Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların değerli bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Lipid açısından zengin larva yemlerinin protokolleri, diyet floresan lipid analoglarının canlı görüntülenmesi ve gıda alımının miktarının belirlenmesi açıklanmıştır. Bu teknikler çeşitli tarama, görüntüleme ve hipoteze dayalı sorgulama tekniklerine uygulanabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, larva zebra balığının, embriyo ortamında yumurta sarısının sonikasyonla oluşturulmasıyla oluşturulan tavuk yumurta sarısı lipozomlarının bir emülsiyonundan oluşan, lipit açısından zengin bir öğünün nasıl besleneceğini açıklar. Larvaları yumurta sarısı tüketimi için taramak için ayrıntılı talimatlar verilmiştir, böylece beslenemeyen larvalar deneysel sonuçları karıştırmaz. Tavuk yumurtası sarısı lipozomları, yağ asitleri ve kolesterol dahil olmak üzere floresan lipid analogları ile çivilenebilir ve bu da diyet lipid işlemesinin hem sistemik hem de hücre altı görselleştirilmesini sağlar. Yüksek ve düşük büyütmede hem dik hem de ters objektiflerle kısa ve uzun süreli canlı görüntülemeye elverişli olan larvaları monte etmek için çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Ek olarak, floresan lipid analogları ile beslenen larvaların lipitlerini ekstrakte ederek, lipitleri ince bir tabaka kromatografi plakası üzerinde tespit ederek ve floresanı ölçerek larva besin alımını ölçmek için bir test sunulmaktadır. Son olarak, prosedürlerin kritik yönleri, önemli kontroller, belirli deneysel soruları ele almak için protokolleri değiştirme seçenekleri ve potansiyel sınırlamalar tartışılmaktadır. Bu teknikler sadece odaklanmış, hipotez odaklı araştırmalara değil, aynı zamanda diyet lipid metabolizmasını ve gıda alımının kontrolünü incelemek için çeşitli ekranlara ve canlı görüntüleme tekniklerine de uygulanabilir.
Giriş
bağırsak diyet lipit işleme düzenleyen mekanizmalar, karaciğer karmaşık lipit sentezi ve lipoprotein metabolizmasını kontrol eder ve bu organların besin alımını kontrol etmek için merkezi sinir sistemi ile çalışmak nasıl tam olarak anlaşılamamıştır. Obezite, kalp-damar hastalıkları, diyabet ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının mevcut salgın hastalıklar ışığında bu biyoloji aydınlatmak için biyomedikal ilgi çekicidir. Hücre kültüründe Çalışmalar ve fareler diyet lipidler ve hastalık ve Zebra balığı (Danio rerio) arasındaki mekanik ilişkileri anlayışımız çoğunluğu sağladı bu çalışmayı tamamlamak için ideal bir model olarak ortaya çıkmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokoller Bilim Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Carnegie Institution (protokol no. 139) tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvan hazırlanması
- 14 saat 28 ° C'de yetişkin ve larvaları korumak: 10 saat aydınlık: karanlık döngüsü. Kabuk serbest Artemia (decapsulated olmayan taramalarla, 14 dpf'e başlayarak) ve ticari mikropelletler ile günde iki kez yetişkin besleyin.
- Bu protokoller AB kökenli doğal yumurtlama tarafından toplanan 6-7 dpf larvaları kullanımı için optimize edilmiştir. Protokoller diğer yaştan ve her kökenden larvalar için modifiye edilebilir. eksojen yiyecek önce 6 dpf vermeyin.
- Embriyo medya....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
29-31 ° C'de bir rocker verildiğinde, sağlıklı larvaların (≥95%) çoğunluğu 1 saat içinde yemek. yumurta sarısı emülsiyonu tüketen üzerine, larva bağırsak rengi koyulaşır. Çok koyu bağırsaklar 2 saat (Şekil 1) görülebilir. Larvalar beslenmemiş ya da beslemek için başarısız olursa, bağırsak açık kalır. Larva beslenen yumurta beyazı sergi renkli karartmak değil şişmiş bağırsak lümen.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan teknikler araştırmacılar, bir lipit bakımından zengin yem ile larva Zebra balığı tedavi canlı larva diyet lipit işleme görselleştirmek ve larva besin alımını ölçmek için izin verir. başarı sağlamak için, özel dikkat birkaç kritik adımlar verilmelidir. Ticari tavuk yumurtası değişir; Potansiyel değişkenliği en aza indirmek için biz omega-3 yağ asitleri için zenginleştirilmiş değil kafes ücretsiz tavuk organik yumurta tüm testleri gerçekleştirmek. Düşük besleme oranları daha genç 6 gıda alımını (yani,.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, görüntüler için Meng-Chieh Shen'e, el yazması hakkında yararlı yorumlar sağladığı için Jennifer Anderson'a ve bu tekniklerin geliştirilmesine katkılarından dolayı Farber laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. Bu çalışma NIDDK-NIH ödül RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (Zebra Balığı Fonksiyonel Genomik Konsorsiyumu: PI Stephen Ekker ve Co-PI S.A.F) ve F32DK096786 (JPO) tarafından finanse edilmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. G. Harold ve Leila Y. Mathers Yardım Vakfı tarafından S.A.F laboratuvarına ve Carnegie Bilim Enstitüsü bağışına ek destek sağlandı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Trikain (etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Larva zebra balığı için anestezi |
| Tavuk yumurtası | N/A | N/A Organik | , kafessiz yumurtalar, omege-3 yağ asitleri için zenginleştirilmemiş |
| Ultrasonik işlemci 3000 sonikatör | Misonix, Inc. | S-3000 | Yumurta sarısı lipozomları yapmak için |
| Sonabox akustik muhafaza | Misonix, Inc. | 432B | Yumurta sarısı lipozomları yapmak için |
| 1/8" konik mikro uçlu | Misonix, Inc. | 419 | Yumurta sarısı lipozomları yapmak için |
| Amber şişeler (4 ml, cam) | National Scientific | 13-425 | Lipid depolama; şişeler, üstü açık kapaklar ve septa kapağı içerir |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Yemler için kuluçka çalkalayıcı |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Hekzadekanoik Asit) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Dodekanoik Asit) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Pentanoik Asit) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Propiyonik Asit) |
| TopFluor kolesterol | Avanti Polar Lipidler A.Ş. | 810255 | Floresan lipid analogu; 23- (dipirroteneboron diflorür) -24-norkolesterol |
| TopFluor kolesterol çözünürlüğü için | yağ asidi içermeyen BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G |
| Metil selüloz | Sigma-Aldrich | M0387 | Canlı larva görüntüleme için montaj ortamı; 75 x 25 x 1 mm |
| Düşük erime agaroz | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Canlı larva için montaj ortamı Görüntüleme; 22 x 30 |
| VWR mikroskop slaytları | VWR | 16004-422 | Canlı görüntüleme için larvaların montajı |
| Lameller | Kapak Camı | 12-544A | Canlı görüntüleme için montaj larvaları |
| Süper yapıştırıcı | Loctite | LOC01-30379 | Canlı görüntüleme için montaj larvaları |
| FluoroDish (cam tabanlı tabak) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Canlı görüntüleme için larvaların montajı; 35 mm çanak, 23 mm cam, 0,17 mm cam kalınlığı |
| Konfokal mikroskop | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Yüksek büyütmeli canlı görüntüleme için |
| büyütmeli canlı görüntüleme için | Stereoskop | Nikon | SM21500 |
| Cam kültür tüpleri | Kimble | 73500-13100 | Lipid ekstraksiyonu; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid ekstraksiyonu |
| Kanallı TLC plakaları | Whatman Scientific | WC4855-821 | Gıda alımı testi; LK5D Silika Jel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um kalınlığında; |
| Durdurulan Kanallı TLC plakaları | Analtech, Inc. | 66911 | Gıda alımı testi; Whatman Scientific TLC plakaları için doğrudan değiştirme |
| Typhoon 9410 Değişken Modlu Görüntüleyici | GE Healthcare | 9410 | Gıda alımı tahlili için floresan plaka okuyucu |
| ImageQuant yazılımı | GE Healthcare | 29000605 | Gıda alım tahlilinin analizi |
| 5 3/4' Geniş çaplı, borosilikat tek kullanımlık pastör pipetleri | Kimble | 63A53WT | Larvaların aktarılması |
Kaynaklar
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
