我们介绍了一种利用基质凝胶栓塞血管生成实验的改良方法，在小鼠体内研究人源内皮细胞与周细胞相互作用的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
血管生成是指由现有血管形成新血管的过程。新生血管的生长需要内皮细胞的增殖、迁移和排列协调进行，以形成管状结构，随后募集周细胞以提供壁层支持并促进血管成熟。目前 体外 细胞培养方法无法完全重现内皮细胞与周细胞相互作用形成功能性血管的复杂生物学环境。我们提出了一种新型的应用方案 体内 基质凝胶栓塞实验用于研究内皮细胞与周细胞的相互作用以及功能性血管的形成，采用重度联合免疫缺陷突变型（SCID）小鼠。简言之，将基质凝胶与含有内皮细胞（可选择性加入周细胞）的溶液混合，随后注射至麻醉状态下的SCID小鼠背部。14天后，取出基质凝胶栓，固定并切片进行组织学分析。可通过商用统计平台对各实验组之间成熟血管（以管腔内存在红细胞为定义标准）的长度、数量、大小以及周细胞覆盖程度进行量化和比较。除作为血管生成实验手段外，该基质凝胶栓塞实验还可用于遗传学研究及作为药物发现的平台。综上所述，本方案将使研究人员能够补充现有 体外 用于研究内皮细胞-周细胞相互作用及其在全身性或肺部血管生成中相关性的检测方法。
引言
血管生成是指从已有的血管网络形成新血管的过程1，是当前从正常发育到疾病等多个研究领域关注的重点。这一动态过程包括内皮细胞（ECs）的增殖与迁移，以及周细胞的募集，从而构建出朝向需要氧气和营养供应部位的血管管腔2。研究这一过程需要一种同样具有动态性的检测方法，最重要的是能够重现血管管腔形成的三维特性。体外三维基质检测技术已被开发以满足这一需求，并已成功帮助研究人员明确血管生成在时空上的各个独立步骤3,4,5,6。然而，这些体外三维基质模型仅限于研究非灌注性血管，因此缺少与血管生成过程相关的关键组分（例如，循环中的促生长和抑制因子、血管床所受的非生理性张力/作用力），且无法模拟活体组织中存在的复杂环境。为克服这一局限，已开发出多种体内血管生成检测方法7，其中包括基质凝胶栓塞检测法，这将是本报告的重点8,9。
基质凝胶栓塞实验是一种成熟的体内血管生成检测方法，因其能够提供一个可靠的平台来评估不同细胞和物质在血管生成中的作用，而受到研究人员的青睐。基质凝胶是一种市售的基底膜溶液，由Engelbreth-Holm-S....
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方案
伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得斯坦福大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
注意：动物使用 3% 气化异氟烷和 3% 氧气供应进行麻醉2 气体。使用兽用眼膏可能有助于防止麻醉期间眼睛干涩。
1. 细胞准备
- 在100 mm培养皿中，使用10 ml适当的培养基培养人内皮细胞和周细胞。每2-3天更换10 ml新鲜培养基，直至细胞达到80%融合度。
- 将内皮细胞（ECs）培养于完全内皮细胞培养基（ECM）中，该培养基需添加厂家提供的5%胎牛血清（FBS）、10%青霉素/链霉素和10%内皮细胞生长补充剂。
- 将周细胞培养于完全周细胞培养基（PM）中，该培养基需添加厂家提供的2% FBS、10%青霉素/链霉素和10%周细胞生长补充剂。
- 制备细胞混合物
- 计算实验组和对照组所需的细胞数量。
注：实验组每个凝胶栓包含一百万个（1 × 106）人内皮细胞和二十万个（2 × 105）周细胞。对照组每个凝胶栓仅包含120万个内皮细胞。阴性对照组仅含基质凝胶。每组应至少包含四个凝胶栓，因此需要两只小鼠，因为每只小鼠的下背部两侧均可注射凝胶栓。三个凝胶栓用于实验的三重复，第四个可作为备用以防失败。额外准备25%的细胞以匹配凝胶的额外体积。 - 从培养皿中收集细胞并进行计数。
- 计算实验组和对照组所需的细胞数量。
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结果
代表性 H&E 和基质凝胶栓塞切片的免疫荧光染色结果如图所示 图2. 仅来自EC的栓塞部分显示出一些血管，这些血管大多未被血液灌注（图2 左上角，黑色箭头）而包含内皮细胞和周细胞的凝胶块则显示出多条灌注良好的血管，管径较大，且周细胞覆盖完整，表现为SMA阳性信号紧邻CD31阳性内皮细胞。这些结果表明，周细胞在新生血管形成过程中发挥重要作用，且该动态过程可在体外被成功重现并易于分析 体内 模型
图1. 组织包埋于组织包埋盒中的方向。 在分离出基质凝胶.......
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讨论
基质凝胶栓塞实验已被证明是一种便捷而有效的方法，可用于评估血管生成过程中基因的调控作用、促血管生成和抗血管生成化合物的体内活性，并可作为体外实验的补充。本文中，我们详细描述了一种新型的人源血管生成基质凝胶栓塞实验方法，用于研究血管形成过程中内皮细胞与周细胞之间的相互作用。
本方案中包含若干新颖且关键的步骤。建议使用低代次（第1至第4代）的细胞，因为较年轻的细胞在为期14天的实验过程中具有更高的存活率。内皮细胞的使用数量至少为一百万个，内皮细胞与周细胞的比例为5:1；然而，增加周细胞的数量可增强其在毛细血管上的覆盖程度。对于仅注射内皮细胞的实验组，注射的细胞总数应等于内皮细胞与周细胞数量之和，即120万个，以确保每个基质胶栓的总细胞数保持一致。准确计算细胞数量与基质胶体积的配比至关重要。基本配比公式为：200 μl基质胶中加入120万个细胞。此外，在注射前，应始终将移液枪头、注射器、基质胶及细胞沉淀置于冰上。由于基质胶具有较高黏度，为避免在细胞悬液中产生气泡，可将1 ml移液枪头尖端剪去约1 cm，以改善液体流动性能。在小鼠准备就绪进行注射前，切勿.......
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披露
不存在竞争性财务利益。
致谢
袁博士获得了美国心脏协会科学家发展基金（15SDG25710448）以及肺动脉高压协会概念验证奖（SPO121940）的支持。V. de Jesus Perez 博士获得了罗伯特·伍德·约翰逊基金会职业发展奖、美国国立卫生研究院资助项目 K08 HL105884-01、肺动脉高压协会奖、美国肺脏协会生物医学研究奖以及斯坦福大学转化研究与应用医学奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| 内皮细胞培养基（ECM）试剂盒 | Sciencell | 1001 | 包含培养基、内皮细胞生长添加剂和青霉素/链霉素，每种组分均按适当体积提供，便于混合 |
| 周细胞培养基（PM）试剂盒 | Sciencell | 1201 | 包含培养基、周细胞生长添加剂和青霉素/链霉素，每种组分均按适当体积提供，便于混合 |
| 原代人肺微血管内皮细胞 | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | 此类细胞也可商业获取。使用第1至第4代细胞 | |
| 原代人肺周细胞 | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | 此类细胞无法商业获取，但脑周细胞可以。 使用第1至第4代细胞 | |
| bFGF（碱性成纤维细胞生长因子） | Peprotech | 100-18B | 储存液浓度为50 μg/ml，溶于含0.1% BSA的PBS中，分装为50 μl每份，保存于-20°C |
| Matrigel基底膜基质 | BD | 356237 | |
| 28G 1 cc 胰岛素注射器 | BD | 329410 | |
| SCID（重度联合免疫缺陷）小鼠 | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma基因敲除品系为最佳品系；使用4-6周龄小鼠 |
| 1.5 ml 无菌微量离心管 | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml 螺口离心管，无菌 | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP笔 | Life Technologies | 8899 | |
| 血细胞计数板 | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair脱毛膏 | Walmart | ||
| 抗人CD31一抗 | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | 工作液稀释比例为1:50 |
| 抗人平滑肌肌动蛋白CY3荧光一抗 | Sigma | C6198 | 工作液稀释比例为1:300 |
| 山羊抗兔二抗；488/绿色 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | 工作液稀释比例为1:250 |
| Prolong Gold DAPI封片液 | Cell Signaling | 8961S | |
| 显微镜载玻片 | VWR | 48300-047 | |
| 1.5号盖玻片 | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| 10倍柠檬酸盐缓冲液 | Millipore | 21545 | |
| 超精细手术剪刀 | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 甲醛（多聚甲醛） | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| 组织包埋盒 | Simport | M492-12 | |
| 山羊血清 | Dako | X0907 |
参考文献
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E.
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