פגיעת denudation עורקים לשחזור על ידי infrarenal בטן אב העורקים Clamping במודל Murine

סיכום

הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים של מחדש endothelialization בעקבות פציעת denudation העורקת היא בעלת חשיבות עליונה במניעה פקק restenosis של עורקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול בגין נזקי denudation עורקי לשחזור של אבי העורקים הבטני. הנוהל פותח כדי לחקור את המנגנונים מווסתים התחדשות האנדותל באמצעות מודלי עכבר.

תקציר

התערבויות וסקולרית מלעורית לגרום באופן אחיד פציעות denudation עורקים כי לאחר מכן לגרום לפקקת ו restenosis. סיבוכים אלה ניתן לייחס ליקויים מחדש endothelialization בתוך שולי הפצע. עם זאת, המנגנונים התאיים ומולקולריים של מחדש endothelialization להישאר שיוגדרו. בעוד כמה מודלים של בעלי חיים כדי ללמוד מחדש endothelialization לאחר denudation העורקים זמינים, כמה בוצע העכבר בשל מגבלות כירורגית. זה מערער את ההזדמנות לנצל קווי עכבר מהונדסים לחקור את התרומה של גנים ספציפיים לתהליך מחדש endothelialization. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול ליצירת מודל בעכברים לשחזור ביותר של פגיעת denudation עורק באב העורקים הבטני באמצעות הידוק וסקולרית חיצונית. מכתים Immunocytochemical של aortas פצוע פיברינוגן β-קטנין להדגים את החשיפה של משטח פרו-תרומבוטייםד גבול האנדותל שלם, בהתאמה. השיטה המוצגת כאן יש את היתרונות של מהירות, שיעור ההישרדות הכולל מעולה, וקלות טכנית יחסית, יצירת כלי מעשי ייחודי להטלת פציעה denudation עורקים במודלים עכבר מהונדס. באמצעות שיטה זו, החוקרים עשויים להבהיר את המנגנונים של מחדש endothelialization בתנאים רגילים או פתולוגי.

מבוא

פקקת ו restenosis הם סיבוכים בשלבים מוקדמים ומאוחרים רציני בחולים שעברו התערבויות וסקולרית מלעורית, כגון אנגיופלסטיקה בלון endovascular ו סטנט ^1,2. אסטרטגיות כמה כבר מועסק על מנת לטפל סיבוכים אלה, במיוחד טיפול אנטי טסיות כפול סטנטים משחררי תרופה. עם זאת, התמקדות קצת הושמה על הסיבה הבסיסית של פקק restenosis, כלומר הפסד של כיסוי תא האנדותל (denudation). פציעת denudation היא תוצאה בלתי נמנעת של טיפולים פולשניים עקב טראומה מכאנית אל דפנות כלי דם. טראומה מכאנית זה יכול לגרום ניזק והסרה של שכבת האנדותל המגן וחשיפה של קרום מרתף שריר חלק בכלי דם כדי מחזורי דם ^3. ההפסד של תאי אנדותל באזורים אלה יוצר סביבה פרו-תרומבוטיים ופרו-דלקתית שלא רק מקדם הידבקות טסיות פקק עוקבים, אלאסימפוני יוצר הגירה ושגשוגם של תאי שריר חלק בכלי דם וכתוצאה מכך עיבוי neointimal ו restenosis ^4. סיבוכים אלה, וטיפולים הקשורים בהם, להוביל תחלואה משמעותית, רוב הישנות המחלה איסכמי בעיקר ואירועים דימום המשפיעים על בריאות האדם.

Re-endothelialization הפגיעה הערומה משולי הפצע הוא בעלת חשיבות עליונה במניעה פקק restenosis ^5. תוצאות נתיחה ומודלים של בעלי החיים הוכיחו משיעורי מס מופחתים ביעילות של פקק עם כיסוי של סטנט תמוך ^6,7. סמים משחררי סטנטים, המציאו כדי להקטין שיעורי restenosis ידי עיכוב התפשטות שרירי חלקי היפרפלזיה neointimal, לגרום ליקויים משמעותיים עורקים מחדש endothelialization ושיעורי גדל והולך של פקק מאוחר ^3. למרבה הצער, בהבנת המנגנונים מחדש endothelialization כבר תהליך איטי, מוגבל במידה רבה על ידי חוסר apבמודלים של בעלי חיים propriate ^8.

במודלים של בעלי חיים כמה להבנת התפקידים לתאי אנדותל ותאי שריר חלק בכלי דם בעקבות פציעת עורקים נוצרו ^7,9,10. המודל פציעה בלון עורק התרדמה עכברוש הוא מאופיין הטוב הועסק כדי לחקור את ההשפעות של פגיעה denudation ברמה ברוטו, תאית ומולקולרית ^11. אף על פי כן, מודל בעכברים לשחזור ביותר של פגיעת denudation עורקים עם שיעורי הישרדות מעולים חסר הרבה צורך לנצל קווים מהונדסים מרובים לרשות להבהיר התחדשות כלי דם טוב יותר במסגרות מרובות.

כתב יד זה מציג מודל Murine של פציעת denudation עורקים כי ניתנת לשחזור וקלות לביצוע. הגישה הוכיחה תחלואה ותמותה מינימאליות בכמה קווים מהונדסים. בגלל מספרם הרב רחב של קווי עכבר מהונדס גנטית, מודל זה עשוי לשמשמחדש endothelialization להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס לאחר פציעה denudation.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת המחקר בבעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס.

1. הכנה לפני ואחרי ההרדמה

1. הקפידו למלא אחר טכניקה סטרילית לאורך כל ההליך.
2. לעקר את כל הציוד כירורגי באמצעות חיטוי קיטור.
3. הפעל פלטפורמה כירורגית מכרסם מחומם לפני אינדוקצית הרדמה, כך שהוא עשוי לחמם לטמפרטורה המתאימה (37 מעלות צלזיוס) ומניח תחת סטראו להדמיה במהלך הליך הכירורגי.
4. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה ולגרום עם isoflurane 4% בקצב זרימה של 1 ליטר / דקה.
   1. בזהירות לפקח על צבע עור קצב שודד הנשימה של עכבר במהלך אינדוקציה.
   2. לאחר ההאטה של ​​קצב הנשימה, להסיר את העכבר מאולם האינדוקציה ומניח על משטח מחומם להכנה כירורגית עם פנים בריכוז isoflurane nosecone ותחזוקה נפרד של 2.5%.
   3. בצע קמצוץ הבוהן להעריך הלימות של הרדמה.
5. החל משחת עיניים כדי הקרניות ולנהל carprofen לפני הניתוח (5 מ"ג / ק"ג) תת עורי.
6. המקום העכבר קוצץ פרקדן ושימוש להסרת שיער מהבטן.
7. מכינים את אזור הניתוח עם שלושה עלובי לסירוגין של יוד povidone ואלכוהול איזופרופיל 70% מיושם עם פדי גזה סטרילי.
8. מקום עכבר פרקדן על פלטפורמה כירורגית מחוממת מכרסם עם פן nosecone ולאבטח את כל הגפיים ובזהירות מיקום עכבר כך הבטן גלויה עם סטראו.
9. מניח תחבושות סטריליות, דבק לאורך כל קצה של אזור הניתוח המוכן.
10. לכייל ריכוז isoflurane לשמור הרדמה נאותה במהלך ניתוח תוך שמירת נשימות ספונטניות.

Clamping 2. infrarenal אבי העורקים

1. ביצוע חתך 3 ס"מ לאורך קו האמצע של הבטן באמצעות אזמל, החל approximately 0.5 סנטימטרים נחים בתהליך xiphoid.
2. בעדינות לחזור בו העור עם מלקחיים לנתח עור מקיר הבטן באמצעות מספריים בסדר לחתוך את רקמת חיבור בסדר.
3. החל 0.05-0.1 מ"ל של bupivacaine 0.5% אל הקיר שריר ולעשות חתך 2 ס"מ לתוך דופן הבטן לחשוף את אברי הבטן.
   1. אם הדימום מתרחש לאורך דופן הבטן, להפעיל לחץ עדין עם המוליך כותנה שקצהו.
4. הרם בעדינות את המעיים באמצעות applicators מלוחים ספוג כותנה שקצהו.
   הערה: היזהר, כדי למנוע טראומה קהה אל jejunal ועורק ileal ומניח על ספוג גזה חם, סטרילית ספוגה מלוחה מחוץ חלל הבטן.
   1. מכסה את המעיים עם אחר ספוג גזה חם, סטרילי מלוח ספוגה כדי למנוע אובדן לחות.
5. מניחים מפשק כדי lateralize פי הטבעת ולחשוף את retroperitoneum.
6. מניח פדה גזה קטנה לפי צורך להדמיה של retroperitoneאממ שמירה על מסלול של מספר בשימוש.
7. ברמה של הקוטב הנח בכליה הימנית, להשתמש במלקחיים לנתח חדה לבצע retroperitonotomy לרוחב האאורטה.
   הערה: היזהר שלא לפצוע את הווריד הנבוב הנח או כלי שמסביב.
   1. בבוטות לנתח רקמות retroperitoneal את אבי העורקים נזהר שלא לנקב את הווריד הנבוב הנח או כלי דם שמסביב.
8. מניחים את מהדק וסקולרית מעל האאורטה דקות לפחות 1, או זמן מוגדר אחר, ולאמת חסימה על ידי התבוננות ויזואלית חוסר pulsatility ב אבי העורקים דיסטלי.
9. הסר את המהדק וסקולרית ולאמת המוסטאסיס. המוסטאסיס מושגת ומובטח כשאף extravasation פעיל דם נתפס.
   1. אשר extravasation על ידי הוספת מלח 0.5 מ"ל לתוך חלל הבטן והערכת אם מלוחים הופך יותר ויותר מעורב בדם. אם זה מקרה, להפעיל לחץ עדין באמצעות מוליך ספוג מלוח דקות 1 כדי להבטיחהמוסטאסיס.
10. הסר פדי גזה להציב כדי לסייע להדמיה של retroperitoneum ולהחליף המעיים באתרו לתוך הבטן.
11. להשקות את חלל הבטן באמצעות מי מלח מחומם מראש סטרילית.

סגירת 3. laparotomy ועור

1. סגור את שכבת השריר בדופן הבטן באמצעות 5-0 קלוע, תפר ריצה אחת נספגים.
2. עור הדוק עם 1-3 טיפות של דבק פולימרים ואז לאחר מכן עם קליפים פצע פעם הדבקה מוגדר.

שחזור 4. והערכה לאחר הניתוח

1. מעבירים את העכבר לכלוב ההתאוששות על כרית חימום עם מזון ומים על רצפת הכלוב.
2. לעקוב מקרוב אחר העכבר כדי לגלות סימני מצוקה נשימתית. נהל carprofen (5 מ"ג / ק"ג) על בסיס יומי במשך 48 שעות לאחר הניתוח בהתאם להנחיות המוסד.
   1. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור recum sternalbency.
3. החזר את העכבר בכלוב רגיל עם מזון ומים.
   1. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין.
4. להעריך פצע על בסיס יומי במשך בקיעה ולהסיר קליפים על יום לאחר ניתוח 14.

5. אבי העורקים דיסקציה מכתים

1. עכברים בוחרים להקרבה מבוססת על נקודת הזמן הספציפית של עניין בעקבות פציעת denudation.
2. קורבן עכברים באמצעות שאיפת isoflurane ומייד להזריק עם כלוריד methacholine 5 מ"ג לגרום הרפית שריר חלק בכלי דם.
3. עם האישור למוות על ידי הפסקת נשימה, חוסר רפלקס המצמוץ וחוסר התנועה, perfuse עם 4% paraformaldehyde ב בופר פוספט בלחץ זלוף של 100 מ"מימ כספי דרך חדר הלב השמאלי למשך 10 דקות.
4. השתמש סטראו לנתח כדי להפריד את אבי העורקים בבטן שלם בקפידה מתוךהרקמות הסובבות.
5. Transect מקורה אב העורקים אל עורקי כליות ואת הזנב אל הסתעפות הכסל ופתח דרך חתך אורכי לאורך השטח הגבה.
6. הצמד את אבי העורקים שטוח על צלחת מצופה סיליקון 35 מ"מ עם הצד luminal עד לקיבוע עבור לא פחות מ -2 שעות אך לא יותר מ -12 שעות. בהמשך לכך, הרקמה יכולה להיות מוטבע גם עבור חתך או בשימוש אן-פאס כל ההר immunocytochemistry.
7. הר מוכתם aortas עם הצד luminal מול coverslip על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ confocal.

תוצאות

שמונים וחמש עכברים שעברו את טכניקת הישרדות כירורגית המתוארים בדוח זה עבור ההידוק אבי העורקים הבטני. שיעור ההישרדות הכולל עמד על 85.9%. סיבוכי Operative כללו דימום פנימי ו ניקוב כלי גדול, וכתוצאה מכך תמותת 5.9% ו -3.5% בהתאמה (לוח 1). לאחר התאוששות מן ההרדמה, עכברים ללכת כרגיל לא מראים סימנים של פגיעה איסכמית לגפיים הנחים. אין ירידה במשקל או חוסר התיאבון צוינה.

דיון

Denudation עורקי פגיעה בגוף עקב התערבות מלעורית, כגון אנגיופלסטיקה בלון סטנט בכלי הדם, לגרום פקקת בכלי הדם המוקדמת והמאוחרת ו restenosis ותורם אירועים איסכמיים חוזרים ^3,12. מעניין, clamping וסקולרית כירורגית גם היה מעורב כגורם denudation העורק, הרחבת היקף הבעיה לחולים שעברו כל הליך וסקולרית, אם מלעורית או פתוח ^13. בעוד מחדש endothelialization הלקוי הוא גורם מוכר למדי של פקק restenosis, המנגנונים המולקולריים שמסביב מחדש endothelialization היו קשים להבהיר. במוד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Zeiss Discovery.V12 סטריאומיקרוסקופ	Zeiss	495037-9904-000
פלטפורמה כירורגית מחוממת למכרסמים	Protech International	RES4000	פלטפורמה מחוממת לשמירה על טמפרטורת הגוף עם אף לתחזוקת הרדמה ועליה מבוצע הליך כירורגי
איזופלורן	הנרי שיין	50033	4% אינדוקציה; 2.5% איזופלורן תחזוקה
וופורייזר	סאמיט ציוד רפואי	470062
סטרייקר T / משאבת מחזור מים חמים	קנט סיינטיפיק	TP-700
דמעות מלאכותיות חומר סיכה משחה אופטלמית	Akorn בריאות בעלי חיים	17478-162-35
קרפרייב (קרפרופן)	מעבדות נורברוק	NDC 55529-131-01
Oster™ קוצץ בעלי חיים מקצועי A5	M.Schneider & בנים בע"מ		78005010 שימוש עם קוצץ בעלי חיים בגודל 40
מפסק חוט מתכוונן	Fine Science Tools	17004-05
שוורץ מיקרו סרפינס - Sharp Bend	Fine  כלי מדע	18052-03
מכשירים כירורגיים		מדעיים עדינים	מלקחיים לניתוח חד, מלקחיים קהים, מספריים עדינים, מספריים קפיציים, hemostat
0.5% מרקאין	הוספירה	0409-1610-50
5-0 תפר, Vicryl	Fisher Scientific	NC0189890	מחט מחודדת
Vetbond	Fisher Scientific	NC0304169
Falcon® 35 מ"מ לא מטופל TC קל לאחיזה בסגנון צלחת פטרי בקטריולוגית	351008
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון	Dow Corning	3097358-1004
סיכות חיתוך	פישר סיינטיפיק	NC9681411

כלים