalden | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| C57BL/6J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Bestel voor aankomst op 7 weken |
| Bleach | Voor ontsmetting | ||
| 70% Ethanol | Voor ontsmetting | ||
| Glaspebbeltjes | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Centrifuge | rotor, emmers, emmerdeksels. | ||
| Microcentrifuge | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Steriele Glycerol | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Pipettips | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Pipet | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Chirurgische instrumenten | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| 70 micron zeefjes | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| 3 ml injectiespuit | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Pipetpistool | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Filtratie-eenheden | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Trypanblauw | Verdun 1 op 9 in ddH2O, elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Hemocytometers | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| Platen met ronde bodem | elke merk zou geschikt moeten zijn | ||
| FACs-buizen | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| BD LSR II | BD | Elke flowcytometer kan worden gebruikt voor acquisitie die een geschikte laserconfiguratie en filterset heeft om de fluorochormen te onderscheiden | |
| Flowjo-software | Treestar |
Referenties
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
