Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
कैंसर में कार्यात्मक चालक की घटनाओं की पहचान उपन्यास दवा लक्ष्यों की अगली पीढ़ी की खोज के लिए कैंसर जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए केंद्रीय और अपरिहार्य है। यह स्पष्ट है कि कैंसर के और अधिक जटिल मॉडल पूरी तरह से योगदान कारक है कि इन विवो में tumorigenesis ड्राइव और उपन्यास चिकित्सा कि क्लिनिकल परीक्षण के लिए पूर्व नैदानिक मॉडल से संक्रमण बनाने की प्रभावकारिता को बढ़ाने की सराहना करने के लिए आवश्यक हैं होता जा रहा है।
यहाँ हम वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर spheroids पैदा करने के लिए एक पद्धति है कि siRNA कार्यात्मक स्क्रीनिंग के अधीन किया जा सकता उपस्थित थे। ये spheroids कई विशेषताएं है कि ठोस ट्यूमर है कि परंपरागत दो आयाम संस्कृति में मौजूद नहीं हैं में पाया जाता है प्रदर्शित करते हैं। हम बताते हैं कि कई आमतौर पर इस्तेमाल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों इस प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी हैं। इसके अलावा, हम सबूत की सिद्धांत स्तन कैंसर कोशिका लाइन BT474 उपयोग डेटा प्रदान करते हैं, इस बात की पुष्टि उनकीepidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर HER2 और phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) के उत्परिवर्तन के प्रवर्धन पर निर्भरता जब ट्यूमर spheroids के रूप में हो। अंत में, हम आगे की जांच और इन immunohistochemistry का उपयोग निर्भरता के स्थानिक प्रभाव पुष्टि करने के लिए सक्षम हैं।
ठोस ट्यूमर महत्वपूर्ण ऊतकीय, जेनेटिक और सूक्ष्म पर्यावरण इंट्रा-ट्यूमर विविधता है, जो रोगियों को सफलतापूर्वक इलाज करने में सक्षम होने के नाते में एक महत्वपूर्ण चुनौती के साथ चिकित्सकों प्रस्तुत प्रदर्शित करते हैं। उपन्यास की पहचान करने के लिए इस्तेमाल मॉडल के बहुमत लक्षित चिकित्सा इन सुविधाओं के कई शामिल नहीं है। दरअसल, वर्तमान लक्षित क्लिनिक में उपयोग उपचारों स्क्रीनिंग दृष्टिकोण है कि दो-आयामी (2 डी) संस्कृति परिस्थितियों में विकसित कैंसर कोशिका लाइनों पर भरोसा रोजगार पिछले एक दशक में विकसित किया गया है। हालांकि इस तरह के रिसेप्टर tyrosine काइनेज अवरोधकों के रूप में विभिन्न सफलताओं, के बारे में लाया गया है, यह स्पष्ट कैंसर के और अधिक जटिल मॉडल पूरी तरह से योगदान कारक है कि इन विवो में tumorigenesis ड्राइव और नए उपचारों कि से संक्रमण बनाने की संख्या में वृद्धि की सराहना करने के लिए आवश्यक हैं कि बनता जा रहा है क्लिनिकल परीक्षण के लिए पूर्व नैदानिक मॉडल। इसके अलावा, यह अब अच्छी तरह से सराहना की है कि 2 डी संस्कृति प्रणालियों में प्रतिबिंबित करने के लिए असफलव्यवहार 1,2 विवो। उदाहरण के लिए, खराब vascularized ट्यूमर में, microenvironment के भीतर ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के लिए मांग आपूर्ति के रूप में आगे बढ़ना, उच्च और निम्न प्रसव के क्षेत्रों का विकास। कम ऑक्सीजन (हाइपोक्सिया) ट्यूमर में की उपस्थिति, के रूप में इस तरह के कार्बोनिक anhydrase IX (CAIX) के रूप में स्थापित hypoxic मार्करों के लिए ट्यूमर वर्गों के immunohistochemical धुंधला द्वारा पता लगाया, जैसे 3,4 इस प्रकार को शामिल सुविधाओं स्तन कैंसर में एक गरीब नैदानिक परिणाम के साथ संबद्ध स्क्रीनिंग मॉडल में हाइपोक्सिया उपन्यास दवा लक्ष्य है कि इन विवो में और अधिक प्रभावशाली हो जाएगा खोजने के लिए अपनी क्षमता में वृद्धि हो सकती है। दरअसल, सफलतापूर्वक लक्षित कर आक्रामक ट्यूमर है कि हाइपोक्सिया शामिल एक नैदानिक प्राथमिकता 5 है।
पारंपरिक 2 डी siRNA स्क्रीनिंग के फेरबदल, और अधिक सही शर्तों ट्यूमर microenvironment में कैंसर की कोशिकाओं द्वारा सामना की तत्वों पुनरावृत्ति करने की कोशिश में, कई जीनों की पहचान वीं के लिए प्रेरित कियापर इन विवो में ट्यूमर के विकास के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए पाया गया है। इन कार्यात्मक जीनोमिक कम सीरम की स्थिति 6, hypoxic शर्तों के तहत 7 और 8 संयोजन में प्रदर्शन स्क्रीन शामिल हैं। उदाहरण के लिए, 6-Phosphofructo-2-kinase / फ्रुक्टोज-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), एक प्रोटीन कार्बन में प्रवेश ग्लाइकोलाइसिस को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार के मुंह बंद करने के लिए, केवल प्रोस्टेट कैंसर मेटास्टेसिस से निकाली गई लाइनों में apoptosis जब कम सीरम में उगाया प्रेरित किया। एक ही परिस्थितियों में सामान्य प्रोस्टेट सेल लाइनों में PFKFB4 का मुंह बंद कोई प्रभाव नहीं पड़ा है, जबकि, PFKFB4 की कमी पूरी तरह से ablated प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन के विकास Xenografts 6।
स्तन कैंसर कोशिका लाइनों की एक विस्तारित पैनल में, मोनो carboxylase ट्रांसपोर्टर 4 (MCT4) का मुंह बंद करने रियायत के तौर पर कम ऑक्सीजन की शर्तों के तहत सेल लाइन के विकास की कमी के लिए नेतृत्व किया। इस कमजोरी का स्तन कैंसर कोशिका लाइन orthotropic xenogra इन विवो में मान्य किया गया थाFTS। पोषक तत्व तनाव की स्थिति के तहत शायद सबसे ऊँची, एसिटाइल सीओए synthetase 2 (ACSS2), एक एंजाइम एसिटाइल सीओए में एसीटेट बदलने के लिए जिम्मेदार का मुंह बंद करने, कम कैंसर सेल नंबर (कम ऑक्सीजन और सीरम), लेकिन सामान्य संस्कृति की शर्तों के तहत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ा 8। ACSS2 पृथक सुझाव है कि पोषक तत्वों की ढ़ाल ट्यूमर microenvironment के भीतर और कहा कि कोशिकाओं है कि इन क्षेत्रों में रहते हैं ट्यूमर प्रगति 8 के लिए आवश्यक हैं अलगाव में मौजूद नहीं है स्तन और प्रोस्टेट कैंसर xenografts के विकास को प्रभावित किया। इसके अलावा, ACSS2 भी ग्लियोब्लास्टोमा और हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा 9,10 में महत्वपूर्ण होने के लिए, सुझाव ट्यूमर में वृद्धि हुई ACSS2 गतिविधि एक मौलिक तंत्र प्रतिकूल परिस्थितियों के तहत विकास का समर्थन करता है कि हो सकता है कि पाया गया था।
सामूहिक रूप से, इन अध्ययनों साबित होता है कि स्थितियों में विवो का सामना करना पड़ा recapitulating और siRNA स्क्रीन प्रदर्शन जी की पहचान के लिए अनुमति देता हैकैंसर अस्तित्व के लिए आवश्यक Enes। के रूप में अच्छी तरह से पोषक तत्व तनाव की शर्तों के तहत 2 डी कैंसर कोशिकाओं के विकास को प्रभावित के रूप में, इन अध्ययनों में लक्ष्य जीन की कमी कैंसर कोशिका लाइन अंडाकार आकृति विकास हिचकते, मिरर क्या ट्यूमर xenografts 6.8 में मनाया गया। इस प्रकार, कैंसर कोशिका लाइन spheroids ट्यूमर microenvironment में सामना की स्थिति है कि ACSS2 मुंह बंद करने के लिए संवेदनशीलता प्रदान के कई होते हैं। दरअसल, spheroids पोषक तत्व ढ़ाल (सीरम और ऑक्सीजन), पीएच में परिवर्तन प्रदर्शित, तीन आयामी (3 डी) सेल सेल से संपर्क करें, लेकिन यह भी, सेल चक्र गिरफ्तारी और apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं के साथ proliferative ज्लदी में परिवर्तन। यह परिगलित क्षेत्रों के कैंसर spheroids में उपस्थिति द्वारा उदाहरण है, एक विशेषता यह पारंपरिक 2 डी संस्कृति में नहीं मिला।
कैंसर सेल spheroids पहले से ही छोटे अणु अवरोधकों स्क्रीन करने के लिए और अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह केवल यौगिक प्रभावकारिता के सत्यापन या कम्पो की repurposing के लिए अनुमति देता हैunds मूल रूप से अन्य रोगों 11 के लिए डिजाइन। वर्तमान अंडाकार आकृति स्क्रीनिंग तरीकों उच्च सामग्री ढंग का एक उच्च throughput में विशिष्ट जीन की कमी के विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं है। यहाँ, हम पहली बार के लिए का वर्णन है, कैंसर कोशिका लाइन spheroids में छोटे दखल शाही सेना (siRNA) तकनीक का उपयोग विशेष जीन निर्भरता को उजागर करने के लिए एक कार्यात्मक जीनोमिक्स पाइपलाइन। हम मानव स्तन कैंसर में 200 सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन को निशाना siRNAs के साथ एक bespoke पुस्तकालय बनाया गया है और BT474 स्तन कैंसर spheroids में अंडाकार आकृति आकार और चयापचय गतिविधि पर जीन की कमी के प्रभाव का आकलन किया। हम मजबूती के साथ और reproducibly ErbB2 और PIK3CA 3 डी संस्कृतियों में मुंह बंद के प्रभाव का पता लगाने में सक्षम थे। इसके अलावा, हम immunohistochemistry का उपयोग BT474 spheroids के स्थानिक संरचना पर जीन की कमी के प्रभाव का आकलन कर सकता है।
कैंसर के तीन आयामी मॉडल तेजी से जाना जाता है और उपन्यास यौगिकों कि चुनिंदा कैंसर कोशिकाओं को मारने के लिए डिजाइन किया गया है की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जा रहा है। कैंसर सेल spheroids संरचनाओं कि अधिक विवो में ट्यूमर में आई उन लोगों के लिए इसी तरह की स्थिति प्रदर्शित इस प्रकार यौगिकों कि 3 डी में प्रभावकारिता में वृद्धि हुई है और अधिक विवो में एक प्रभाव है की संभावना है कर रहे हैं। हालांकि, इन तौर तरीकों संभावित उपन्यास लक्ष्य है कि है कि कैंसर के इलाज में काफी प्रभावकारिता हो सकता दवा डिजाइन का विषय रहा नहीं की पहचान के लिए अनुमति नहीं है।
हम एक siRNA कार्यात्मक जीनोमिक्स दृष्टिकोण है कि कैंसर कोशिका लाइन spheroids में सात दिनों के लिए टिकाऊ जीन मुंह बंद करने के लिए अनुमति दी विकसित की है। प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण कदम है कि अनुकूलन की आवश्यकता एक siRNA स्क्रीन प्रदर्शन किया जा सकता से पहले कर रहे हैं। एक बड़े पैमाने पर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य व्यवहार्य spheroids फार्म की क्षमता जरूरी है। इसके अलावा, एकppropriate अभिकर्मक शर्तों कड़ाई से अनुकूलित किया जाना चाहिए। हम उचित गैर लक्ष्यीकरण के साथ कई अलग अलग अभिकर्मक अभिकर्मकों trialing और स्क्रीन प्रयास करने से पहले नियंत्रण की हत्या के सुझाव देते हैं। हम जानते हैं कि कई आमतौर पर इस्तेमाल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों, अर्थात् BT474, MCF10DCIS.com, एमडीए MB-231 और JIMT1 siRNA अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी थे दिखाने के लिए सक्षम थे। इसके अलावा, हम सबूत की सिद्धांत डेटा BT474 spheroids में स्तन कैंसर में 200 सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन स्क्रीनिंग प्रदान करते हैं HER2 के प्रवर्धन और PIK3CA की ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन पर अपनी निर्भरता की पुष्टि की। दिलचस्प है, प्रतिलेखन कारक FOXO3 का मुंह बंद करने अंडाकार आकृति आकार में कमी लेकिन व्यवहार्यता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव में हुई। FOXO3, हाइपोक्सिया के जवाब को विनियमित करने के लिए उन्हें अपने वातावरण से 16 अधिक आसानी से अनुकूलित करने के लिए अनुमति कैंसर कोशिकाओं के चयापचय क्षमता फेरबदल में जाना जाता है। इस भूमिका के संभावित सेल व्यवहार्यता पढ़ने के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, क्योंकि यह एटीपी बहुतायत का पता लगाता है, सेल चयापचय के मुख्य उत्पादों में से एक।
अंडाकार आकृति आकार में कमी के अवलोकन के समर्थन में, यह दिखाया गया है हेला में FOXO3 की है कि मुंह बंद ट्यूमर के विकास बिगड़ा और प्रेरित apoptosis 17 Xenografts। यह ध्यान रखें कि कुछ जीन कैंसर की कोशिकाओं की क्षमता उनके 3 डी वास्तुकला, जो झूठी सकारात्मक में परिणाम सकता है बनाए रखने के लिए प्रभाव हो सकता है महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, ई-Cadherin की पछाड़ना BT474 अंडाकार आकृति संरचना के विघटन में हुई। यह पहले से उपयोग कर ई-Cadherin लक्षित एंटीबॉडी 18 सूचित किया गया था। किसी भी स्क्रीनिंग मंच के साथ के रूप में, संभावित ठिकानों मनाया प्रभाव का आकलन करने के लिए reproducibility rescreened किया जाना चाहिए। वहाँ तकनीक, अर्थात् siRNA की मध्यस्थता जीन पछाड़ना के क्षणिक प्रकृति के लिए सीमाएं हैं। मुंह बंद निरंतर अब से सात दिन siRNA के साथ प्राप्त नहीं था।
इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह विभिन्न अन्य बायोम के साथ मिलकर किया जा सकता हैtric रंगों न सिर्फ उन है कि अंडाकार आकृति व्यवहार्यता का आकलन, उदाहरण के लिए, अंडाकार आकृति हाइपोक्सिया के स्थानिक जानकारी देने या apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं की निगरानी। इसके अलावा, क्योंकि प्लेट पाठक स्कैन अपेक्षाकृत जल्दी और गैर इनवेसिव हैं, अंडाकार आकृति आकार पर siRNAs के प्रभाव को समय के साथ के बजाय सिर्फ प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर मूल्यांकन किया जा सकता है। दरअसल, हम वर्तमान में हमारे स्क्रीनिंग पाइपलाइन के भीतर इन रास्तों में से कई तलाश रहे हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि 3 डी संस्कृतियों का इस्तेमाल उपन्यास निर्भरता की पहचान करने के लिए रासायनिक पुस्तकालयों कि लक्ष्य या प्रोटीन की विशेष परिवारों का एक व्यापक रेंज या तो बाधित का इस्तेमाल होता है। दरअसल, Bitler एट अल। डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा 19 में ARID1A स्थिति और EZH2 अवरोधकों के बीच कृत्रिम मारक बातचीत की पहचान करने के लिए इस लक्षित दृष्टिकोण का उपयोग किया। CRISPR-Cas9 जीन संपादन प्रौद्योगिकी की खोज भी organoid संस्कृतियों और इन विवो में आनुवंशिक स्क्रीन के विकास के लिए अनुमति दी गई है। हालांकि, टीअपने दृष्टिकोण उपयुक्त पशु सुविधाओं वाले पर निर्भर है और निषेधात्मक 20 खर्च किया जा सकता है।
अंत में, हमें विश्वास है कि हम एक प्रोटोकॉल रेखांकित किया है कि और अधिक सही मॉडल ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की ढ़ाल, जो vivo में ट्यूमर microenvironment की सुविधाओं, उपन्यास कैंसर लक्ष्य या स्थापित लक्ष्यों की मजबूत सत्यापन की पहचान के लिए अनुमति दे रहे हैं। इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल सेल लाइन है कि spheroids रूपों और इसलिए नियमित तौर पर उच्च throughput siRNA स्क्रीन के लिए कैंसर अनुसंधान समुदाय में इस्तेमाल किया जा सकता है की किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |