机械应力可诱导干细胞的软骨向分化，为受损软骨的修复提供了一种潜在的治疗策略。本文介绍了一种利用离心重力（CG）诱导脂肪来源干细胞（ASCs）向软骨细胞分化的实验方案。由离心重力诱导的SOX9表达上调可促进软骨向表型的形成。
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摘要
摘要
受损的软骨无法自然愈合。目前，治疗软骨缺损最先进的疗法是利用细胞因子诱导干细胞分化为软骨细胞，再进行软骨细胞移植。然而，细胞因子诱导的软骨向分化成本高、耗时长，且在分化过程中存在较高的污染风险 体外 分化。然而，生物力学刺激也是软骨生成的关键调控因素。例如，机械应力可诱导干细胞向软骨细胞分化，提示其在受损软骨修复中具有潜在治疗价值。本研究中，我们证明离心重力（CG，2,400 × g）——一种通过离心易于施加的机械应力——可上调脂肪源性干细胞（ASCs）中性别决定区Y框蛋白9（SRY-box 9, SOX9）的表达，从而促使这些细胞呈现软骨细胞表型。经离心处理的ASCs表现出更高的软骨分化标志物表达水平，如聚集蛋白聚糖（aggrecan, ACAN）、II型胶原α1链（collagen type 2 alpha 1, COL2A1）和I型胶原（collagen type 1, COL1），而X型胶原（collagen type 10, COL10）——肥大软骨细胞的标志物——的表达水平则较低。此外，在经离心处理的ASCs中观察到软骨细胞聚集体的形成，这是软骨生成的前提条件。
引言
关节软骨缺损无法自然愈合。因此，干细胞移植被认为是一种具有前景的修复受损软骨的方法。然而，该方法需要获取足够数量的干细胞，并诱导这些细胞进行软骨形成分化。骨髓（BM）已被广泛用作干细胞来源，但从骨髓中分离细胞存在两个主要缺点：侵入性强且产量不足。由于脂肪组织易于获取，因此是更理想的干细胞来源。先前的研究已证明，可以从脂肪组织中分离干细胞，并使用细胞因子（如TGF-β11,2）诱导这些细胞发生软骨形成分化。这些方法虽然有效，但成本较高。
与细胞因子相比，机械应力是一种成本较低的诱导软骨分化的方法。机械负荷在维持关节软骨健康方面起着关键作用3，并可在多种细胞中诱导软骨细胞表型。例如，静水压可通过MAP激酶/JNK通路诱导滑膜来源祖细胞产生软骨细胞表型4，而机械压缩可通过上调软骨细胞基因在人源间充质干细胞（MSCs）中诱导软骨形成5。此外，剪切应力有助于促进人源间充质干细胞中与软骨形成相关的细胞外基质（ECM）的表达6。离心重力（CG）是一种通过离心产生的易于施加和控制的机械应力，可诱导细胞中差异性基因表达7。例如，在肺上皮癌细胞....
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方案
本研究方案经韩国天主教大学机构审查委员会批准（KC16EAME0162），并依照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行。所有组织均在获得书面知情同意后获取。
1. 离心重力加载与团块培养
- 细胞培养与收获
- 将ASCs（P2-P3；参见材料列表）在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的低糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-LG）中，于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中进行培养。
- 当细胞达到80%融合度时，弃去培养基，并用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
- 加入1 mL含1 mM EDTA的PBS，于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育2分钟。
- 轻轻敲击培养板，加入4 mL新鲜培养基，将细胞转移至15 mL锥形管中，并在室温（RT）下以250 × g离心2分钟。
- 离心重力加载
- 离心后（步骤1.1.4），小心弃去上清液，避免扰动沉淀，将沉淀重悬于10 mL含10% FBS的DMEM-LG中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 进行CG加载时，将2.5 × 105个细胞转移至新的15 mL锥形管中，并在2,400 × g下离心15分钟。
....
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结果
离心重力可诱导脂肪源性干细胞中软骨细胞分化标志物的过表达。
为了确定适合诱导软骨向分化的离心重力大小，使用不同强度的离心重力（0、300、600、1,200 和 2,400 × g）对ASCs刺激15分钟。刺激后，将ASCs重新接种至培养板中，并继续培养24小时。如图1A所示，在2,400 × g条件下，SOX9 mRNA的表达显著升高，约为未施加离心重力（对照组ASCs）的1.5倍。为确认离心重力是否可诱导软骨向分化，我们分别采用离心重力加载或TGF-β1处理对ASCs进行刺激。作为阴性对照，ASCs在无任何刺激条件下培养。在第14天收集样本并进行qRT-PCR分析。如图1所示，COL2A1 mRNA（一种典型的软骨向分化标志物）在经离心重力刺激的ASCs中表达上调，高于对照细胞（未刺激的ASCs）。离心重力刺激引起的COL2A1 mRNA上调水平.......
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讨论
细胞的干性状态对于CG诱导SOX9过表达至关重要。在本研究中，CG可在早期传代的ASCs（第2-3代）中诱导SOX9表达，但在后期传代的ASCs中则不能。已有报道指出，在培养过程中，ASCs中的CD34+细胞可维持至第3代16。随着传代次数增加，ASCs倾向于失去CD34的表达，从而导致对CG的反应性降低。
利用离心重力，可在离心重力（CG）刺激期间将流体静压力施加于细胞。因此，培养基的体积可能是影响 SOX9 诱导的因素之一。为了在每次实验中保持均匀的流体静压力环境，每 1 × 105 个细胞在 15 mL 离心管中使用 1 mL 培养基。此外，使用摆桶式转子以对细胞均匀施加 CG（通过形成直角）。
与TGF-β1相比，CG在诱导ASCs中SOX9及软骨形成标志物表达方面能力较弱。这可能是该技术的一项局限性。在临床应用方面，尚需进一步研究CG刺激的ASCs是否能够将受损软骨修复至正常功能水平 体内 模型
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披露
我们声明，本研究工作不存在任何利益冲突。
致谢
本研究由韩国卫生科技研发计划资助&通过韩国保健产业振兴院（KHIDI）由保健福祉部资助的D项目 & 韩国福祉部（资助编号：HI14C2116）以及韩国天主教大学首尔圣玛丽医院研究基金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 塑料器皿 | |||
| 100 mm 培养皿 | TPP | 93100 | |
| 60 mm 培养皿 | TPP | 93060 | |
| 50 mL 离心管 | SPL | 50050 | |
| 15 mL 离心管 | SPL | 50015 | |
| 10 mL 一次性移液管 | Falcon | 7551 | |
| 5 mL 一次性移液管 | Falcon | 7543 | |
| ASC 培养基材料 | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM 低糖 | Life Technologies | 11885-084 | 生长基础培养基 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| 软骨分化培养基材料 | |||
| DMEM 高糖 | Life Technologies | 11995 | 软骨分化基础培养基 |
| MEM 非必需氨基酸溶液 (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 地塞米松 | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | P4333 | 1% |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| 抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-脯氨酸 | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| 人 TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| 材料 | |||
| 18 mm 盖玻片 | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% 多聚甲醛 | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| 吐温 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| 牛血清白蛋白 | Vector Lab | SP-5050 | |
| 抗胶原 II 抗体 | abcam | ab34712 | 1:100 |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 594 标记 | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36934 | |
| 载玻片，涂层 | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| 氯仿 | Sigma Aldrich | 366919 | |
| 异丙醇 | Millipore | 109634 | |
| 乙醇 | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒 | Thermo Scientific | K1622 | |
| i-Taq DNA 聚合酶 | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE 缓冲液 | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder 标记物 | Enzynomics | DM003 | |
| 人脂肪来源干细胞 (ASCs) | Catholic MASTER Cells |
参考文献
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al.
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