Burada, Candida albicans mantarları ve zimozan ve IgG kaplı boncuklar dahil olmak üzere 0,5 μm'den büyük partiküller gibi patojenlerin fagositozu sırasındaki olayların erken kaskadlarını görselleştirmek ve ölçmek için mikroskop tabanlı bir tekniği açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
memeli vücut patojen istilası kendisini savunmak için yardımcı mekanizmaların çeşitli katmanları ile donatılmıştır. Nötrofiller, dendritik hücreler ve makrofajlar gibi - - bağışıklık sisteminin -profesyonel fagositlerin algılar ve fagositoz 1 boyunca bu işgalci patojenlere temizlemek için doğal yeteneğini muhafaza. Fagositoz hücre yüzeyinde 2, 3 membran yeniden ve aktin biçimlenme koreografi olayları kapsar. Fagositler başarıyla içselleştirmesi ve fagositoz tüm aşamaları yerine sadece yabancı molekülleri ortadan kaldırmak. Bu adımlar tanıma ve hücre yüzeyinde bulunan örüntü tanıma reseptörleri tarafından patojen (PRR) bağlanmasını içerir, aktin-zenginleştirilmiş membranöz çıkıntıları (psödopod) aracılığıyla fagositik fincan oluşumu partikül çevreleyen ve fagozomun kesme phagolysosome olgunlaşması ile izledi sonuçlanırpatojen 3, 4 öldürülmesi.
fagositoz çeşitli aşamalarında Görüntüleme ve miktar bu hücresel sürecin moleküler mekanizmaların için enstrümantal. Mevcut el yazması fagositoz farklı aşamalarını incelemek için yöntemler bildirir. Biz görselleştirmek ve bağlayıcı, fagositik fincan oluşumunu ölçmek için bir mikroskop temelli bir yaklaşım ve fagositlerce partikül içselleştirilmesi açıklar. Fagositik hücreler üzerinde doğuştan reseptörleri den büyük 0,5 mikron, burada mevcut tahliller patojenik mantar Candida albicans ve zimosan ve IgG kaplı boncuklar gibi diğer parçacıkların kullanımını içermektedir hedef parçacığa ligandlar karşılaştıklarında fagositoz oluşur olarak.
Giriş
Bakteriler, virüsler ve mantarlar gibi patojenlere sürekli maruz kalma rağmen, vücudumuzun iyi enfeksiyona karşı koruma sağlayan bağışıklık mekanizması ile donatılmıştır. doğuştan gelen bağışıklık sistemi işgalci patojenlere karşı ilk savunma hattıdır ve tanımak ve yabancı hedeflere içselleştirmek fagositik hücreler esas dayanır.
Fagositoz 0.5 um'den daha büyük, istenmeyen parçacıkların yutulmasına kapsar evrimsel olarak muhafaza edilmiş hücresel bir süreçtir. Fagositik hücreler yutulma 3 önce patojenler üzerinde mevcut olan patojenle ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) tanımasını sağlamak hücre yüzeyinde (ayn....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
DC2.4 ve RAW 264.7 Hücre Hatları 1. Hazırlık
Not: makrofaj benzeri hücre hattı RAW 264.7 ve dendritik hücre çizgisi DC2.4 hem sıçangil kökenli ve aşağıdaki koşullar hücreleri büyütmek için kullanıldı.
- Ile takviye edilmiş DMEM içinde RAW 264.7 hücreleri (Dulbecco minimal Eagle ortamı) büyütün% 10,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de etkisiz hale getirilmiş fetal sığır serumu (FBS).
- L-Glutamin yerine DMEM ile takviye edilmiş RPMI kullanımı (Roswell Park Memorial Institute) ortamı dışında RAW 264.7 hücreleri bu benzer koşullar altında DC2.4 hücreleri büyütün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
fagositoz farklı aşamalarında izlemek için mikroskop tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. DC2.4 hücreleri tarafından çeşitli floresan parçacıkların fagositozu sırasında farklı olaylar gösterilir. Burada tarif edilen teknikler kullanılarak, fagositoz erken aşamalarında sfingolipidler rolünü araştırdık. Bu amaçla, Sptlc2, sphingolipid biyosentetik yolundaki birinci ve oran kısıtlayıcı aşamayı katalizleyen enzim genetik eksikliği DC2.4 dendritik hücreler kullanıldı. Vahşi tip hücrelere kıyasla, Sptlc2 olarak - / - .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
makrofajlar ve dendritik hücreler gibi profesyonel fagositler, yutmak ve bu nedenle işgalci patojenlere konak savunma sisteminin önemli bir bileşeni fagositozunu yapma ortadan kaldırır. Bu işlem sırasında fagositler, hücre yüzeyi 8, 19, 20, geniş bir membran yeniden düzenlenmesi ve hücre iskeleti bir yeniden düzenlenmeye maruz. daha bu dinamik süreci anlamak için, fagositoz farklı aşamalarında görselleştirme esastır. Burada fag.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Biz görüntüleme için MİT Whitehead Enstitüsü Wendy Somon ve Keck tesisin Nicki Watson teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| β-Merkaptoetanol | AppliChem | A1108 | |
| Sığır serum albümini (BSA) | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 9998 | |
| DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-fenilindol, Dilaktat) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco' s Minimal Kartal' s orta) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Fosfat-Tamponlu Salin) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Sığır serumu | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC'ye bağlı IgG kaplı lateks boncuklar | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamin 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehit Çözeltisi (PBS'de %4)) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penisilin-streptomisin (10.000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 hücre | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Enstitüsü) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Tripan mavisi çözeltisi (PBS'de %0,4 (a/h)) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Tripsin-EDTA (1x) (%0,05) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Yüzey Aktif-Amps Deterjan Çözeltisi | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Odacıklı 1.0 Borosilikat Kapakcam sistemi (8 odacıklı) | ThermoFisher | 155361 | |
| Izgaralı cam slayt 10 | Hycor | 87144 |
Kaynaklar
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
