Abstract
memeli vücut patojen istilası kendisini savunmak için yardımcı mekanizmaların çeşitli katmanları ile donatılmıştır. Nötrofiller, dendritik hücreler ve makrofajlar gibi - - bağışıklık sisteminin -profesyonel fagositlerin algılar ve fagositoz 1 boyunca bu işgalci patojenlere temizlemek için doğal yeteneğini muhafaza. Fagositoz hücre yüzeyinde 2, 3 membran yeniden ve aktin biçimlenme koreografi olayları kapsar. Fagositler başarıyla içselleştirmesi ve fagositoz tüm aşamaları yerine sadece yabancı molekülleri ortadan kaldırmak. Bu adımlar tanıma ve hücre yüzeyinde bulunan örüntü tanıma reseptörleri tarafından patojen (PRR) bağlanmasını içerir, aktin-zenginleştirilmiş membranöz çıkıntıları (psödopod) aracılığıyla fagositik fincan oluşumu partikül çevreleyen ve fagozomun kesme phagolysosome olgunlaşması ile izledi sonuçlanırpatojen 3, 4 öldürülmesi.
fagositoz çeşitli aşamalarında Görüntüleme ve miktar bu hücresel sürecin moleküler mekanizmaların için enstrümantal. Mevcut el yazması fagositoz farklı aşamalarını incelemek için yöntemler bildirir. Biz görselleştirmek ve bağlayıcı, fagositik fincan oluşumunu ölçmek için bir mikroskop temelli bir yaklaşım ve fagositlerce partikül içselleştirilmesi açıklar. Fagositik hücreler üzerinde doğuştan reseptörleri den büyük 0,5 mikron, burada mevcut tahliller patojenik mantar Candida albicans ve zimosan ve IgG kaplı boncuklar gibi diğer parçacıkların kullanımını içermektedir hedef parçacığa ligandlar karşılaştıklarında fagositoz oluşur olarak.
Introduction
Bakteriler, virüsler ve mantarlar gibi patojenlere sürekli maruz kalma rağmen, vücudumuzun iyi enfeksiyona karşı koruma sağlayan bağışıklık mekanizması ile donatılmıştır. doğuştan gelen bağışıklık sistemi işgalci patojenlere karşı ilk savunma hattıdır ve tanımak ve yabancı hedeflere içselleştirmek fagositik hücreler esas dayanır.
Fagositoz 0.5 um'den daha büyük, istenmeyen parçacıkların yutulmasına kapsar evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücresel bir süreçtir. Fagositik hücreler yutulma 3 önce patojenler üzerinde mevcut olan patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) tanımasını sağlamak hücre yüzeyinde (aynı zamanda görüntü tanıma reseptörleri PRR'ler olarak da bilinir), bağışıklık reseptörlerin geniş bir ifade eder. Patojen hücre yüzeyindeki reseptör kümeleme tarafından takip ve bir fagositik fincan oluşumunu tetikler bağlama. Bu çevrede çıkıntı aktin odaklı membran yeniden sonuçlanırHedef, sonunda onu saran ve kıstırma-off ayrı bir phagosomal çarpıtma 2, 5 oluşturulur. Fagosom sonra olgunlaşır phagolysosome 6 oluşturan Geç endozomlar ve lizozomlar ile daha sonra füzyon yoluyla acidifies.
Fagositoz reseptör aracılı aktin odaklı bir olay olarak tarif edilmiş olmasına rağmen, bu işlem aynı zamanda, fosfoinositidlerde (İng) ve sfingolipidler 7, 8, plazma zarını oluşturan lipidler, mekansal ve zamansal değişikliği dayanır. Aktin polimerizasyonu fagositik fincan dibinde fosfoiyonositol-4,5-bifosfat (PI (4,5) P2) yerel bir birikimi tarafından dikte edilirken, aktin depolimerizasyon (PI (4,5) P dönüşümü bağlıdır 2 fosfoinositol-3,4,5-bifosfat için (PI (3,4,5) P3) 3, 9. Her iki modifikasyonundahedef etrafında psödopod ve ikinci phagocyte 10 sitozolde parçacıkların batan sağlayan başarılı uzantısı eski yol açar olarak önemlidir.
Fagosite yeteneğine sahip hücreler, ya -profesyonel fagositlerin, makrofajlar / monositler, granülositler / nötrofil ve dendritik hücreler (DC) ya da fibroblast ve epitel hücreleri 11 ile profesyonel olmayan fagositler gibi. profesyonel fagositler tarafından gerçekleştirilen fagositoz patojenlere karşı doğal ve kazanılmış bağışıklık yanıtının koordinasyonundan sorumlu iken, tüm fagositler tarafından gerçekleştirilen fagositoz, doku bakım ve yeniden merkezi bir rol oynar. Profesyonel fagositler sadece adaptif bağışıklık sisteminin lenfoid hücrelere de mevcut antijenleri yutan ve patojen öldürmek, yok ama. Bundan dolayı, bu yol, pro-enflamatuar sitokinlerin salınması ve lemfoid hücrelerin katılımı katkıdaenfeksiyon 12 başarılı blokajı.
Geleneksel biyokimyasal teknikler post-translasyonel modifikasyonlar ve proteinler arasındaki çeşitli yüksek afiniteli birlikleri gibi fagositoz sırasında farklı hücresel süreçleri, moleküler mekanizması ile ilgili bilgi kazanıyor vesile olmuştur. Bununla birlikte, bilinen biyokimyasal yöntemler kullanılarak fagositik etkinlik mekansal ve zamansal dinamikleri ile ilgili bilgiler elde etmek zordur. Canlı hücre görüntüleme sadece bize zaman hassas bir şekilde hücresel olayları izlemek için izin verir ama aynı zamanda bir tek hücre düzeyinde bilgi edinmek için bize sağlar. Burada fagositoz farklı aşamalarında araştırmak için bir yöntem tarif yanı sıra konfokal mikroskopi kullanılarak spatiotemporally tüm süreci analiz etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DC2.4 ve RAW 264.7 Hücre Hatları 1. Hazırlık
Not: makrofaj benzeri hücre hattı RAW 264.7 ve dendritik hücre çizgisi DC2.4 hem sıçangil kökenli ve aşağıdaki koşullar hücreleri büyütmek için kullanıldı.
- Ile takviye edilmiş DMEM içinde RAW 264.7 hücreleri (Dulbecco minimal Eagle ortamı) büyütün% 10,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de etkisiz hale getirilmiş fetal sığır serumu (FBS).
- L-Glutamin yerine DMEM ile takviye edilmiş RPMI kullanımı (Roswell Park Memorial Institute) ortamı dışında RAW 264.7 hücreleri bu benzer koşullar altında DC2.4 hücreleri büyütün.
2. Fluoresan Konjuge parçacıkların hazırlanması: C. albicans, zimosan, IgG kaplı boncuklar
- Candida albicans Büyüyen
- URI (% 2 Bacto-pepton,% 1 ile takviye YPD 25 ml donmuş gliserol stokundan bir C. albicans soyu SC5314 inokülemaya ekstresi,% 2 glukoz ve gece boyunca 30 ° C'de 80 ug / ml Üridin).
NOT: OD 12 600 den fazla Candida kültürü büyüyen kaçının. - C. albicans 1 ml alın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 xg'de aşağı doğru döndürün.
- Süpernatantı aspire ve 1 ml PBS ile pelet yeniden askıya.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüj ile pelet toplayın.
- Adımı tekrarlayın 2.1.4.
- Fagositler sayısına göre C. albicans enfeksiyonu (İB) arasında çok sayıda hesapla ve bölüm 3 OD tarif edildiği gibi 1, 600 1, ml başına 2.5 x 10 7 Candida albicans eşdeğerdir fagositoz testinde devam edin.
Not: Candida-BFP Üretimi referans 13'de açıklanmaktadır.
- URI (% 2 Bacto-pepton,% 1 ile takviye YPD 25 ml donmuş gliserol stokundan bir C. albicans soyu SC5314 inokülemaya ekstresi,% 2 glukoz ve gece boyunca 30 ° C'de 80 ug / ml Üridin).
- Zimosan ve IgG kaplanmış tanelerin hazırlanması
Not: zimosan bir β-glukan içerenSaccharomyces cerevisiae türetilen mantar karbohidrat parçacık hazırlanması. Zimosan makrofajlar ve dendritik hücreler ve inflamasyonun uyandırmak için bilinmektedir ve bu fagositoz çalışmaları 13, 14, 15, yaygın olarak kullanılmaktadır.- Kısaca partikülleri içeren tüp vorteks ve 1.5 ml tüp içine bir deney için yeterli bir miktar kısım.
NOT: Genelde biz (bir hücre için, 10 zimosan parçacıkları veya IgG kaplı boncuklar ekleyin) 01:10 oranını kullanın. - gibi soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir ve 10,000 x g 'de 1 dakika süre ile santrifüjleme ile parçacıkların toplanması.
- Süpernatant aspire ve 1 ml buz gibi soğuk PBS pelletini.
- Adımları tekrarlayın 2.2.2-2.2.3
Not: 2.2.5 adım veya kullanılana kadar 4 ° C 'de tüp depolamak için devam edin. - Bir önlemek için ultrasonik banyo sonikatörü içinde 10 sn için parçacık (120 V, 50-60 kHz) sonikasyonny parçacık toplama.
- Kısaca partikülleri içeren tüp vorteks ve 1.5 ml tüp içine bir deney için yeterli bir miktar kısım.
3. Fagositoz
Not: Fagositoz partikülünün yüzeyinde ligandlarla PRRS etkileşimiyle fagositlerin hücre yüzeyi üzerinde parçacıkların bağlanması ile başlayan karmaşık bir süreçtir. Bağlama aktin montaj ve temas yerinde ilişkili proteinler ve fagositik fincan oluşumu tarafından takip edilir. daha sonra aktin sökme fagozomun oluşur ve partikül tam yutulma sonuçlanır. biz fagositoz farklı aşamalarını tarif görebilirsiniz.
- Bağlanma Deneyi
NOT: Bu deneyin amacı, hedef partikülleri üzerine ligand ve fagositlerle ilgili reseptörleri arasındaki etkileşimi, fagositoz ilk adım izlemektir.- Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Alternonları bir arada, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin.
Not: Hücreler, hemasitometre veya benzer bir teknik kullanılarak sayılabilir. - 10 dakika boyunca 10 ° C'de odasına slayt (veya plakası) yerleştirin.
- Yavaşça her bir kuyunun bir pipet veya aspiratörü kullanarak orta çıkarın.
DİKKAT: odacıklı coverglass sisteminin her kuyu küçük dikkatle bu adımı gerçekleştirin; bir pipet ucu veya aspiratör güçlü bir hava akımı ile hücreleri karıştırmayı kolaydır. - bir hücre kültür ortamı ile floresan etiketli parçacıkları karıştırın (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır). Hücrelere, (10 MOl'de) floresan konjüge-zimosan veya lateks boncuklar-tavşan IgG-FITC (hücre başına 10 parçacıklar) Candida -BFP ekleyin. Tüm hücreler sahiptir sağlamak için de bir odadan 200 ul ortam bir son hacim kullanın.
- 277 de kamara slayt aşağı Spin10 ° C'de 3 dakika boyunca xg.
Not: Bu santrifüj adımı parçacık ve hücreler arasındaki teması artırmak için yardımcı olur ve bağlayıcı işlem eşitler. - Hemen 5 dakika için% 5 CO2 içeren bir 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör odasına slayt aktarın.
- inkübatör odasına slayt çıkarın ve medya aspire.
- Hücreler buzla soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın.
NOT: ışık mikroskobu ile bağlanmamış parçacıkların varlığını kontrol edin ve gerekirse PBS ile birkaç kez yıkayın. Analiz sırasında arka plan gürültüsünü en aza indirmek için kuyudan bağlanmamış parçacıkları çıkarmak için esastır. - Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilerek, PBS içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) eklenerek hücrelerin sabitleyin.
DİKKAT: Bu adım, yüksek toksik, paslandırıcı ve potansiyel kanserojendir% 4 PFA kullanılmasını gerektirir. Bu sıvıyı kullanırken uygun dikkatli alınmalıdır. Ayrıca, ışık örnekleri korur. - iki kere 3.1.9 adımı yineleyin.
NOT: Bu aşamada, hemen önceki PBS çıkardıktan sonra her flakon doldurun. - 10 dakika boyunca PBS içinde 50 mM NH4CI 500 ul inkübe edilerek tespit durdurun.
- Aşama 3.1.10 tarif edildiği gibi PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (PBS içinde% 0.1 saponin,% 0.2 BSA) bağlayıcı tampon 250 ul ilave edilerek hücreler geçirgenliği.
- Leke (: bağlayıcı tampon içinde 500 1 seyreltilmiş) floresan konjuge Phalloidin ekleyerek F-aktin. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe hücreleri.
- Aşama 3.1.10 de tarif edildiği gibi hücreler PBS ile üç kez yıkanır.
- Konfokal mikroskop (63X objektif ve 402 nm ve 488 nm lazer) kullanarak görüntüleri yakalayabilir ve ImageJ 16 kullanarak görüntüleri analiz.
Not: başarılı bir parçacık fagositik cu varlığı ile karakterize edilir bağlanmayerinde p nerede partikül temas fagositik hücre (Şekil 1). adım 3.2.5 bakınız.
- Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Alternonları bir arada, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin.
- Fagositoz Uptake Tahlili
Not: Bu deney konfokal mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak fagositlerce floresan etiketli parçacıkların tam içselleştirilmesini izlemek için tasarlanmıştır.- Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Seçenek olarak ise, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin.
Not: Hücreler, hemasitometre veya benzer bir teknik kullanılarak sayılabilir. - 10 dakika boyunca 10 ° C'de odasının slaytlar (veya plakası) tutun.
NOT: Soğutma senkronize bir fagositoz için sonradan endositoz yanı sıra istenmeyen fagositoz engellemek ve için gereklidir. - perf3.1.3 den 3.1.5 için orm adımlar
- % 5 CO2 içeren bir 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör odasına slayt aktarın ve farklı zaman noktalarında inkübe edilir. 30, 60 ve 90 dakika sonrası enfeksiyondan sonra hücrelerin sabitleyin. C. albicans 60 dakika sonrası enfeksiyon hif oluşmaya başlar gözlemlemek; fagositler 90 dakika 8 sonra hücre ölümünü (pyroptosis) göstermeye başlar.
Not: Bu bir öneridir ve optimizasyon hücre tipine ve kullanılan parçacık bağlı esastır. - 3.1.7'de den 3.1.15 adımları uygulayın. ImageJ 16 kullanarak görüntüleri analiz edin.
Not: başarılı bir alım bir fagosit sitoplazması içinde bir parçacık tam içselleştirme ile karakterize edilir (Şekil 2). Böyle Phalloidin olarak hücre yüzey işaretleyici ile fagositler boyanan hücrelerin kontur çizmek için yardımcı olur. Parçacık, hücre yüzeyi ya YAPIM bağlı olup olmadığını belirlemek için, aynı zamanda sırayla Z yığınları yerine esastıretely içselleştirilmiş.
- Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Seçenek olarak ise, kapak slipleri üzerine plakası hücreleri ya da cam-tabanlı 96 oyuklu plakalar (24 ya da 12 oyuklu bir formatta). Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin.
- Fagositoz Canlı Görüntüleme
NOT: Bu protokolde floresan konjuge zymosan kullanarak fagositoz farklı aşamalarında yakalamak için konfokal mikroskopi kullanımını tanımlamak. Biz istikrarlı bir şekilde mCherry etiketli F-aktin 8 ifade dendritik hücre hattını DC2.4, canlı hücrelerde ipliksi aktin dağılımını gösteren bir biyosensör kullanın. Fagositoz bir aktin odaklı süreç olduğu için bu hücrede canlı görüntüleme F-aktin ağ hareketini ve dinamiklerini yakalamak için bize sağlar, fakat aynı zamanda canlı hücrelerin içinde farklı fagositik olayları (Şekil 3, Film 1) görselleştirmek için değil sadece.- Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir konsantrasyonda bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin.
NOT: Hücreler hemasitometre veya kullanılarak sayılabilirBenzer bir teknik. - 10 dakika buz üzerinde odasının slaytlar tutun.
Not: Soğutma istenmeyen alımını engellemek için, bir senkronize fagositoz olması için gereklidir. - 3.1.3 den 3.1.5 için adımları uygulayın
- 37 ° C mikroskop aşamasında önceden ısıtmak ve% 5 CO2 ile bölme dengeye. Görüntüleme başlamadan önce stabilize etmek için sıcaklık ve CO 2 için 30-45 dakika bekleyin.
NOT: CO 2 ve sıcaklık seviyeleri fagositoz için kritik olduğundan, çevre odasına dengelenmesi deney öncesinde mikroskop ısıtıcı açmak için çok önemlidir. - 37 ° C ve% 5 CO2 seviyesinde dengelenmiş mikroskop inkübatör muhafaza içinde hücreleri ihtiva eden odası slayt yerleştirin.
- Canlı görüntüleme 17, 18 gerçekleştirin.
NOT: Lazer gücü (kazanç, iğne deliği, vs.) ayarları th türüne bağlı olarak değişebilire mikroskop ve floresan prob kullanılır. Bu nedenle, biz canlı görüntüleme 17,18 optimal durum için mikroskop kılavuzuna danışmanızı öneririz.- odaklı lazer tarama mikroskobu (ve ilgili yazılım) canlı görüntüleme için kullanılır. 1-1,1 Havalı birimlerinin bir toplu iğne deliğine sahip 63X 1.4NA yağı amacı kullanın.
- görüntüleme başlatmak için, oda slaytta bir temsilci bölgesini bulmak için parlak bir alan kullanılır. Sonra, yazılım üzerinde pozisyonu seçeneğini tıklatarak alanı seçin. 488 ve 582 nm arasında dalga boylarını algılayacak şekilde, 582 nm dalga boyunda bir ışın ayırıcı ile 488 nm lazer için filtre seti kullanılan Takip 1 GFP tespit etmek.
- Takip 2 mCherry (RFP) için en uygun ayarlanmış bir filtre 578 nm ışın ayırıcı kullanarak ve nm 578 ila 600 dalga boylarını tespit seçin. 488 nm ve% 50 lazer güç ve 600-700 bir kazanç çıkışı ile 578 nm lazer kullanır. 90 dakika olmak üzere toplam görüntüleri her 30 sn edinin.
- Bunlar Deney zamanında% 60-70 konfluent böylece bir konsantrasyonda bir bölme slayt 5 x 10 4 hücrelerini tohumu. Gece boyunca,% 5 CO2 ile 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
fagositoz farklı aşamalarında izlemek için mikroskop tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. DC2.4 hücreleri tarafından çeşitli floresan parçacıkların fagositozu sırasında farklı olaylar gösterilir. Burada tarif edilen teknikler kullanılarak, fagositoz erken aşamalarında sfingolipidler rolünü araştırdık. Bu amaçla, Sptlc2, sphingolipid biyosentetik yolundaki birinci ve oran kısıtlayıcı aşamayı katalizleyen enzim genetik eksikliği DC2.4 dendritik hücreler kullanıldı. Vahşi tip hücrelere kıyasla, Sptlc2 olarak - / - DC2.4 hücreleri önemli ölçüde seramid, sfingomiyelin ve glucosylceramide 8 de dahil olmak üzere sfingolipidler seviyesini azaltmıştır. Sptlc2 - / - DC2.4 hücreleri, hem de C. albicans, zimosan ile IgG lateks boncuk, 8 alımında bağlama bozuk. Şekil 1 'de, DC2.4 hücrelerinde bağlayıcı floresan konjüge-zimosan parçacıkları gösterilir (bakınız sezaryenn detaylar için 3.1). Sptlc2 - / - DC2.4 hücreleri kontrol DC2.4 hücreleri (Şekil 1A, p = 0.0008) daha zimosan bağlanmasını önemli ölçüde daha az görülmüştür. - / - Hücre başına bağlanan zimosan parçacıkların sayısı Sptlc2 için daha kontrol hücreleri için önemli ölçüde daha yüksek olduğu DC2.4 hücreleri (p <0.0001; Şekil 1C). - / - DC2.4 hücreleri C. albicans fagosite için önümüzdeki Sptlc2 yeteneği araştırılmıştır. Sptlc2 - / - DC2.4 hücrelerinin kontrol hücrelerinden (Şekil 2A, 2B) ile karşılaştırıldığında, C. albicans'ın önemli ölçüde daha az fagositoz (p <0.0005) göstermiştir. Beklendiği gibi, Sptlc2 eksikliği hücreleri önemli ölçüde daha yüksek fagositik olmayan hücrelerin sayısı (p <0.05; Şekil 1C) gösterdi ve hücre başına C. albicans (Şekil 1C, D) sayısı azalmıştır. Bu sonuçlar, t, hem de bağlama dokunulmamış sphingolipid biyosentetik yolun bir rol çizgiO partiküllerin alıma izin verir. Şekil 3 fagositoz erken aşamalarında (Ayrıntılı prosedür için Bölüm 3.3) gösteren time-lapse görüntüleri gösterir. Film 1 stabil F-aktin, hücreler (Daha fazla bilgi için bakınız Bölüm 3.1) canlı ipliksi aktin dağılımını gösteren bir biyosensör ifade DC2.4 hücrelerinin canlı görüntüleme gösterir.
Şekil 1: DC2.4 hücrelerinde zimosan bağlama deneyinde. (A) Kontrol Sptlc2 - / - DC2.4 hücreler, flüoresan konjuge zimosan ile inkübe ve konfokal mikroskop ile incelendi parçacıkları bağlanma yeteneğini edildi. Oklar bağlanma siteleri belirtir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bağlanmış zimosan parçacıklar (B) ve zymosan parçacıkların sayısının sayısı (B, C) Niceleme c başına bağlananell (C) gösterilir. Bound parçacıklar sayısal ve kontrol göre yüzde olarak sunuldu. Tüm grafikler üç bağımsız deneyin SD gösterir ve en az 200 hücre her bir deney için sayıldı. Eşleştirilmemiş t-testi gözlenen farklılıkların önemini analiz etmek için kullanıldı. ** P <0.001. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Tafesse ark izni ile yeniden yazdırın. 2015 8. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: C Fagositoz. DC2.4 hücrelerinde albicans. Aşama 3.2'de tarif edildiği gibi (A) Hücreleri Cı andida -BFP ile enfekte edilmiştir. 90 dakika enfeksiyondan sonra hücreler sabitlendi ve floresan konjüge Isırmaları ile boyanmışve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülü. (B - B) içsel Candida -BFP, fagositik olmayan hücrelerin sayısı ve hücre başına Candida -BFP sayısının nicelleştirilmesi gösterilmiştir. Tüm grafikler üç bağımsız deneyin SD gösterir ve en az 200 hücre her bir deney için sayıldı. Eşleştirilmemiş t-testi gözlenen farklılıkların önemini analiz etmek için kullanıldı. ** P <0.001. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Tafesse ark izni ile yeniden yazdırın. 2015 8. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: C. albicans Time-lapse görüntüleme fagositoz erken aşamalarında görselleştirmek için alıma izin verir. stabil F-aktin ifade vahşi tip DC2.4 hücreleri -mCherry (F-aktin) ve Candida -BFP ile inkübe edildi (kırmızı ile gösterilmiştir) ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi. 30 saniye aralıklarla çekilen görüntüler gösterilir. Yıldız fagositoz sırasında aktin yeniden farklı aşamalarını göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Tafesse ark izni ile yeniden yazdırın. 2015 8. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1: Canlı görüntüleme. Kararlı biçimde (yeşil renkte) F-aktin mCherry ifade Yabani tip DC2.4 hücreler (kırmızı ile gösterilen) ve Candida -BFP ile enfekte edilmiştir. Adım 3.3 anlatıldığı gibi canlı görüntüleme konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirildi. Tafesse ark izni ile yeniden yazdırın. 2015 8.s / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi "target =" _ blank "> Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (indirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
makrofajlar ve dendritik hücreler gibi profesyonel fagositler, yutmak ve bu nedenle işgalci patojenlere konak savunma sisteminin önemli bir bileşeni fagositozunu yapma ortadan kaldırır. Bu işlem sırasında fagositler, hücre yüzeyi 8, 19, 20, geniş bir membran yeniden düzenlenmesi ve hücre iskeleti bir yeniden düzenlenmeye maruz. daha bu dinamik süreci anlamak için, fagositoz farklı aşamalarında görselleştirme esastır. Burada fagositoz çeşitli adımlar izlemek için kullanılan bir mikroskop bazlı yöntem açıklamıştır.
Canlı görüntüleme tekniğinin ana önemi, moleküler düzeyde konak-patojen arayüzü izlemek için olağanüstü yeteneği sağlamasıdır. mikrobik enfeksiyon önemli adımlar görselleştirme izin vererek, canlı görüntüleme immün yanıtın temel doğası içine kritik fikir verirpatojenler 8, 10, 21, 22 karşı. Fagositoz ek olarak, burada tarif edilen teknikler makropinositoz 10 de dahil olmak üzere reseptör dolayımlı endositoz diğer türleri, çalışma uzatılabilir. Canlı görüntüleme ayrıca Leishmania ve Toxoplasma gondii dahil hücre içi Mycobacterium tuberculosis ve Salmonella typhi gibi bakterilerin yanı sıra, parazitlerin konak-patojen ilişkisini incelemek için değerli bir yaklaşımdır 22, 23.
Bu tür geleneksel biyokimyasal yaklaşımlar gibi diğer tekniklere göre canlı hücre görüntüleme birçok avantajı vardır. Canlı hücre görüntüleme bize hücresel süreçleri 8 mekansal ve zamansal dinamiklerini takip etmenizi sağlar. Ayrıca, canlı görüntüleme bize bildirmek kazanç sağlartek bir hücre çözünürlükte 21 de tirme. Fagositoz birkaç dakika 10 bir konuda reseptörleri, aktin ve membran lipid biçimlenme kümeleme içeren dinamik bir hücresel bir süreçtir. Canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, aksi takdirde zor bir zaman hassas bir şekilde, bu bilgileri yakalamak için bize sağlar.
Bu tekniğin en önemli kısıtlılığı, deneysel koşullar ve mikroskop kurulumları dikkatli optimizasyonu gerektirir. başarılı görüntüler elde etmek için çok önemli birkaç önemli faktör vardır. (F-aktin gibi) fagositler ve tanecikli etiketlemek için kullanılan boya doğası görselleştirmek için kullanılan floresan protein (ya da biyosensör) nitelikleri görüntüleme kritik yönleri vardır. canlı görüntüleme için, aynı derecede önemli mikroskop kurulum çevre odasının dengeleme olduğunu. enstrüman bağlı olarak, dengeleme birkaç saat 15 dakika arasında sürebilir. Since CO 2 besleme kültür ortamı içinde uygun bir pH'ı korumak için tasarlanmıştır, deney kurma için yeterli zamanı öncesinde izin vermek için gerekli olduğunu. Durumlarda CO 2 besleme yetersiz ve / veya düzensiz olduğunda, zitteriyonik organik kimyasal tamponlama ajanı HEPES büyüme ortamına ilave edilebilir gibi. Floresan parçacık ve canlı hücrelerin uzun süreli maruz kalma lazerler fototoksisite ve ağartma yol açabilir Eşodaklı için. lazer gücü (daha az maruz kalma süresi) en iyi duruma getirme ve kepenkleri bu sorunları azaltabilir görüntü satın almalar arasında kapalı emin. Genel olarak, burada açıklanan teknikler fagositoz sırasında patojenler ve fagositler arasındaki dinamik ilişkiyi incelemek için idealdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz görüntüleme için MİT Whitehead Enstitüsü Wendy Somon ve Keck tesisin Nicki Watson teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
- Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
- Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
- Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis. BBA. 1851, 805-823 (2015).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
- Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
- Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
- Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
- Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
- Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
- John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).
