Wir präsentieren Protokolle für die Entnahme, Aufbereitung und Bildgebung von reifen Drosophila-Eizellen. Diese Methoden ermöglichen die Visualisierung des Chromosomenverhaltens sowie des Spindelaufbaus und der Funktion während der Meiose.
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Methodenartikel
Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Chromosomensegregation in menschlichen Eizellen ist fehleranfällig und führt zu Aneuploidie, die die häufigste genetische Ursache für Fehlgeburten und Geburtsfehler ist. Die Untersuchung des Chromosomenverhaltens in Eizellen von Modellorganismen ist vielversprechend, um die molekularen Grundlagen der Anfälligkeit menschlicher Eizellen für Aneuploidie aufzudecken. Drosophila melanogaster ist mit über 100 Jahren Forschung, Gemeinschaft und Technikentwicklung anfällig für genetische Manipulationen. Die Visualisierung des Chromosomenverhaltens und der Spindelassemblierung in Drosophila-Eizellen stellt jedoch besondere Herausforderungen dar, da die Eizelle von Membranen umgeben ist, die für Antikörper undurchdringlich sind. Wir beschreiben hier Protokolle für die Sammlung, Aufbereitung und Bildgebung der Meiose-I-Spindelassemblierung und des Chromosomenverhaltens in Drosophila-Oozyten, die die molekulare Dissektion der Chromosomensegregation in diesem wichtigen Modellorganismus ermöglichen.
Einleitung
Das Studium der Meiose wird manchmal als die "Genetik der Genetik" bezeichnet. Dies liegt daran, dass die grundlegenden Eigenschaften der Chromosomenvererbung und des unabhängigen Sortiments durch die Segregation der Chromosomen während der Gametenproduktion erreicht werden. Ein wichtiger Beweis für die Chromosomentheorie der Vererbung kam 1916 durch die Arbeit von Calvin Bridges an Drosophila melanogaster1. Diese und andere klassische genetische Studien an Drosophila trugen wesentlich zu unserem Verständnis der Genetik bei. Die zytologische Untersuchung der meiotischen Chromosomen in Drosophila-Eizellen war jedoch eine Herausford....
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Protokoll
Anmerkung: Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die temperaturgeregelte Inkubatoren verwendet werden Temperaturen für das Fliegenzucht zu halten und Kreuze, sofern nicht anders vermerkt.
1. Vorbereitungen
- Bereiten Sie Flies.
- Oozyten Sammlungen Prometaphase angereicherte.
- Klar erwachsenen Fliegen von gesunden, jungen Aktien oder Quer Kulturen. Alter Flaschen für zwei Tage bei 25 ° C.
HINWEIS: In der Regel zwei gesunde Flaschen genügt, wenn auch für einige Quer Kulturen benötigt werden. - Nach zwei Tagen sammeln ~ 100 bis 300 Frauen (die zu diesem Zeitpunkt 0 bis 2 Tage alt sind) a....
- Klar erwachsenen Fliegen von gesunden, jungen Aktien oder Quer Kulturen. Alter Flaschen für zwei Tage bei 25 ° C.
- Oozyten Sammlungen Prometaphase angereicherte.
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Ergebnisse
Die Methoden , die wir hier beschrieben haben , in der Sammlung von Spätstadium der Drosophila - Oozyten , die drei Stadien der Meiose (Abbildung 1) wird zur Folge haben . Oozyten in Prophase werden durch das Vorhandensein der Kernhülle aus, die durch das Fehlen von Tubulin - Signal in der Region um die karyosome (1A) sichtbar ist. Prometaphase ist die Zeit, nach der Kernhülle Zusammenbruch während der die Spindel montiert. Während Prometaphase .......
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Diskussion
Staging Drosophila Oozyten
Obwohl ein längliches karyosome oft in der Prometaphase Oocyten gesehen wird, karyosome Form unter Verwendung von Metaphase Prometaphase Oozyten unterscheiden kann problematisch sein. Während Prometaphase beginnt die karyosome als eine runde Form, längt, und zieht dann in eine runde Form wie die Eizelle die Verhaftung Metaphase nähert. Dies bedeutet, dass viele der Prometaphase Oozyten keine längliche karyosome haben. Darüber hinaus, wenn .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Christian Lehner für die Bereitstellung des CENP-C-Antikörpers und Eric Joyce für Empfehlungen zu FISH. Die Arbeit im McKim-Labor wurde durch einen Zuschuss des NIH (GM101955) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15 ml konische Röhrchen | Verschiedene | ||
| 16% Formaldehyd | Ted Pella, Inc. | 18505 | GEFÄHRLICH; nach dem Öffnen nach einem Monat entsorgen |
| 250 ml Becher | Verschiedene | ||
| 5 ml Röhrchen | Verschiedene | ||
| aktive Trockenhefe | Verschiedene | mit Wasser mischen, um eine Paste herzustellen die Konsistenz von Erdnussbutter | |
| Anti-Α-Tubulin Antikörper konjugiert an FITC | Sigma | F2168 | Klon DM1A |
| Binuclein 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| Mixer | Verschiedenes | ||
| Rinderserumalbumin | Sigma | A4161 | |
| Calciumchlorid Verschiedenes | |||
| Colchicin | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| Deckgläser | VWR | 48366-227 | Nr. 1 1/2 |
| Dextransulfat Verschiedenes | |||
| DMSO | Verschiedenes | ||
| EGTA | Verschiedenes | ||
| Ethanol | Verschiedenes | ||
| Pinzetten | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont Pinzette High Precision Grade Style 5 |
| Formamid | Sigma | 47670-250ML-F | |
| Objektträger | VWR | 48312-003 | |
| Glukose | Diverse | ||
| graduierte 1,5 ml Röhrchen | Diverse | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | bei verschiedenen Anbietern erhältlich |
| Hoechst 33342 | Verschiedenes | ||
| Magnesiumchlorid | Verschiedenes | ||
| Methanol | Verschiedenes | ||
| großmaschiges (~1.500 &Mikro; m) | VWR | AA43657-NK | Vielzahl von Formaten und anderen Lieferanten, 12 oder 14 Mesh |
| kleine Maschen (~300 µ m) | Spektrumlabore | 146 424 | verschiedene Formate, z.B. , 146 422 oder 146 486 |
| Nutator | Diverse | ||
| Pasteurpipetten | Diverse | ||
| Cacodylsäure | Sigma | C0125 | GEFÄHRLICH; alternativ kann Natriumcacodylat Kalium substituiert werden |
| Hydroxid | Verschiedenes | ||
| Natriumacetat | Verschiedenes | ||
| Natriumchlorid | Verschiedenes | ||
| Natriumcitrat | Verschiedenes | ||
| Natriumhydroxid | Verschiedenes | ||
| Saccharose | Verschiedenes | ||
| Taxol (Paclitaxel) | Sigma | T1912 | GEFÄHRLICH |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Sonstiges |
Referenzen
- Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Theurkauf, W. E., Ha....
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Nachdrucke und Genehmigungen
