Abstract
Genuttrykket plattform analysen åpner for robust og svært reproduserbare kvantifisering av uttrykk for opptil 800 transkripsjoner (mRNA eller mirnas) i en enkelt reaksjon. Den miRNA analysen teller transkripsjoner av direkte bildebehandling og digitalt telle miRNA molekyler som er merket med fargekodede fluorescerende strekkode probe sett (en reporter probe og en fange probe). Strekkoder blir hybridisert direkte til modne mirnas som har blitt forlenget med ligering av en unik kode oligonukleotid (miRtag) til 3'-enden. Revers transkripsjon og amplifikasjon av transkriptene er ikke nødvendig. Rapportør prober inneholder en sekvens av seks farge stillinger befolket ved hjelp av en kombinasjon av fire fluorescerende farger. De fire farger enn seks stillinger blir brukt til å konstruere et gen-spesifikk farge strekkode sekvens. Post-hybridisering prosessering er automatisert på en robot prep stasjon. Etter hybridisering, overflødig sondene er vasket bort, og tredelt strukturer (capture provære-miRNA-reporter probe) er festet til en streptavidin-belagt lysbilde via biotin-merket fangst probe. Bildebehandling og strekkode telling gjøres ved hjelp av en digital analysator. De immobiliserte strekkode mirnas er visualisert og avbildes ved hjelp av et mikroskop og kamera, og de unike strekkoder dekodes og telles. Data kvalitetskontroll (QC), normalisering og analyse er tilrettelagt av en spesialdesignede dataprosessering og analyse programvare som følger med analysen programvare. Analysen demonstrerer høy linearitet over et bredt område av ekspresjon, så vel som høy følsomhet. Prøve og analyse forberedelse ikke involverer enzymatiske reaksjoner, revers transkripsjon, eller forsterkning; har noen få skritt; og er i stor grad automatisert, noe som reduserer etterforsker effekter og resulterer i høy konsistens og teknisk reproduserbarhet. Her beskriver vi anvendelsen av denne teknologien for å identifisere sirkulerende miRNA forstyrrelser i irritabel tarm syndrom.
Introduction
Irritabel tarm syndrom (IBS) er den vanligste poliklinisk diagnose i gastroenterologi, som rammer 10-15% av befolkningen og som representerer en betydelig belastning for helsetjenesten. For tiden er det ingen allment aksepterte diagnostiske biomarkører for IBS (dvs. er diagnosen basert på kliniske symptomer og utelukker andre organiske lidelser, for eksempel GI malignitet, inflammatoriske tarmsykdommer, og gastrointestinal (GI) infeksjoner). Når man studerer genuttrykk profiler i vanlige tilstander med subklinisk histopatologi, som IBS, høy følsomhet og nøyaktighet (reproduserbarhet) er nødvendig, som forstyrrelser i genuttrykk profiler er ofte subtil 1-3. mirnas har blitt identifisert som både diagnostiske og funksjonelle mål i IBS 4,5, og vi er spesielt interessert i å vurdere sin bruk som sirkulerende biomarkører av IBS-assosiert biologiske perturbasjon 3,4,6,7. Den kliniske utnyttelse av opplagskaps biomarkører er aktuelt på grunn av enkel og minimal invasiv natur samling av de biomarkører 'kilde (f.eks perifert blod) fra pasienter.
Genekspresjon plattform analyser, på grunn av deres unike kjemi og strømlinjeformet, for det meste automatisk arbeidsflyt, tilveiebringe en microarray plattform som gir bred og tilpasses dekning (800 mål i et enkelt reaksjons) av transkriptomet for målrettet oppdagelse. De gir også høy presisjon og linearitet over et bredt spektrum av ekspresjonsnivåer i kvantifisering av transcriptomic mål. Analysen ikke krever revers transkripsjon av RNA, forsterkningen av resulterende cDNA, eller andre enzymatiske reaksjoner. Således er potensielle feil introdusert av de høye syklus antallet amplifikasjon fra RNA-arter med lav overflod eller sjeldne spleisevarianter redusert ved fremgangsmåten i digital telling. Dette betyr at en lang rekke prøvetyper, slik som renset totalRNA (dvs. mRNA + miRNA), RNA fra formalin-fikserte parafininnstøpte (FFPE-prøver), så vel som et ubehandlet vev og cellelysatene, kan brukes med analysene.
RNA av interesse blir detektert ved hjelp av et par av prober (fangst og rapportør prober), hver inneholdende en mål-spesifikk sekvens som gjenkjenner et tilsvarende område i target RNA. For å sikre deteksjon av korte RNA (dvs., mirnas), blir den modne sekvens miRNA langstrakte å varmebehandle en unik kode oligonukleotid (miRtag) til 3'-enden av molekylet. En brodannende oligonukleotid, som er komplementære til en del av både den modne mål miRNA og miRNA-spesifikke miRtag, blir brukt for å sikre sekvens spesifisitet. Fangst og reporter prober ligere til 3'- og 5'-endene av de modne miRNA-miRtag kompleks, respektivt. Fangst sonder har en biotin etikett på 3 'enden, som tillater dem å feste seg til overflaten av et streptavidin-belagt glass slide, fixing fangst probe-miRNA-miRtag-reporter probe komplekse til raset. En elektrisk strøm blir så brukt til å orientere kompleks på glideflate, slik at fluorescerende strekkoder som bæres av reporter-proben på 5'-enden for å bli visualisert ved hjelp av et mikroskop og CCD (CCD) kamera. Strekkoder telles og dekodet, noe som gir et tall for spesifikke målet miRNAs. Det fluorescerende strekkode består av seks posisjoner som kan være okkupert av en av fire fluorescerende farger, som kan brukes til å konstruere over 4000 farge-strekkode kombinasjoner, som hver koder for en spesifikk RNA.
Prøvepreparering (dvs. RNA-rensing eller celle / vev-lysat fremstilling), samt hybridisering av fangst og reporter prober, er gjort på benken. Tolv prøver kan multiplekset på et enkelt lysbilde. Etter over natten hybridisering, er all videre prøven forberedelse utført av en robot prep stasjon. De lastet lysbildene blir deretter overført til annonsenigital analysator for bildebehandling, telling, dekoding, og databehandling. De resulterende dataene blir importert til den medfølgende programvare, hvor de blir ytterligere behandlet med en høy grad av brukerkontroll. Den unike kjemi, enkel forberedelse, automatisert natur, enkel datatype (teller), og samlet strømlinjeformet arbeidsflyt av analysen lette høy presisjon genekspresjon kvantifisering, noe som gjør det til et nyttig verktøy i å studere sirkulerende miRNA uttrykk profiler og signaturer i funksjonelle forhold som IBS.
Protocol
Forskningen er beskrevet her ble godkjent av Institutional Review Board of National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).
1. Innsamling av fullblodsprøver
- Samle fullblodsprøver (2,5 ml) fra deltagerne via venepunksjon i blodglass med RNA stabiliserende løsning (slik at for langtidslagring), og lagre dem ved -80 ° C til RNA rensing.
2. Total RNA Purification
- Tine og inkuber blod rør for 2 timer, og deretter sentrifuger dem ved hjelp av en swing-out rotor i 10 min ved 5000 x g. Fjern supernatanten ved forsiktig å helle eller pipettere den av i en avfalls tube, være forsiktig for ikke å forstyrre pelleten.
- Vask pellet ved å tilsette 4 ml RNase-fritt vann, sett korken ordentlig, og virvle til pelleten er synlig oppløst. Sentrifuger ved hjelp av en swing-bøtte rotor ved 5000 xg i 10 min og rebevege den overliggende væske, slik det er beskrevet i trinn 2,1.
- Legg 350 mL av BM1 buffer (følger med) til pelleten. Vortex pelleten til den er synlig oppløst og overføre den til en 2-ml behandlingen rør for automatisert total RNA ekstraksjon.
- Utfør automatisert rensing av intracellulær RNA, inkludert miRNA, fra fullblod med en kommersielt tilgjengelig RNA ekstraksjon kit, som kan automatiseres på en robot RNA ekstraksjon system.
MERK: automatisert robotsystem brukte vi kan behandle tolv prøver om gangen, og det tar 3 timer for RNA-renseprotokoll for å fullføre.- Last inn forhåndslastede pipettespisser, sentrifugerør, buffere, og reagenser som finnes i RNA rensing kit til robot RNA ekstraksjon system.
- Velg "Blood miRNA del A" protokoll fra protokollen valgmenyen og starte kjøringen.
MERK: Se Utfyllende materialer for en beskrivelse av automatiserte prosedyrer. - Når roboten har completed del A automatisert miRNA rensing protokollen, tømme avfallsbeholderen og fjern brukt plast og reagensbeholderene fra robotsystem.
- Lukk dekslene på alle mikro-sentrifugerør som inneholdt eluert RNA og plassere dem i shaker adapter. Velg "Blood miRNA Del B" fra protokollen valgmenyen for å ruge prøvene ved 65 o C i 5 min.
- Når roboten er ferdig kjører Del B av miRNA rensing protokollen, umiddelbart fjerne prøvene og chill dem på is.
- Kvantifisere og vurdere renset RNA kvalitet ved hjelp av et spektrofotometer.
MERK: Per protokoll anbefalinger for miRNA analysen, en minimumskonsentrasjon på 33 ng / mL er nødvendig, og alle prøvene bør møte eller overgå en 280/260 ratio på 1,9 og et minimum 260/230 ratio på 1,8 for å sikre fravær av betydelig organisk forurensning, noe som kan påvirke analyseytelsen (se Referanse 17). - Oppbevar prøvene ved -80 o C.
3. miRNA Prøvepreparering
- Normal 12 RNA prøver til 33 ng / mL hjelp nukleasefritt vann.
- Forbered en 1: 500 fortynning av miRNA kontrollene i analysen kit bruker nukleasefritt vann. Hold på is.
- Klargjør annealing mester mix: kombinere 13 ul annealing buffer (følger med), 26 mL av miRtag reagens (følger med), og 6,5 mL av miRNA kontroller (utarbeidet i trinn 3.2) ved hjelp av 10- og 20-ul pipetter.
- Ved hjelp av en 10-mL pipette, tilsett 3,5 mL av gløde konsentrat-blanding og 3 pl av RNA-prøven (dvs. 100 ng) for hver av tolv 0,2 ml stripe rør. Flick å blande, spinne ned ved hjelp av en benkeplate Bøk mini mikro (2000 xg), og plasser i thermocycler (94 o C i 1 minutt, 65 o C i 2 minutter, og 45 o C i 10 minutter, hold på 48 o C) .
- Klargjør ligation mester blanding ved å kombinere 3 μl av ligeringsbuffer (forutsatt) og 19,5 ul av polyetylenglykol (PEG; tilgjengelig) ved anvendelse av en 20-ul pipette. Legg 2,5 ul av ligerings konsentrat-blanding til hver av strips fra trinn 3.4 ved anvendelse av en 10-mL pipette.
- Bland forsiktig, spinne ned med en benkeplate Bøk mini mikro (2000 xg), og gå tilbake til thermocycler ved 48 o C i 5 min. Etter 5 min ved anvendelse av en 10-mL pipette, tilsett 1 pl ligase direkte til hvert rør i thermocycler og inkubere dem ved 48 ° C i 3 minutter, 47 ° C i 3 minutter, 46 ° C i 3 minutter, 45 o C i 5 min, og 65 ° C 10 min; hold ved 4 o C.
- Fjern rørene fra thermocycler, bland dem forsiktig, spinne dem ned ved hjelp av en benkeplate Bøk mini mikro (2000 xg), og tilsett 1 mL av ligation opprydding enzym (følger med). Inkuber rørene i thermocycler (37 ° C i 1 time og 70 ° C i 10 min, hold ved 4 o
- Fjern rørene, og ved hjelp av en 100-mL pipette, tilsett 40 mL av nukleasefritt vann, bland, og spinne ned ved hjelp av en benkeplate Bøk mini mikro (2000 xg).
4. miRNA Hybridisering
- Tine reporter og fangst probe sett (følger med) på is og spinne dem ned ved hjelp av en benkeplate Bøk mini mikro (2000 xg).
- Ved hjelp av en 200-mL pipette, tilsett 130 mL av hybridisering buffer til reporteren kodesett tube (130 mL) for å skape hybridisering mester mix. Bland og spinne ned ved hjelp av en benkeplate Bøk mini mikro (2000 xg).
MERK: reporter og fanger sondene er spesifikke og standard for hver miRNA inngår i panelet. Tilpassede paneler og bruker designet fangst og sondesett kan utformes. - I 12 nye 0,2 ml stripe rør, tilsett 20 mL av hybridisering mester miks ved hjelp av en 20-mL pipette.
- Denaturere miRNA prøvene fra trinn 3,7 ved 85 o C for 5 min og avkjøl dem på is. Tilsett 5 ul til hver av rørene fra trinn 4.3 ved anvendelse av en 10-mL pipette.
- Program thermocycler til 65 o C i en 30-fil volum beregnet temperatur og varmelokket på evig tidsinnstilling (ikke programmere den til å trappe ned til 4 o C på slutten av kjøringen).
- Ved hjelp av en 10-mL pipette, tilsett 5 mL av fangst sonde satt til hvert rør, bland, spinne ned med en benkeplate Bøk mini mikro (2000 xg), og umiddelbart plassere i thermocycler ved 65 o C. Inkuber i ikke mindre enn 12 timer og ikke mer enn 30 timer.
5. Prep Station og Digital Analyzer
- Last prep stasjon.
- Åpne døren stasjon og laste reagensstasjonene plater (følger med), kassett (følger med), pipetter (følger med), preparerte prøver i tolv 0,2 ml stripe rør, og tolv tomme 0,2 ml strips (følger med). Fjern stripe tube caps og reagent plate dekselet. Lukk prep-stasjondøren og kjøre den aktuelle analysen fra kontrollpanelet.
MERK: Post-hybridisering behandlingen er den samme, uavhengig av analysen blir kjørt. Alle reagenser og plast varer er ferdigpakket og krever ingen forberedelse, annet enn å bringe dem til romtemperatur og spinne ned de reagens-inneholdende 96-brønners plater ved 2 000 xg i 2 min. Alle komponenter er lastet i klart definerte stillinger i prep stasjon. Se Utfyllende materialer for en beskrivelse av automatiserte prosedyrer.
- Åpne døren stasjon og laste reagensstasjonene plater (følger med), kassett (følger med), pipetter (følger med), preparerte prøver i tolv 0,2 ml stripe rør, og tolv tomme 0,2 ml strips (følger med). Fjern stripe tube caps og reagent plate dekselet. Lukk prep-stasjondøren og kjøre den aktuelle analysen fra kontrollpanelet.
- Visualiser og telle strekkoder av de immobiliserte og orienterte tredelt komplekser.
- Ta ut patronen fra prep stasjon, forsegle den med dekkglass gitt, og legg den i den digitale analysatoren i sporet over kameraoptikk.
- Velg riktig analyse (miRNA panel analyse) og analyse versjon angitt på testsettet og kjør programmet.
MERK: Den digitale analysator deretter tar synsfelt bilder for hver prøve posisjon ent fire eksitasjonsbølgelengdene, slik at de fluoriserende koder som kan leses og dekodes. Spesifikke strekkoder, svarende til en spesifikk miRNA, telles. - Eksportere datafiler på en USB eller direkte til serveren via en internettadresse.
6. Data Processing og analyse
- Klikk på "Raw data" -fanen og velg "Import RCC filer". Velg mappen som inneholder RCC-filer (rådatafiler) fra USB.
- Klikk "Next", velg alle QC boksene, og klikk "Importer".
- Klikk på "Ny studie" -kategorien. Navngi og beskrive studiet og lagre.
- I den nye studien, velg "New Experiment" -fanen og navn og beskrive den nye eksperiment. Klikk "Next" og velg RLF mappe fra venstre rute som inneholder de aktuelle rådatafiler som er lastet opp. Når den er valgt, klikk på "Keep Selected", og klikk "Next" da.
- Legg tilmerknader om ønskelig og klikk "Next".
- Velg bakgrunnen subtraksjon metoden; enten negativ kontroll, blank kjørefelt subtraksjon, eller en brukerdefinert subtraksjon kan velges. Når du har valgt, klikk på "Next".
MERK: Bestem den mest hensiktsmessige bakgrunnskorreksjon tilnærming basert på de tekniske parametere og biologisk sammenheng med studien.
MERK: Teller er mindre presise for lav overflod mål. Ved anvendelsen av studien vi beskriver her, ble dataene først behandlet uten bakgrunnskorreksjon for å undersøke QC parametre og å undersøke variasjon i tellinger for miRNA forskjellige abundances over tekniske replikater. Dataene ble deretter behandles på nytt ved anvendelse av en 25-teller bakgrunn terskel. - Velg "Top 100" normalisering, og klikk "Next" da.
- For å oppnå forholdsdata, velger ratio parametere, og klikk "Next" da.
- Klikk på "Ferdig".
- Klikk på den navngitte experiment i ruten til venstre for å avsløre en rullegardinmeny som inneholder "Raw", "Normalisert", "Gruppert", "Ratio data", og "Analyse data".
- Klikk på "Raw data" og observere en QC rapport i ruten til høyre. Observer et flagg ved siden av prøvene som ikke passerer standard QC parametere. Bygge en ny "Study" som ikke inkluderer de flagget prøver og behandle som beskrevet, eller bare utelukke flaggede QC prøver fra dataanalysen trinnet ved å velge "Ekskluder prøver av QC / normalisering flagg".
- Export "Rå", "normalisert", eller "grupperte" datafiler i CVS eller annen kompatibel filformat for analyse i en annen statistisk eller microarray programvare.
- Velg "Normalisert data" fra den venstre ruten, og velg prøvene som skal tas med i analysen i ruten til høyre.
- Klikk på "Analyse" og velg ønsket analyse type (f.eks, "Heat Kart & #34 ;, "Violin Plot", "Box Plot", "Scatter Plot", eller "Histogram Plot»). Velg ønskede eksklusjonskriteriene bokser (f.eks utelukke uteliggeren prøver eller gener, utelukker prøvene ved QC flagg, utelukker kontrollgener, og / eller ekskludere normaliserings sonder fra dataanalyse).
- Velg individuelle prøver å bli ekskludert fra analysen som ønsket.
- Velg individuelle gener for å bli ekskludert fra eller inkludert i analysen som ønsket.
- Velg parametrene for den valgte statistiske eller datavisualisering manipulasjon og klikk på "Finish".
Representative Results
Transcriptomic forstyrrelse i funksjonelle lidelser kan være subtile, og for å pålitelig oppdage de subtile endringer i uttrykk, kvantifisering av genuttrykk må være presis. Genuttrykket plattformen analysesystem reduserer teknisk støy gjennom sin svært automatisert natur, og den unike kjemien den bruker produserer høy presisjon genuttrykk data. Teknisk replikerer vist i figur 1 demonstrere høy reproduserbarhet både endogene (blå prikker) og viral miRNA (oransje prikker, housekeeping gener er representert med gule prikker) uttrykk kvantifisering som er mulig ved hjelp av denne metoden. Ved hjelp av denne metoden, viral (figur 2a) og endogene (figur 2b) mirnas som viser avvik fra forventet uttrykk, som definert av friske deltagerne, kan identifiseres som mål av interesse i IBS. Det bør bemerkes at det er uklart om virale mirnasoppdaget her stammer fra virusgener integrert i det menneskelige genom eller fra virusmengde. Som analysen bare teller modne mirnas med single-nucleotide spesifisitet, er usannsynlig kryss hybridisering med lignende endogene menneskelige miRNAs. Likevel, differensial steady-state nivåer av disse molekylene er av interesse som biomarkører. Presisjonen av metoden gjør det mulig for forstyrrelser blant lave uttrykk mål å bli oppdaget, så nøyaktig påvisning av disse transkripsjoner ikke er overbelastet ut av mer rikelig transkripsjoner. Subtile perturbasjoner kan også bli pålitelig observeres. Figurene 3 og 4 viser noen av disse forstyrrelser i sirkulasjons mirnas i IBS og IBS-undertyper sammenlignet med friske kontroller, og figurene 5 og 6 (begge tilpasset fra 3) viser de to mest signifikante differensielt forhøyede mirnas (Figur 5: miRNA 342-3p, Figur 6: miRNA 150). i IBS deltakerne Figur 6 er et eksempel på den grafiske visningen av resultatene som genereres av den tilhørende programvare.
Fig. 1: Normaliserte Tellinger fra to Tekniske Replikater Technical replikater kjøres på to separate kassetter viser høy lineær korrelasjon (r2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) over området av den normaliserte (normalisert til toppen 100 uttrykt mirnas) miRNA teller (log2 teller på x- og y-aksen). Den spredningsdiagram inneholder data for endogene menneskelige mirnas i blått (654 mirnas), endogene virale mirnas i oransje (80 mirnas), og housekeeping gener i gul (8 gener). Endogene virus mirnas var tilgjengelig på tidligere versjoner av analysen (versjon 1.4 ble brukt her), men er ikke lenger inkludert i standard analysen, selv om de er tilgjengelige som tilpassede tilsetninger./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Normalis grevene av Viral og endogent humant mirnas i IBS-forstoppelse (IBS- C) versus friske kontroller forstyrrelser i (a) viral (oransje) og (b) endogene humane mirnas (blå) er tydelig i dette eksempelet, der miRNA teller (log2 transform) av IBS-C deltakere (y-aksen) er tilbakegang mot miRNA teller (log2 transform) av friske kontroller (x-aksen). Flertallet av miRNAs uttrykke svært likt i begge populasjoner, men noen særlig avvike fra sammenhengen. Disse avvikene er tydelig blant både sjeldne og rikelig uttrykt mål. VennligstKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Mirnas er betydelig og jevnt forskjellig uttrykt i IBS lignet med friske kontroller forskjellig uttrykt mirnas i IBS er avdekket ved bruk av lineær diskriminant analyse effektstørrelse metode som kombinerer tester av statistisk signifikans med sjekker for konsistens i kategorier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4:. Mirnas er betydelig og jevnt forskjellig uttrykt i IBS Subtyper lignet med friske kontroller mirnas var differentially uttrykt i IBS-undergrupper (-D: diaré, -C: forstoppelse). sammenlignet med friske kontroller ved hjelp av lineær diskriminant analyse effektstørrelse metode som kombinerer tester av statistisk signifikans med sjekker for konsistens i kategoriene Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.
Figur 5:. Differential uttrykk for miRNA-342-3p Kronisk magesmerter av ukjent etiologi er en rektor symptom på IBS. Boksplottet viser at Mir-342-3p (norm teller på y-aksen), en miRNA forbundet med kronisk blære smerte av ukjent etiologi, ble funnet å være til stede i omløp ved høyere tellinger på tvers av alle IBS undergrupper sammenlignet med friske kontroller. Stolpene representerer ikke-avvikende utvalg, boksenes inter-kvartil range og den blå firkanten median teller. Modifisert fra tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Differential uttrykk for miRNA-150 En fiolin plott som viser at IBS deltakerne hadde signifikant høyere sirkulerende MIR-150 punkter sammenlignet med friske kontroller (log2 forvandlet teller på y-aksen).. Kurvene viser hyppigheten av antallet i den kategorien, de vertikale linjene representerer 1. og 3. kvartil, og den røde firkanten indikerer median teller. Modifisert fra tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
For miRNA analysen i særdeleshet, er det viktig å ikke bruke urensede lysater (disse kan brukes i mRNA og proteinanalyser), som reagensene ikke har blitt optimalisert for bruk med lysater, og prøvefremstillingsreaksjoner er sannsynlig å bli hemmet. I tillegg forurensninger overført fra lyse og RNA-rensetrinn (f.eks guanidinium-forbindelser, etanol, og fenoler) kan hemme ligerings og prøverensings reaksjoner. God kvalitet RNA er derfor kritisk for følsomheten og nøyaktigheten av miRNA analysen.
Ved hjelp av en termosykler med en oppvarmet lokk er kritisk for å sikre riktig temperaturkontroll for å optimalisere ytelsen av alle reaksjonstrinn. Under trinn 3.5.1, er det viktig ikke å fjerne strimlene fra thermocycler for å opprettholde temperaturen under tilsetningen av den ligase. Fjerne strips for å legge til ligasevil kompromittere reaksjonen. Ved utføring av hybridiserings-fremgangsmåten, er det viktig å unngå kraftig risting, pipettering, eller knipse ved å blande reagensene i rørene, da dette kan skjære rapportør prober. For å sikre optimal ytelse og konsistens, er det viktig å grundig blande reagenser i rørene ved forsiktig flicking. Alltid spinne ned reaksjoner etter blanding, og bruke en ny pipette tips hver gang en reagens utlevert for å sikre nøyaktig pipettering og for å unngå utilsiktet krysskontaminering.
Modifikasjoner og feilsøking
Kodesettene kan tilpasses til å omfatte kun mål av interesse. På denne måte kan kostnadene balansert for å tillate testing av store prøvesett når ytterligere å undersøke eller validere et bio-signatur. Custom prober kan være konstruert for gener eller målene ikke tilgjengelig fra a la carte meny. Følsomhet for mindre rikelig mål eller lav konsentrasjon RNA kan væremanipulert ved å tillate en lengre hybridisering tid og / eller ved anvendelse av høyere oppløsning digital telling.
I vår studie har vi brukt den forhåndsdefinerte 800 mål miRNA panel med total RNA fra fullblod; kan imidlertid analysene tilpasses til å omfatte færre mirnas om en mer målrettet tilnærming er nødvendig. Totalt 24 prøver kan være forberedt på en enkelt dag, forskjøvet i to sett av 12, fordi to patroner kan godt være gått gjennom post-hybridisering prosessering på robot prep stasjon og avbildes på digital analysator neste dag. Forskjøvet behandling av prøvene i grupper av 12 er viktig for å standardisere hybridisering tid. Kassetter som har blitt avbildet kan lagres og oppbevares ved 4 o C som skal skannes på nytt ved data analyser tyder på at en høyere oppløsning skanning kan forbedre deteksjonen av sjeldne miRNAs. Påvisning av sjeldne molekylene kan også bli forbedret ved hybridisering av prøver for lengre; men kan forlenges hybridisering Result i oversaturation og kan bare forbedre resultat hvis utgangs RNA-konsentrasjoner er lave (som i ekstracellulære vesikkel-avledet RNA). Plattformen følsomhet og presisjon tillate relativt lav overflod mirnas å bli pålitelig telles.
Begrensninger av teknikken
Den beskrevne genuttrykk analyseplattform plass til bare opp til 800 mål per array. Det er derfor ikke egnet for hele miRNA-transkriptom / hele transkriptom studier. Eneste kjente, beskrevet, og gitte mål kan påvises ved hjelp av plattformen, slik at det ikke er egnet til oppdagelsen av nye molekylarter. Andre metoder, som for eksempel RNASeq eller andre tradisjonelle microarray metoder, er mer egnet til hele transkriptom utforskende studier.
Betydningen av Technique For eksisterende / alternative metoder
IBS er preget av en kombinasjon av symptomer, prinsaklig inkludert magesmerter; visceral hypersensitivitet; og endringer i avføringsvaner, slik som hyppig diaré, forstoppelse, eller en kombinasjon av begge deler 9,10. IBS symptomer har ingen kjent organisk årsak, og pasienter ikke presentere med klinisk signifikant betennelse, histopatologiske forstyrrelser av gastrointestinale vev, eller systemiske markører 9-12. Forskning tyder på at biologisk feilregulering i IBS er subtile, subklinisk, og heterogen, med felles temaer dukker opp rundt betennelser og immunforsvar 10. Derfor trengte vi å kontrollere experimenter-introdusert variasjon og bruke en plattform som var i stand til på en pålitelig måte å oppdage subtile forstyrrelser i genuttrykk. De unike egenskapene til analysen og systemet standardisere utvalgets behandling og redusere eksperimentator håndtering gjennom automatisering, redusere teknisk varians for å produsere svært reproduserbare data. Disse funksjonene tillater fokuserte undersøkelser og produsere svært presis og replicable data. Dette gjør det mulig for påvisning av små forstyrrelser og forstyrrelser hos lav-uttrykk mål som kan overses eller overbelastet av signaler fra mer rikelig mål ved bruk av Intensitetsmodulert eller amplifikasjons-baserte metoder. PCR-baserte mikromatriser og RNAseq metoder er levedyktig alternativ til å bruke den beskrevne plattform og kan være attraktive som alternativ når høyere hastigheter er nødvendig, eller når målet er å karakterisere hele transkriptomet eller for å lete etter nye molekyler. Men alternativer kan ikke utføre så vel i nøyaktig og sensitiv påvisning og kvantifisering av sjeldne mål og subtile forstyrrelser.
Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Sirkulerende miRNA ekspresjon i IBS deltakerne en rekke perturbasjoner som ble funnet å være både større og konsekvent innenfor kategoriene. De identifiserte mirnas var assosiert med relevant pathways og patologiske tilstander, inkludert en funksjonell smerte tilstand (MIR-342-3p: kronisk blæresmerter) 8 og betennelse (MIR-150) 13. Eksempelet Studien var basert på en utforskende kohort brukes til å definere mål og systemer av interesse. En mer målrettet, mindre miRNA utvalg ble deretter konstruert, senke per prøve kostnader og åpner for mye større kohorter som skal analyseres i en kostnadseffektiv måte for å validere og raffinere signaturer og biomarkører. Genuttrykket plattformen analysesystem treffer en balanse mellom det tradisjonelle utforskende natur microarray og mer målrettet, hypotese-drevet datainnsamling for å avgrense og teste molekylære signaturer og biomarkører 14-16. Fremgangsmåten vil bli brukt til å undersøke molekylære og protein forstyrrelsene i in vivo og in vitro-modeller hvor de beskrevne mål mirnas er eksperimentelt overuttrykt eller hemmet. Nye analyser tillate samtidig kvantifisering av mRNA og proteins direkte fra celler og vev lysatene. Videre ved å optimalisere rensing av spesielle fraksjoner av perifert blod og ekskrementer (f.eks urin) og ved å tilpasse og optimalisere visse analyseparametere, molekylære profiler og signaturer av molekylære konsentrasjons fraksjoner (f.eks exosomal fraksjoner) lav vil bli undersøkt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).
