Abstract
Identifiseringen av funksjonelle driver hendelser i kreft er sentralt for å fremme vår forståelse av kreft biologi og uunnværlig for oppdagelsen av den neste generasjonen av romanen narkotika mål. Det blir tydelig at mer komplekse modeller av kreft er nødvendig for å få fullt utbytte av de medvirkende faktorene som driver tumorigenesis in vivo og øke effekten av nye behandlingsformer som gjør overgangen fra prekliniske modeller for å kliniske studier.
Her presenterer vi en metode for generering av ensartede og reproduserbare kreft kuler som kan bli utsatt for siRNA funksjonell screening. Disse sfæroider vise mange egenskaper som er funnet i solide svulster som ikke finnes i tradisjonelle to-dimensjon kultur. Vi viser at flere vanlige brystkreftcellelinjer er mottagelig for denne protokollen. Videre gir vi proof-of-prinsippet data ved å benytte brystkreft cellelinje BT474, bekrefter deresavhengigheten av forsterkning av den epidermale vekstfaktor-reseptor-HER2 og mutasjon av fosfatidylinositol-4,5-bifosfat 3-kinase (PIK3CA) når de dyrkes som tumor sfæroider. Endelig er vi i stand til å undersøke og bekrefte den romlige virkningen av disse avhengig hjelp immunhistokjemi.
Introduction
Faste tumorer vise signifikant histologisk, genetisk og mikro-miljø intra-tumor heterogenitet, som presenterer klinikere med en betydelig utfordring i å være i stand til å behandle pasienter med hell. De fleste av modellene som brukes til å identifisere nye målrettede behandlingsformer ikke innlemme mange av disse funksjonene. Faktisk har dagens målrettet terapi brukt i klinikken er utviklet i det siste tiåret ansette screening tilnærminger som er avhengige av kreft cellelinjer dyrket under to-dimensjonale (2D) dyrkningsforhold. Selv om dette har ført til en rekke suksesser som reseptor tyrosin kinase hemmere, blir det tydelig at flere komplekse modeller av kreft er nødvendig for å få fullt utbytte av de medvirkende faktorene som driver tumorigenesis in vivo og øke antallet nye behandlingsformer som gjør overgangen fra prekliniske modeller til kliniske studier. Dessuten er det nå godt verdsatt at 2D kultursystemer unnlater å reflektere ivivo oppførsel 1,2. For eksempel, i dårlig vaskularisert svulster, som behovet for oksygen og næringsstoffer i mikromiljøet overgå tilbudet, regioner av høye og lave leveranser utvikle. Nærværet av lave oksygen (hypoksi) i tumorer, som detektert ved immunhistokjemisk farging av tumorsnitt for etablerte hypoksiske markører slik som karbonsyreanhydrase IX (Caix), korrelerer med en dårligere klinisk resultat i brystkreft 3,4 Således omfatter funksjoner såsom hypoksi til screening modeller kan forbedre vår evne til å oppdage nye narkotika mål som vil være mer effektivt in vivo. Faktisk vellykket rettet mot aggressive kreftsvulster som inneholder hypoksi er en klinisk prioritet 5.
Den endring av tradisjonell 2D siRNA screening, i et forsøk på mer nøyaktig å rekapitulere elementer av de vilkår som oppdages av kreftceller i svulsten mikromiljøet, har ført til identifisering av flere gener thpå har blitt funnet å være viktig for tumorvekst in vivo. Disse inkluderer funksjonell genomikk skjermer som utføres under lave serum forhold til 6, hypoksiske forhold 7 og i kombinasjon åtte. For eksempel stanse av 6-Phosphofructo-to-kinase / Fruktose-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), et protein ansvarlig for å regulere karbon kommer inn glykolyse, bare indusert apoptose i prostatakreft linjer avledet fra metastaser når dyrket i lav serum. Stanse av PFKFB4 i normale prostatacellelinjer under samme forhold hadde ingen effekt, mens utarming av PFKFB4 helt ablated veksten av prostatakreft cellelinje xenografter 6.
I en utvidet panel av brystkreftcellelinjer, ved å stanse all mono-karboksylase transportør 4 (MCT4) fortrinnsvis ført til reduksjon av cellevekst under betingelser med lav oksygen. Dette sikkerhetsproblemet ble validert in vivo i brystkreftcellelinje ortotrop xenograFTS. Kanskje mest påfallende, tie av acetyl-CoA-syntetase 2 (ACSS2), et enzym som er ansvarlig for konvertering av acetat til acetyl-CoA, redusert kreftcellen nummer under næringsstressbetingelser (lav oksygen og serum), men hadde liten eller ingen effekt under vanlige kulturbetingelser 8. Ablasjon av ACSS2 påvirket veksten av brystkreft og prostatakreft xenografter som tyder på at nærings gradienter ikke eksisterer i isolasjon i svulsten mikromiljøet og at celler som bor i disse regionene er avgjørende for tumorprogresjon 8. Videre ACSS2 ble også funnet å være viktig i glioblastom og levercellekarsinom 9,10, noe som tyder på at økt ACSS2 aktivitet i svulster kan være en grunnleggende mekanisme som støtter vekst under ugunstige forhold.
Sammen er disse studier beviser at recapitulating betingelsene påtreffes in vivo og å utføre siRNA skjermer gjør det mulig å identifisere gEnes avgjørende for overlevelse etter kreft. I tillegg til å påvirke 2D kreft celle vekst under nærings stress forhold, uttømming av målgener i disse studiene hemmet kreft cellelinje spheroid vekst, speiling hva som ble observert i tumorxenotransplantater 6,8. Dermed kreftcellelinje kuler inneholde flere av de forholdene som oppstod i svulsten mikromiljøet som formidler følsomhet for ACSS2 demping. Faktisk, sfæroider vise nærings gradienter (serum og oksygen), endringer i pH, tre-dimensjonal (3D) celle-celle-kontakt, men også, endringer i proliferativ celerity med celler som gjennomgår cellesyklus og apoptose. Dette eksemplifiseres ved tilstedeværelse i kreft kuler av nekrotiske områder, en funksjon som ikke finnes i tradisjonelle 2D kultur.
Kreft celleklumper har allerede blitt brukt som mer biologisk relevante modeller for å skjerme små molekyl hemmere, men dette bare gjør for validering av sammensatte effekt eller gjenbruk av compounds opprinnelig designe for andre sykdommer 11. Nåværende sfæroid screening metoder tillater ikke for analyse av spesifikke gen uttømming i en high-throughput av høyt innhold måte. Her beskriver vi for første gang, en funksjonell genomforskning rørledning for å avdekke spesifikke genet avhengig utnytte små interfererende RNA (siRNA) teknologi i kreftcellelinje kuler. Vi laget et skreddersydd bibliotek med sirnas rettet mot de 200 mest muterte gener i menneske brystkreft og vurdert effekten av genet utarming på spheroid størrelse og metabolsk aktivitet i BT474 brystkreft kuler. Vi var i stand til robust og reproduserbart oppdage effekten av ErbB2 og PIK3CA stanse i 3D kulturer. Videre kan vi vurdere effekten av genet utarming på den romlige arkitektur BT474 kuler ved hjelp av immunhistokjemi.
Protocol
1. Utarbeidelse av 96-brønns siRNA Plates
Merk: De ytre kanter av en 96-brønns plate er mer utsatt for fordampning i forhold til andre brønner, og dermed begrense mengden av sirnas til 60 96-brønns plate. Fyll ytre brønner med vanlig medium eller PBS for å begrense dette. I tillegg er en validering skjerm treff anbefales å lindre plate skjevheter.
- Fortynne sirnas til 250-500 ng / mL i redusert serum medium (som per produsentens anbefalinger) og delmengde 10 mL til de aktuelle brønnene i ultra-lav festeplate. Utfør alle skjermene i tre eksemplarer.
MERK: innlemme aktuelle ikke-målretting (negativ) og drepe (positiv, slik som UBB og PLK1) siRNA kontroller i platen design for å sikre transfeksjonseffektivitet kan vurderes. Anvendelse av lav-festeplater for siRNA arbeid er kritisk, da cellene vil bli tilsatt til blandingen transfeksjon. Vi kan ikke utelukke at noen produsenter ultra-lav vedleggPlatene kan ha subtile effekter på celleklump vekst. Derfor anbefales det at disse blir testet av sluttbrukeren. - Bånd med lim sel og butikken ved -20 ° C.
2. Reverse Transfeksjon av cellelinje
- På dagen for skjermen, tine platene ved romtemperatur og spinne i 5 min ved 1000 x g ved anvendelse av en benksentrifuge. Tilsett 10 ul av redusert serummedium inneholdende den optimaliserte-transfeksjon reagens i hver brønn med en multikanal pipette. La platene i 15 minutter for transfeksjon komplekser inneholdende siRNA å danne.
NB: Denne studien anvendes brystkreftcellelinjen BT474 for funksjonell genomisk screening (dyrket i høy glukose DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika). - Trypsineres cellene som skal skjermes (0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA) før de løsner fra kolben, nøytralisere ved hjelp av passende volum av cellelinje specific medium og spinn i 5 min ved 1000 xg på en benk-top sentrifuger for å fjerne trypsin. Resuspender celler med et passende volum av medium og bestemme nøyaktig celle nummer ved hjelp av en celleteller.
MERK: Vanligvis 5000 celler per brønn er tilstrekkelig for spheroid formasjon i de fleste cellelinjer som ble testet. Det er viktig å nøyaktig telle cellene som en enkelt cellesuspensjon for nøyaktig størrelse sammenligninger. - Fortynn cellene til 5000 celler pr 180 ul i kaldt medium (4 ° C).
MERK: Tilsetning av rekonstituert basalmembran matrikskomponenter vil negativt påvirke transfeksjonseffektivitet og det anbefales at det ikke er i bruk. Cellelinje optimalisering for å bekrefte sfæroide dannende evne og knockdown effekt bør utføres før skjermen. - Overfør cellesuspensjonen til en beholder, pipette for å blande og tilsett 180 ul til hver brønn på 96-brønners ultra-lav festeplate som inneholder den siRNA fremstilt tidligere (2,1).
- sentrifugee platen ved 1000 xg i en forhåndskjølt 4 ° C sentrifuge i 10 min og deretter gå tilbake til en 37 ° C vevsdyrkningsinkubator.
- MERK: Cellene vil vises som en mosaikk i bunnen av brønnene. I løpet av de neste 12 - 24 t vil cellene samlet sammen for å danne en enkelt kule.
- Etter 24 timer observere cellene danner en enkelt sfæroid i sentrum av brønnen. Tilsett 100 ul av fullstendig medium til hver brønn for å stimulere vekst.
- Etterfyll medium etter tre dager. Fjern forsiktig 100 ul av mediet fra hver brønn og tilsett 100 ul friskt medium.
- På dag 7, kvantifisere den automatiserte spheroid størrelsen på en plate leser som kvantitativt kan overvåke spheroid vekst over tid (se avsnitt 3).
- Etterpå bestemme celleviabilitet ved hjelp av en selvlysende celle levedyktighet fargestoff (se avsnitt 4).
3. Automated Image Acquisition
- Skann platene på en benk-top, mikro-brønns plate bildebehandling cytometer på dag syv.
- <li> Åpne programvaren, velger du følgende: '96 -Vel plate ', velg riktig platetype og angi et eksperiment navn. MERK: Eventuell tilleggsinformasjon kan også legges inn i programvaren.
- Velg "Tumorsphere 'søknad. Endre fokus slik at spheroid er i fokus og har optimal kontrast.
MERK: Vi anbefaler 'image basert fokus' som betydelige variasjoner i sfæroide størrelser forventes. - Velg brønnene som krever skanning og 'Start scan ".
- Bruke plate skannerprogramvaren, sørge for at objektet masken representerer nøyaktig spheroid størrelse. Gjør dette ved å justere kolonien diameter, border dilatasjon, minimum tykkelse og presisjon innstillinger, er spesifikk for hver cellelinje testet 11,12.
MERK: spheroid området vil da bli beregnet ved hjelp av programvaren algoritme. For eksempel, å nøyaktig beregne arealet av BT474 kuler dyrket i syv dager justere presisjon til "høy" end sette minimum kolonien diameter til 200 mikrometer. Dette skal gi en passende maske sfæroide representative for den sfæroide området.
MERK: Disse dataene kan deretter eksporteres fra maskinen, ved hjelp av eksportfunksjonen i i form av en annotert datafil. Dato er plate median normalisert, kombinert og analysert enten ved Z-stillingen eller strengt standardisert gjennomsnittsdifferanse (SSMD) for å identifisere sirnas som hadde en statistisk signifikant effekt på sfæroide område.
4. Bestemme celleviabilitet
- Etter at sfæroide området har blitt beregnet, bestemme levedyktigheten ved anvendelse av en selvlysende levedyktighet celle fargestoff. Klargjør reagens i henhold til produsentens anvisninger.
- Fjern forsiktig 100 ul av mediet fra hver brønn og tilsett 100 ul av levedyktighet fargestoff. Inkuber plater for 15 min deretter skanne med en selvlysende plateleser.
MERK: Disse dataene kan deretter eksporteres fra maskinen, ved hjelp av eksportfunksjonen, iii form av en kommenterte datafil. Dato er plate median normalisert, kombinert og analysert enten ved z-poeng eller strengt standardisert gjennomsnittlig forskjell (SSMD) for å identifisere sirnas som hadde en statistisk signifikant effekt på spheroid levedyktighet.
Representative Results
Spheroid analyser i ultra-lave feste 96-brønners plater gir en høy gjennomstrømming fenotypiske vurdering for mulig onkogenisitet i en kontekst som lettere rekapitulerer de fysiologiske forholdene som finnes i tumorer in vivo. Faktisk, kreft cellelinjer MCF10DCIS.com og BT474 skjema stramme sfæroide strukturer (figur 1A) og immunhistokjemi etterforskning av sfæroide seksjoner viste tydelige romlige endringer i mobilnettet og kjernefysisk morfologi. Over tid, noen sfæroider som BT474 sfæroider utvikle nekrotiske områder, et felles trekk ved aggressive solide tumorer (figur 1B). Noen sfæroider ikke utvikler nekrotiske kjerner, slik som MDA-MB-231-cellelinjen, men ikke skjerm markert variasjon i den proliferative Ki67 som inverst korrelert med spaltede caspsase-3 ekspresjon, en markør for apoptose (figur 1C). Å etablere at flere cellelinjer er faktisk Receptive til siRNA-mediert genet Slå BT474, ble MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 og JIMT1 celler omvendt transfektert med siRNA i syv dager. Tilstedeværelsen av transfeksjon reagens (mock) eller transfeksjon av kontroll sirnas hadde ingen effekt på celleklump levedyktighet, mens tie av de essensielle genet Ubiquitin B (UBB) betydelig redusert sfæroid levedyktighet i alle cellelinjene som ble testet (figur 1D).
Vi har utformet en menneskelig siRNA bibliotek som omfattet de hyppigst muterte gener i uselektert, ER +, HER2 + og trippel negativ brystkreft. Dette biblioteket består av gener med kjent funksjon, for eksempel MYC, PIK3CA og TP53 og de som bidrag til kreftutvikling er ikke etablert. Skjermen inneholder også flere ikke-målretting kontroll sirnas (Kontroll # 1, Kontroll # 2) og sirnas rettet mot viktige gener som PLK1 og UBB, som fungerer som dreper kontroller (tabell 1). Vi valgte å bruke brystet cancere cellelinjer BT474 som de lett kan danne sfæroider uten tilsetning av rekonstituert basalmembran og det etableres hest cellelinjer og har en kjent genomisk arkitektur. For eksempel, BT474-celler som er positive for østrogenreseptoren (ER +), over-uttrykke human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2 +) og havne mutasjoner i TP53 (E285K) og PIK3CA (K111N) 13.
Ansette protokollen er skissert ovenfor, vi overvåket virkningen genet uttømming hadde på spheroid størrelse og levedyktighet etter syv dager med siRNA omvendt transfeksjon (figur 1E). Interessant, gjorde de fleste av gener ikke ha en betydelig effekt på spheroid område eller levedyktighet (figur 2A). Stanse all FOXO3, PIK3CA, ErbB2 og SF3B1 resulterte i den mest betydnings reproduserbar reduksjon i spheroid størrelse. Denne reduksjonen ble også observert i spheroid levedyktighet etter ErbB2 og SF3B1 lyddemping. Oppmuntrende conf viirmed virkningen av PIK3CA, ErbB2 og SF3B1 stanse på spheroid størrelse ved hjelp av lys-felt mikroskopi (figur 2B). Vi har tidligere identifisert SF3B1 som et essensielt gen i en rekke cellelinje-modeller og således siSF3B1 representerer en god dreping kontroll i tillegg til UBB 14. Interessant, av alle 200-genene bare ved å stanse all E-cadherin resulterte i en betydelig økning i sfæroide levedyktighet (figur 2A). Undersøkelse av sfæroid morfologi viste at E-cadherin stanse resulterte i et fullstendig sammenbrudd av sfæroide arkitektur, med levedyktige celler som hviler på bunnen av den lave feste brønnen (figur 2B). Manuell reinvestigation av spheroid volum skjermen data viste at dette også hadde blitt observert, men hadde blitt eliminert fra området kvantifisering grunn til objektet være over innstilt størrelse begrensninger. Som tidligere fremhevet, BT474 celler overuttrykker den reseptortyrosinkinasehemming HER2 og havnen en onkogen mutasjon i PIK3CA (K111N). Vi bekreftet at stanse av ErbB2 og PIK3CA medførte redusert spheroid levedyktighet, mens transfeksjon med ikke-måls kontroller hadde ingen effekt (figur 2C).
Neste vi undersøkt effekten av siRNA utarming på spheroid histologi. BT474 kuler ble omvendt transfektert med ikke-måls kontroll siRNA og sirnas målretting PIK3CA, ErbB2 og UBB. Stanse av ErbB2 og UBB resulterte i en reduksjon av pro-proliferative Ki67 sammenlignet med kontroll siRNA (figur 2D). Aktiveringen av de pro-apoptotiske markør spaltet caspase-3 ble bare observert etter UBB stanse, noe som tyder på at uttømming av HER2 og PIK3CA førte ikke til apoptose, men var cytostatisk snarere enn cytotoksisk. Faktisk stanse av HER2 og PIK3CA resultere i en økning i protein ekspresjon av cellesyklus-stans protein p27 sammenlignet med kontroll transfekterte kuler.
ent "fo: holde-together.within-siden =" en "> Til sammen viser disse resultatene at BT474-cellene blir drevet av onkogen HER2 og PIK3CA signalering når dyrket som 3D-sfæroider enda viktigere, viser disse resultatene at det er mulig å. designe og implementere en skreddersydd siRNA screening bibliotek med hundrevis av gener i kreftcellelinje kulene robust og reproduserbar.
Figur 1: Cellelinje optimalisering for tre-dimensjonal vekst. A. brystkreftcellelinjer, MCF10DCIS.com og BT474 ble dyrket i lave festeplater for 7 dager. Lysfelt representative bildene ble tatt ved hjelp av en invertert mikroskop. Skala barer = 100 mikrometer. B. MCF10DCIS.com og BT474 kuler ble dyrket i 28 dager. 100 mL av fersk media var etterfylles hver 3 - 4 dager. Spheroids ble løst i 3,8% formaldehyd, embedded, seksjonert og farget med hematoxylin og eosin (H & E). Representative Bildene vises ved lav og høy forstørrelse. Skala stolper representerer 100 um og 33 um, respektivt. C. MDA-MB-231 sfæroider ble dyrket i 21 dager. 100 mL av fersk media var etterfylles hver 3 - 4 dager. Spheroids ble løst i 3,8% formaldehyd, innebygd, seksjonert og farget med Ki67 og kløyvde caspase-3. Representative bilder vises. Skala barer = 100 mikrometer. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, og JIMT1 cellelinjer ble omvendt transfektert med mock (transfeksjon reagens bare) og kontroll sirnas og UBB, ble ultra-lave festeplater deretter spunnet å danne kuler. Friskt medium (100 pl) ble tilsatt på dag 1 og 4. Etter 7 dager ble celle-levedyktighet kvantifisert. Data representerer gjennomsnittet ± SD av to uavhengige biologiske replika utført i triplikat normalisert for å styre # 1. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en unpaIRED Students t-test (p <0,05). E. Et flytdiagram som oppsummerer det motsatte transfeksjon protokoll som brukes til funksjonelt avhøre genet avhengighet i kreftcellelinje kuler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: funksjonell genomikk Undersøkelse av BT474 Spheroids avdekker onkogene avhengigheter. A. BT474 celler ble omvendt transfektert med 200-genet menneskelig siGENOME siRNA bibliotek i tre eksemplarer. ble observert spheroid størrelse og levedyktighet. Rå dataverdier var plate median normaliserte og z-score ble beregnet til å identifisere viktige utliggere større enn 1,7 x standardavviket for platen median 15. Merk utkant gener ErbB2, SF3B1, PLK1 og UBB ennd E-cad. sirnas som vesentlig økt eller redusert spheroid området og levedyktighet er skyggelagt i blått og rødt, hvor rødt viser kontroll siRNA-tallet. B. Celler ble omvendt transfektert med ikke-måls kontroll, E-cadherin (E-Cad), PIK3CA, ErbB2 eller UBB siRNA og deretter spunnet i en ultra-lav festeplate for å danne kuler. Etter 7 dager lysfelt representative sfæroide bildene ble tatt ved bruk av et invertert mikroskop. Skala barer = 100 mikrometer. C. Celler ble omvendt transfektert med ikke-måls kontroll, PIK3CA, ErbB2 eller UBB siRNA og deretter spunnet i en ultra-lav festeplate for å danne kuler. Etter 7 dager ble celle-levedyktighet kvantifisert. Data representerer gjennomsnittet ± SD av to uavhengige biologiske replika utført i triplikat normalisert for å styre # 1. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en uparede Students t-test (p <0,05). D. Etter 7 dager, ble kulene fast, innebygd, seksjonert og fargetfor H & E, Ki67, Spaltet Caspase-3, og p27. Representative bilder vises. Skala barer = 100 mikrometer. Legg merke til H & E av siControl kulene vises mindre på grunn av en gjenstand av behandling og individuelle intakte kuler valgt for farging. Men dette ikke avlede oppmerksomheten fra de observerte endringene med de skannede bildene og celle levedyktighet resultater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-targeting en | TP53 | DST | KMT2C | ubehandlet 1 | FCGBP | ARID1B | FBXM7 | TTC40 | Non-targeting 2 | ||
| GATA3 | TTN | MUC12 | MUC4 | AHNAK | HUWEI1 | DNAH11 | ITPR2 | ABCA13 | CREBBP | ||
| MAP2K4 | PIK3CA | F5 | ApoB | ANKRD30A | MUC17 | DNAH17 | LAMA2 | ESS | CSMD2 | ||
| STARD9 | USH2A | FAT3 | LPR2 | CSMD3 | MYO18B | DNAH5 | MDN1 | ARHGAP5 | DNAH9 | ||
| CXCR3 | MUC16 | RB1 | PKHD1L1 | DNAH2 | SYNE2 | DYNC1H1 | PCLO | CACNA1B | erbB2 | ||
| PLK1 | SYNE1 | LYST | PTEN | SPTA1 | ubehandlet 2 | VHL | RYR1 | COL6A3 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-targeting en | ENAM | RyR2 | BRCA2 | ubehandlet 1 | FMN2 | HECW1 | LAMB4 | SI | Non-targeting 2 | ||
| FHOD3 | MACF1 | RYR3 | C2ORF16 | DMD | FRG1 | HERC2 | MYH11 | STAB1 | ZDBF2 | ||
| GOLGA6L2 | NEB | SMG1 | CACNA1E | DNA14 | GCC2 | HIVEP2 | NIPBL | TANC1 | ZNF536 | ||
| HMCN1 | NF1 | UBR5 | CACNA1F | DYNC2H1 | GON4L | HYDIN | PKD1L1 | TF | ANK3 | ||
| HRNR | OBSCN | USP34 | CYMA5 | FAM208B | GPR112 | ITSN2 | RNF213 | TPR | ASPM | ||
| PLK1 | PCDH15 | XIRP2 | COL7A1 | FLG2 | ubehandlet 2 | VHL | SAGE1 | UNC80 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-targeting en | DCHS2 | MUC5B | ZFHX4 | ubehandlet 1 | MYO9A | SPHKAP | CXORF22 | NCOR1 | VPS13D | ||
| DMXL2 | MXRA5 | ANK2 | KIAA1210 | PRUNE2 | TCHH | DANH6 | NOTCH2 | ANKRD12 | |||
| BIRC6 | DNAH10 | TENM1 | Minibank | LRP1 | SCN10A | VPS13C | DNAH7 | SPEN | C5ORF42 | ||
| CDH1 | DNAH3 | PEG3 | DIDO1 | MAP1A | SCN2A | IPTR3 | ErbB3 | SRRM2 | CCDC88A | ||
| CUBN | NOCK11 | RELN | DNAH8 | MED12 | SHROOM2 | CEP350 | FAT4 | SZT2 | CHD4 | ||
| PLK1 | eys | SACS | KIAA1109 | MED13 | ubehandlet 2 | KMT2A | VPS13A | UBB | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-målretting | QSER1 | ARID1A | WDFY3 | ubehandlet 1 | SDK1 | TEX15 | LAMA1 | Non-targeting 2 | |||
| COL14A1 | SHROOM3 | ATRX | EFCAB5 | SF3B1 | CBFB | AHNAK2 | |||||
| CSMD1 | TBX3 | KIAA0947 | FOXA1 | ITPR1 | DDX3X | KIF4A | |||||
| MEFV | UBR4 | MYCBP2 | INPPL1 | FLG | HECTD4 | FAT2 | |||||
| mgAm | VCAN | NBEAL1 | MAP3K1 | AKAP9 | GPR98 | FOXO3 | |||||
| PLK1 | ZNF462 | SETX | NRP1 | HERC1 | ubehandlet 2 | VHL | UBB | ||||
Tabell 1: Plate Layout and Human siRNA Library De-konvolusjon. Tabellen inneholder innholdet i hver av siRNA bassenger og layout for de lave festeplater som brukes i skjermen.
Discussion
Tredimensjonale modeller av kreft blir stadig mer brukt for å evaluere effekten av kjente og nye forbindelser som har blitt designet for å selektivt drepe kreftceller. Kreft celleklumper er strukturer som viser forholdene mer lik de møtte i tumorer in vivo, og dermed forbindelser som har økt effekt i 3D er mer sannsynlig å ha en effekt in vivo. Men disse modaliteter ikke tillate identifisering av potensielt nye mål som ikke har vært gjenstand for drug design som kunne ha betydelig effekt i behandling av kreft.
Vi utviklet en siRNA funksjonell genomforskning tilnærming som er tillatt for varig genet Slå i opptil syv dager i kreftcellelinje kuler. Det er flere viktige skritt i protokollen som krever optimalisering før en siRNA skjermen kan utføres. Evnen til å danne reproduserbare levedyktige sfæroider på en stor skala er avgjørende. Dessuten, enppropriate transfeksjon forhold bør nøye optimalisert. Vi foreslår trialing flere forskjellige transfeksjon reagenser med passende ikke-målretting og drepe kontroller før du prøver på skjermen. Vi var i stand til å vise at flere vanlige brystkreftcellelinjer, nemlig BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 og JIMT1 var mottakelig for siRNA transfeksjon. Videre gir vi proof-of-prinsippet data screening de 200 mest muterte gener i brystkreft i BT474 kuler, bekreftet sin avhengighet av forsterkning av HER2 og onkogen mutasjon av PIK3CA. Interessant, stanse av transkripsjonsfaktoren FOXO3 resulterte i en reduksjon i sfæroide størrelse, men ingen signifikant effekt på levedyktigheten. FOXO3 er kjent for å regulere reaksjonen på hypoksi, endring av metabolsk kapasitet av kreftceller som tillater dem å tilpasse seg lettere til sine omgivelser 16. Denne rollen kan potensielt forstyrre cellen levedyktighet lesing som det oppdager ATP overflod, En av de viktigste produktene i celle metabolisme.
Til støtte for observasjon av en reduksjon i sfæroide størrelse, har det vist seg at stanse av FOXO3 i HeLa xenotransplantater nedsatt tumorvekst og induserte apoptose 17. Det er viktig å merke seg at noen gener kan påvirke kapasiteten av kreftceller til å beholde sin 3D-arkitektur, som kan føre til falske positiver. For eksempel, knockdown av E-cadherin resulterte i oppløsning av BT474 sfæroide struktur. Dette hadde tidligere blitt rapportert ved bruk av E-cadherin målrettet antistoffer 18. Som med en hvilken som helst screening plattform, bør potensielle mål bli screenet på nytt for å vurdere reproduserbarheten av den effekt som observeres. Det er begrensninger i teknikk, nemlig forbigående art av siRNA-mediert genet knockdown. Vedvarende tie lenger enn syv dager var ikke oppnåelig med siRNA.
Fordelen med denne tilnærmingen er at den kan kobles sammen med diverse andre biomeTric fargestoffer ikke bare de som vurderer spheroid levedyktighet, for eksempel, gir romlig informasjon spheroid hypoksi eller overvåke celler gjennomgår apoptose. Videre fordi plate leseren skanner er relativt rask og ikke-invasiv, virkningen av siRNAs på spheroid størrelse kan vurderes over tid i stedet for bare på den eksperimentelle endepunktet. Faktisk er vi for tiden utforsker flere av disse veier innenfor vår screening rørledningen. En alternativ tilnærming som benytter 3D-kulturer for å identifisere nye avhengigheter er bruken av kjemiske biblioteker som hemmer enten et bredt spekter av mål eller bestemte familier av proteiner. Faktisk Bitler et al. utnyttet dette målrettet tilnærming til å identifisere den syntetiske dødelighet samspillet mellom ARID1A status og EZH2 hemmere i eggstokkene klare karsinomer 19. Oppdagelsen av CRISPR-Cas9 genet redigering teknologi har også tillatt for utvikling av genetiske skjermer i organoid kulturer og in vivo. Imidlertid thans tilnærming er avhengig av å ha egnede dyrefasiliteter og kan koste prohibitive 20.
I konklusjonen, tror vi at vi har skissert en protokoll som mer nøyaktig modeller oksygen- og nærings graderinger, som er funksjoner av svulsten mikromiljøet in vivo, slik at for identifisering av nye kreft mål eller robust validering av etablerte mål. Videre kan vår protokoll brukes på alle typer cellelinje som danner kuler og dermed kan bli rutinemessig brukt i kreftforskning samfunnet for high-throughput siRNA skjermer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200 μL) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10 μL) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1, 000 μL) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5 mL) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture CO2; Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
