Abstract
Gastrulação é o primeiro conjunto de eventos morfologicamente dinâmicas que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário de animais multicelulares, tais como Drosophila. Esta alteração morfológica é também reconhecido como epitelial para mesenquimal (EMT). A desregulação de EMT está associada com fibrose e metástases do cancro. Há uma evidência emergente de que EMT é controlado por um número de mecanismos moleculares. Como tal, muitos genes-chave que controlam a constrição apical também são conhecidos por serem fatores importantes na EMT observado na metástase do câncer. Como EMT durante Drosophila gastrulação, as células epiteliais podem ser induzidas a alterar a sua forma e ser reprogramadas de modo a redireccionar o destino celular no sentido de vários outros tipos de células. Aqui nós fornecemos um método de imagem robusta de Drosophila gastrulação para ensaiar o início de movimentos celulares morfogenéticos e identificação destino celular durante esta fase do desenvolvimento embrionário. Usando este método, identificamos cEll rearranjo no momento da gastrulação e demonstrar a importância de constrição apical durante a gastrulação utilizando GFP marcado DE-caderina.
Introduction
Gastrulação é o primeiro conjunto de eventos morfologicamente dinâmicas que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário de animais multicelulares, tais como Drosophila 1,2. Curiosamente, a evidência emergente sugere que este processo é regulado através da interação entre os mecanismos mecânicos e moleculares 3. Além disso, o epitelial para mesenquimal (EMT), que é um processo crucial para a gastrulação, também está implicado em processos de doenças humanas, tais como metástases de cancro 4-8. Como tal, muitos genes que controlam a constrição apical também são conhecidos por serem factores fundamentais para o EMT observado na metástase do câncer 9. Assim, constrição apical no momento da gastrulação é um excelente modelo para investigar os mecanismos de regulação acima referidas e para aumentar a nossa compreensão da metástase do cancro. A vantagem desta técnica é que podemos observar o movimento celular no momento da gastrulação em tempo real e, por conseguinte, que serácapaz de rastrear os genes envolvidos na gastrulação, bem como metástase do cancro.
Embora relativamente desconhecido, adesão célula-célula é pensada para desempenhar um papel central na constrição apical 1. Genética de Drosophila é bem adequado para investigações de células individuais de nível explorando mecanismos moleculares reguladoras. Este modelo vai permitir-nos descobrir a importância da constrição apical durante a gastrulação. Além disso, este método pode ser utilizado para rastrear os genes envolvidos em metástase do cancro. Captura de imagens ao vivo de Drosophila gastrulação permitiu-nos ainda mais para compreender em maior detalhe os mecanismos moleculares que regulam rearranjo de tecidos. Aqui, nós fornecemos uma descrição abrangente de um método simples para alcançar este objectivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: As moscas transgénicas usadas neste estudo incluem as seguintes: DE-CAD :: GFP 10.
1. Preparação da Apple Placa
- Prepara-se uma mistura de 12,5 g de agar, 125 mL de 100% disponível comercialmente sumo de maçã, 12,5 g de glucose, e 375 mL de H 2 O. Aquecer a mistura em um forno de microondas e coloque em uma placa de cultura de células a 3 cm. Armazenar a mistura a 4 ° C para uso futuro.
- Depois de preparar o prato de maçã, adicione uma camada fina de pasta de levedura amassado em cima dela para permitir que as moscas colocar ovos.
2. Embrião Elaboração e protocolo Imagens ao vivo
- Coloque cerca de 50 moscas (25 homens e 25 mulheres) em uma garrafa para acasalar e, posteriormente, põem ovos durante a noite em uma placa de maçã coberta em levedura amassado. Ajuste a placa do sumo de maçã na boca da garrafa. Mantenha o frasco de cabeça para baixo em uma incubadora. Enrole os frascos plásticos Stock Drosophila com folha de alumínio para solicitar the voa para pôr mais ovos.
- Na manhã seguinte, substituir a placa de suco de maçã velha por uma nova.
- Deixe que as moscas depositam ovos para 3 a 4 h envolvendo a garrafa com folha de alumínio.
- Três a quatro horas mais tarde, recolher os embriões em um coador de embrião a partir da placa de suco de maçã com uma escova ou algodão ruim e lavá-los com PBS. Lavar os embriões mais 2 a 3 vezes com PBS, em 12 poços de cultura de pratos.
- Dechorionate os embriões com 50% de branqueador durante 5 min em 12 poços de cultura de pratos.
- Seguindo o processo dechorionation, lavar os embriões mais 2 a 3 vezes com PBS.
- Transferir os embriões para uma placa de cultura de células de 3 cm, que inclua PBS e selecione o estágio 5 embriões sob o microscópio com base no nível de transparência nas suas fronteiras. Pipetar os embriões em estágios usando uma ponteira 200 mL.
- Em seguida, coloque dois embriões selecionados em uma lamela de vidro, e remover o excesso de PBS com papel de tecido fino torcido. Orientar os embriões lado dorsal em cimaa lamela usando um lenço de papel fino torcido. Depois disso, coloque os embriões para a lamela de vidro com graxa de silicone usando uma agulha fina e papel de tecido trançado.
- Adicionar uma pequena gota de óleo de hidrocarbonetos halogenados 700 sobre os embriões e colocar a lamela contendo os embriões de cabeça para baixo sobre a corrediça recuada, deixando um espaço na parte inferior da corrediça.
- Examinar os embriões usando um sistema confocal de imagem, um 488 de laser / Argon, e um objetivo de imersão em óleo (63X).
NOTA: A identificação do embrião no estágio de desenvolvimento adequada é importante para capturar imagens do evento gastrulação. Sob essas condições, observar quase todos os embriões se desenvolvem normalmente até, pelo menos, estágio 14. O embrião analisados podem ser cultivadas ainda mais para se desenvolver como um adulto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aqui, vamos mostrar os eventos gastrulação do embrião Drosophila e uma visão geral do processo de preparação do embrião (Figura 1). As membranas celulares são marcados utilizando DE-caderina :: GFP e imagem ao vivo dos movimentos de células é realizada no momento da gastrulação em Drosophila (Figura 2). Desde moscas DE-caderina GFP permitem visualizar junções de aderência celular, somos capazes de traçar a forma da célula apical e movimentos usando este sistema. Mais importante, este sistema também nos permite traçar padrões de expressão DE-caderina endógenos.
Figura 1: Visão Geral do embrião Preparação Processo. A) Configure moscas para a postura de ovos. B) Coletar embriões e colocá-los em um coador de embrião. C) Depois de lavageming os embriões com PBS, dechorionate-los imediatamente. D) transferir os embriões para um prato de cultura de células a 3 cm, usando PBS. E) Pipet os embriões que estão no estágio de desenvolvimento correcto e colocá-los em uma lamela. F) Coloque os embriões para a lamela utilizando graxa de vácuo. G) Em seguida, adicione uma gota de óleo de halocarbonos na lamela. H) Finalmente colocar a lamela de cabeça para baixo no slide recuado. Os embriões estão agora prontos para geração de imagens de lapso de tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O resultado de um procedimento experimental utilizando DE-cad :: baseada GFP imagens ao vivo Durante gastrulação. As membranas celulares foram marcadas utilizando DE-caderina ::GFP e imagens ao vivo do movimento celular foi então capturado por aproximadamente 500 s durante a gastrulação de Drosophila. perímetros de células apicais foram visualizados utilizando a fluorescência da GFP de DE-Cad, a fim de traçar as áreas apicais de células individuais usando um conjunto representativo de imagens de lapso de tempo; Barra de escala = 20 mm. As setas mostram onde ocorrem a constrição apical e invaginação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
