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Biology

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

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Langzeitstudie des Herzens bei Kleintieren trägt eine Vielzahl von menschlichen verwandte kardiovaskuläre Erkrankungen zu verstehen, wie Gen - 1,2 angeborener Herzfehler bezogen. In den vergangenen Jahrzehnten von verschiedenen Tiermodellen, wie Maus 3,4, Xenopus 5,6, Zebrabärbling 7,8, Vogel- 9 und Drosophila 10-16, wurden verwendet , das menschliche Herz-Entwicklung im Zusammenhang mit Forschung zu betreiben. Das Maus - Modell wurde in großem Umfang mit dem menschlichen Herzen 3,4 studieren normalen und abnormalen Herzentwicklung und Herzfehler Phänotypen aufgrund ihrer Ähnlichkeiten verwendet. Der Embryo Xenopus ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Herzentwicklung aufgrund seiner einfachen Handhabung und Teiltransparenz 5,6. Die Transparenz des Embryos und der frühen Larve des Zebrabärbling - Modell ermöglicht eine einfache optische Beobachtung der Herzentwicklung 7,8. Das aviäre Modell ist ein gemeinsames Thema Entwicklungsherz Studien because kann das Herz leicht , nachdem sie die Eischalen Entfernen zugegriffen werden und die morphologische Ähnlichkeit der aviären Herzen auf den Menschen 9. Das Drosophila - Modell hat einige einzigartige Eigenschaften , die es ideal für die Durchführung Längsschnittstudien des Herzens zu machen. Erstens ist das Herz Rohr Drosophila ~ 200 & mgr; m unterhalb der dorsalen Oberfläche, die Bequemlichkeit für den optischen Zugang und die Beobachtung des Herzens liefert. Zusätzlich sind viele molekulare Mechanismen und genetischen Pfade zwischen Drosophila und Wirbeltieren konserviert. Die Orthologe von über 75% der menschlichen Krankheitsgene wurden in Drosophila gefunden , die es weithin 11,13 in transgenen Studien gemacht. Darüber hinaus hat sie eine kurze Lebensdauer und geringe Wartungskosten und 14-16 für Entwicklungsbiologie Forschung häufig verwendet als Mustermodell wurde.

In früheren Berichten beschrieben , die Protokolle zur Überwachung Drosophila Herzfunktionen wie erArtbeat. Jedoch wurden Verfahren Dissektion erforderlich 17,18. Optisches Abbildungs ​​bietet einen effektiven Weg Herzentwicklung bei Tieren aufgrund seiner nicht-invasive Natur zu visualisieren. Unterschiedliche optische Bildgebungsverfahren wurden bei der Durchführung von Tierherzstudie, wie Zwei-Photonen - Mikroskopie 19, konfokale Mikroskopie 20,21, Lichtbogenmikroskopie 22 und die optische Kohärenztomographie (OCT) 16,23-26 angewendet. Vergleichsweise ist Oktober der Lage große Bildtiefe in Kleintierherzen Bereitstellung ohne Kontrastmittel verwendet werden, während eine hohe Auflösung und das einen extrem hohen Bildgebungsgeschwindigkeit zu halten, die für die Bildgebung wichtig sind lebende Tiere. Darüber hinaus hat die niedrige Kosten ein OCT-System für die Entwicklung dieser Technik zur optischen Abbildung von Proben populär. Oktober wurde für die Langzeitstudie von Drosophila erfolgreich eingesetzt. Unter Verwendung Oktober hat Herz-morphologische und funktionelle Bildgebung der Herzstrukturen zu studieren, die Func ausgeführt worden isttionale Rollen von Genen, und die Mechanismen kardiovaskulärer Defekte in mutant Modelle während der Herzentwicklung. Zum Beispiel altersabhängige Abnahme der Herzfunktion wurde mit herunterreguliert Angiotensin-Converting - Enzym-bezogenen (ACER) Gen in Drosophila mit 27. Oktober bestätigt. Phänotypisierung von Gen im Zusammenhang mit Kardiomyopathie wurde in Drosophila mit Oktober 28-33 demonstriert. Forschung unter Verwendung von Oktober zeigte auch die funktionelle Rolle des menschlichen SOX5 Gen im Herzen von Drosophila 34. Im Vergleich zu Oktober verwendet OCM ein Objektiv mit einer höheren numerischen Apertur bessere Quer Auflösung bereitzustellen. In der Vergangenheit führte die Fehlfunktion des Herzens durch ein Ortholog menschlichen zirkadianen Gen dCry / dclock Silencing wurde mit einem benutzerdefinierten OCM - System 15,16 studierte, sowie den Effekt der fett-Diät auf Kardiomyopathien in Drosophila Fettleibigkeit induzierten Mensch zu verstehen Herzerkrankungen. 15

Hier the experimentelle Protokoll wird auf den zweiten Häutungsstadium (L2), dritten Häutungsstadium (L3), puppen Tag 1 (PD1), puppen Tag 2 (PD2), puppen Tag 3 (PD3) für Langzeitstudie der Herz morphologische und funktionelle Veränderungen in Drosophila zusammengefasst , Puppe Tag 4 (PD4), Puppe Tag 5 (PD5) und Erwachsenen (Abbildung 1) mit OCM Untersuchung der menschlichen bezogenen kongenitalen Herzerkrankungen zu erleichtern. Herzfunktionsparameter, wie HR und GAP wurden in verschiedenen Entwicklungsstadien quantitativ analysiert, um die Herzentwicklung Merkmale offenbaren.

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Protocol

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1. Herstellung von OCM - System für die optische Bildgebung von Drosophila 16

  1. Wählen Sie ein Spektrometer und ein Hochgeschwindigkeits - Zeilenkamera , die eine Bildrate von mindestens 80 Bilder / s bereitstellt , so wird das OCM System in der Lage sein , den Herzschlag von Drosophila zu lösen.
  2. Verwenden , um eine Breitbandlichtquelle , die axiale Auflösung von 2 & mgr; m , um sicherzustellen , das Herz Struktur Drosophila zu identifizieren.
  3. Verwenden Sie ein 10X-Objektiv eine hohe Quer Auflösung zu erhalten.
  4. Verwenden Sie einen 45 ° Stabspiegel des Referenzarmes Lichtstrahl zu reflektieren und einen ringförmigen Probenarm Lichtstrahl zu erzeugen, um die Tiefenschärfe in den Proben zu verlängern.
  5. Entwickeln Sie eine benutzerdefinierte Computerprogramm das OCM-System zur Steuerung und Messungen durchführen.

2. Drosophila Kultur

  1. Standard - Fly Essenszubereitung
    1. Setzen Sie ~ 5 ml Instant Drosophila Formel in eine Polystyrol FläschchenRohr mit Hilfe eines Papierschacht ein.
    2. Gießen ~ 8 ml Wasser in die Formel richtig die Nahrung sättigen.
    3. In verschiedenen Ergänzungen zur Standardfliegenfutter für verschiedene Experimente. Wenn für all - trans - Retinal (ATR) Nahrung für die optogenetische Vorbereitung Experiment Stimulation 35, verwenden Sie eine Pipette 100 mM ATR zu extrahieren und in ~ 8 ml Wasser auflösen , um die ATR - Konzentration von 1 mM in Essen. Nachdem die Lösung gleichmäßig mischen, gießen Sie die Lösung in die Formel und rühren Sie es ausreichend.
    4. Eine fettreiche Diät-für die Untersuchung im Zusammenhang mit Fettleibigkeit Herzstörungen in Drosophila, 10,15 Mix ~ 10 ml Formel mit 15 ml Wasser in eine Tasse und Hitze für 30 Sekunden in der Mikrowelle zuzubereiten. Setzen Sie etwas kaltgepresstes Bio-Kokosöl in einem anderen Becher und erhitzen Sie es für 90 Sekunden in der Mikrowelle.
    5. Extrakt 7,5 ml Kokosöl und mischen sich mit dem vorbereiteten Formel ausreichend, das Gewicht / Volumen-Verhältnis von Kokosöl zu Nahrungsmitteln zu machen ~ 30/100 und then-Extrakt ~ 2 ml gemischt Lebensmittel und legte es aus einem Rohr nach unten.
    6. Warten Sie 1 Minute, bis das Medium gründlich gesättigt ist. Komprimieren Sie die Lebensmittel sorgfältig mit einer flachen Oberfläche , die Lebensbedingungen für die Drosophila zu optimieren. In 6 - 8 Körner von Hefe auf die vorbereitete Formel, und schließen Sie das Rohr mit einem Cluster von Baumwolle.
  2. Fruchtfliegen - Kreuze und Kultur
    1. Nehmen Sie einen Schlauch mit vorbereiteten Standard-Fliegen Essen, und entfernen Sie die eingesteckt Baumwolle. übertragen Sie vorsichtig die erwachsenen Fliegen (männlich und weiblich) mit dem Rohr, und stecken Sie sofort das Rohr mit Baumwolle. Überprüfen Sie die Baumwolle, um sicherzustellen, dass es keine Lücke zwischen der Baumwolle und der Rohrwand zu verhindern Fliegen aus aus dem Rohr austritt.
    2. Halten Sie die Fruchtfliegen im Inkubator bei 25 ° C für Einkreuzungen. Die meisten der Gene aktiv sind und die zellulären Proteine werden bei 25 ° C 36-39 synthetisiert.
    3. Nehmen Sie den Schlauch aus dem Inkubator aus nach 8 Hand Übertragung der eindult fliegt aus der Röhre, die Eier in ähnlichem Alter für experimentelle Kontrolle zu erhalten.
    4. Weiterhin die Eier Kultivierung im Brutschrank bei 25 ° C, die für Drosophila - Entwicklung mit der Entwicklungszeit 8,5 Tage 40,41 der Standardtemperatur ist.
      HINWEIS: Die Temperatur beeinflusst die Entwicklungszeit (Ei bis zum erwachsenen) und Expression von verschiedenen Genen.

3. Durchführung Optical Imaging mit OCM

  1. Berg Fly Larve für Optical Imaging
    ANMERKUNG: Das Ei von Drosophila Schraffuren in 22 bis 24 Stunden bei 25 ° C zu der ersten instar Larven (L1). Die zweite Larvenstadium tritt nach weiteren 24 Stunden. Die größte Larvenform ist das dritte Larvenstadium, die nach etwa 24 Stunden häutet. Strukturmerkmale in Larve kann verwendet werden, um ihre verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden. Die Größe der Mundwerkzeuge zwischen dem ersten und dem zweiten instar instar unterscheidet. Der MundHaken der ersten instar Larven sind sehr klein und sehen aus wie zwei Paare von winzigen schwarzen Punkten, während die Mundhaken des zweiten Larvenstadium sind größer und die Struktur ist klarer. Die Stigmen sind in der Regel verwendet, um die zweite instar und den dritten Häutungsstadium zu identifizieren. Die zweite Larvenstadium hat vorderen Stigmen geprügelt, während für das dritte Larvenstadium, die vorderen Stigmen verzweigt sind. Ein dunkelorange Ring beginnt an der Spitze der hinteren Stigmen im dritten Larvenstadium zu erscheinen.
    1. Tragen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband an einem sauberen Mikroskop Objektträger aus Glas. Vertreibt die Luftblasen unter dem Band die Reflexionen durch Luftblasen während der Bildgebung zu vermeiden.
    2. Nehmen Sie eine der Röhren mit den gezüchteten Fliegen aus dem Inkubator im Larvenstadium.
    3. Identifizieren Sie die Larve in den Medien, entfernen Sie sie aus den Medien mit einer weichen Bürste und auf einem sauberen Tuch. Entfernen Sie alle an die Larve stecken Essen mit einem feuchten weichen Bürste und trocknen Sie sie auf das Gewebe.
    4. Bewegen Sie den cleaneauf ein Gewebe unter der Objektivlinse eines Weitfeld-Mikroskop d fliegen.
    5. Stellen Sie den Fokus des Mikroskops eine klare Sicht auf die Fliege zu finden. Identifizieren Sie die richtigen Entwicklungsstadium der Larve durch seine strukturellen Eigenschaften mit dem Mikroskop.
    6. Positionieren Sie die Fliege den weichen Bürste. Sicherstellen, dass der Körper gerade mit der Rückenseite nach oben weist zur Montage auf dem Glasobjektträger von der dorsalen Seite vorzubereiten. Führen Sie diesen Schritt unter dem Mikroskop.
    7. Achten Sie darauf, die Larve vor der Montage auf dem Band vollständig trocken ist. Andernfalls wird die Larve nicht auf dem Band haften.
    8. Kleben Sie die Rückenseite des positionierten Fliege zum doppelseitigen Klebeband auf dem Glasträger mit mäßigem Druck. Beachten Sie, dass zu viel Druck kann die Fliege und zu wenig Kraft zu töten führen Bewegung während der Bildgebung zu fliegen.
  2. Optical Imaging von Drosophila an Larvalstadien (L2 und L3) mit OCM
    HINWEIS: Eine breite Lumen des Herzens Rohr fo sein kannund befindet sich in den Segmenten zwischen A5 bis A8 in den Larvenstadien (Abbildung 1). Die Quer OCM M-Modus-Bilder (2D + Zeit) wurden für jede Larve im A7 Segment des Herzrohr erfasst den systolischen und diastolischen Analyse zu erleichtern.
    1. Platzieren Sie die montierte Larve auf die einstellbare Probenstufe des OCM System entlang der Y-Querrichtung mit der Rückenseite nach oben weisend unterhalb der Objektivlinse. Ein kleines Loch in der Probentisch ist zum Platzieren der Larve notwendig sein Kontakt mit der Tischebene zu vermeiden.
    2. Stellen Sie den Probentisch das Herz Rohr der Fruchtfliege zu der Brennebene des Abbildungsstrahls zu bewegen. Um bequem die A7-Segment zu finden, finden Sie den hinteren Bereich des Herzens Rohr mit dem Echtzeit-Querschnitts OCM Bilder in der Bilderfassungssoftware. Dann bewegen uns auf die Bühne, bis die A7 Segment sichtbar ist.
    3. Die Parameter der Bildaufnahme-Software auf 100 A-Scans pro B-Scan (Rahmen), 100 B-Scans und die scanner Spannung zu bedecken ~ 0,28 mm in der x-Querrichtung, und 0 V in der Y-Querrichtung. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" in der Software, um die Hintergrundrauschen Daten für Untergrundsubtraktion zu erwerben, indem die Probe Strahlengang mit einem dunklen Tuch blockiert.
      HINWEIS: 3 der 100 Rahmen für den Hintergrundabzug verwendet werden.
    4. Set Parameter der Datenerfassungs-Software zu 128 A-Scans pro B-Scan, 4096 B-Scans und der Scannerspannung abzudecken ~ 0,28 mm in der x-Querrichtung, und 0 V in der Y-Querrichtung. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" in der Software , die Quer M-Modus Bilder über das A7 - Segment des Fliegenherzrohr über einen Bereich zu erwerben Abdeckung 0,28 x 0,57 mm 2 für etwa 30 Sekunden.
    5. Blockieren Sie den Abbildungsstrahl ein dunkles Tuch während der Datenspeichervorgang mit längerer Einwirkung der Fliege Herz dem Abbildungslicht zu vermeiden.
    6. Wiederholen Sie die Messung für 5 mal zuverlässige Messung der Herz Spaß zu bekommenction.
    7. Set Parameter der Bildaufnahme-Software zu 400 A-Scans pro B-scan, 800 B-Scans und der Scannerspannung abzudecken ~ 1,7 mm in der x-Querrichtung, und ~ 4 mm in der Y-Querrichtung. Bewegen Sie die Bühne in beiden Richtungen die ganze Fruchtfliege, um sicherzustellen, können abgebildet werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" in der Software einen Datensatz zu erwerben Bilder von der Fruchtfliege in 3 Dimensionen zu erhalten. Hinweis: Die 3D-Struktur fliegen kann gemacht werden mit Amira 3D-Software
    8. Verwenden Sie einen feuchten weichen Bürste die gemessene Fliege zu befeuchten und vorsichtig aus dem Glasobjektträger zu entfernen. Bewegen Sie es in ein separates Rohr für die kontinuierliche Entwicklung. Das Röhrchen für Langzeitstudie über die nächsten Entwicklungsstufen.
  3. Bild Drosophila bei Puppenstadien
    HINWEIS: Alle Fruchtfliegen wurden für die Bildgebung von PD1 bis PD5 entnommen. Wie in der schematischen Larve in 1b gezeigt ist , verbleibt ein breites Lumen in A5 bis A8 Segmenten the Herz Rohr bis PD1. Von PD2, beginnt eine konische Kammer zwischen A1 bis A4 Segmente zu entwickeln. Um konsistente Bilder erwerben und Herzanalyse, quer M-Modus - Bilder wurden von der A7 Segment PD1 erhalten und von der A1 - Segment nach PD2 wie gekennzeichnet in 1b erleichtern.
    1. Bild Drosophila bei PD1
      HINWEIS: Drosophila wird eine weiße Puparium für eine kurze Zeitfenster haben ( das 0 - 1 h) während PD1. Dieses Zeitfenster ist ideal für die optische Abbildung des frühen pupa Durchführung, da die hohe Transparenz zu einer höheren Lichteinfall für die OCM-Bildgebung führt.
      1. Da die Fruchtfliegen an der Rohrwand gefunden werden, wenn sie Puppe geworden, mit einem feuchten weichen Bürste, die Puppe aus einzelnen Rohren für die Bildgebung bei PD1 entfernen und die Puppe mit der Bürste reinigen, wenn es Nahrung für den Körper geklebt ist.
      2. Montieren Sie die Fruchtfliege auf einem kleinen Glasobjektträger direkt mit dem nassen Pinsel und halten Sie die Rückenseite nach oben zeigt (Abbildung 1a
      3. Überschüssiges Wasser von der Seite des Flugkörpers.
      4. Setzen Sie den Glasobjektträger auf der Probenbühne des OCM-System, halten die Fruchtfliege an der Spitze. Finden klare Echtzeit-Bild des A7 Segment der Fliege Herz die gleiche Strategie in der Larve Messung beschrieben verwendet.
      5. Stellen Sie die gleichen Parameter der Datenerfassungs-Software, wie in Abschnitt 3.2 und Bild die Herzschläge an der A7 Segment quer M-Modus und 3D-Bilder zu erwerben.
      6. Nach der Bebilderung verwenden eine Pinzette die Glasobjektträger mit Puppe zu legen zurück in das Rohr für die kontinuierliche Kultur.
    2. Bild Drosophila bei PD2 bis PD5 Stages
      HINWEIS: Da die Probe mehr und mehr opak während der Puppenstadien wird, wird die Eindringtiefe des Abbildungssystems reduziert.
      1. Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig das Glas s entfernenLiDE montiert mit der Fliege an PD2 aus der Tube für die Bildgebung. Bei PD2, wird die Probenschale gelblich und der Körper wird weniger transparent gegenüber PD1 (Abbildung 1).
      2. Setzen Sie den Schieber auf der Probenbühne des OCM-System.
      3. Stellen Sie die Probenbühne die Fliege in der Brennebene des Abbildungsstrahlen des OCM-System zu bewegen. Finden Sie das vordere Ende des Herzschlauches mit Echtzeit-Querschnitts OCM Bild. Bewegen Sie ~ 50 & mgr; m zurück in die hintere Richtung der A1-Segment des Herzschlauches zu finden.
        HINWEIS: An diesem Punkt der Herzentwicklung (PD2), wird die konische Kammer sehr klein sein und nicht zu schlagen sein.
      4. Sammeln Quer M-Modus-Datensätze aus dem A1-Segment als auch 3D-Daten der gleichen Methode wie in früheren Entwicklungsstufen verwendet wird.
      5. Setzen Sie den Schlitten zurück in die Röhre vorsichtig für eine kontinuierliche Kultur.
        HINWEIS: Bei PD3, die Farbe der Probe in der Schale ist dunkler als die bei PD2 Stufe. Bei PD4 Bühne, ca schwarzen Streifenn innerhalb der Schale der Proben beobachtet werden. Einige Fliegen entwickeln in Erwachsenen aus dieser Phase in den nächsten Tag, während andere in PD5 entwickeln wird. Bei PD5 Stadium sind schwarze Streifen noch offensichtlich in den Fruchtfliegen gesehen. Diese Fliegen werden Erwachsene in den nächsten Tag werden.
  4. Bild Drosophila an der Volksbühnen
    HINWEIS: Bei adulten Stadium, weibliche und männliche Fliegen können durch die Größe des Körpers und der Farbe des Unterleibs zu unterscheiden. Weibliche Erwachsene haben größere Größe, während die Männchen sind kleiner und dunkel gefärbten in den Unterleib.
    1. Nehmen Sie den Schlauch aus dem Inkubator, wenn die Fruchtfliege in einen Erwachsenen entwickelt und übertragen die Erwachsenen zu einer ~ 45 ml Fläschchen leer fliegen.
    2. Tauchen Sie das saugfähige Ende (ca. 1 cm Länge, ca. 3 mm Durchmesser) eines Zauberstab in die Anästhesie, legte den Stab in das Fläschchen, und stecken Sie das Rohr mit einem Cluster von Baumwolle das Anästhetikum Ende zu halten, knapp unterhalb der gesteckten Baumwolle und anesthetize die Fliege für 3 min. Die Dauer der Anästhesie hängt von der Größe der Fliege, und kann zwischen 2,5 bis 3,5 min variieren (zum Beispiel: männlich für 2,5 min, weiblich für 3 oder 3,5 min).
    3. Vorbereiten eines Glasobjektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband.
    4. Bewegen Sie den narkotisierten Fliege auf dem Glasobjektträger mit Rückenseite nach oben zeigt die weichen Bürste.
    5. Trennen Sie die Flügel eine Pinzette mit und halten die Flügel auf dem Band unter dem Mikroskop die Fliege zu fixieren und den Herzbereich für die Bildgebung aus.
    6. Bild die Fliege von der A1 - Segment der Fliege Herz (Abbildung 1). Am Ende des Experiments kann die fly geopfert werden.

4. Imaging - Analyse 16

  1. Entwickeln Sie Matlab-Programme, die 2D- und 3D-Binär-Dateien mit dem Bildaufnahme-Software zur Bilddateien gesammelt zu konvertieren.
  2. Verwenden Sie ImageJ das Herz Rohrbereich in den Quer M-Modus-Bilder und einen Zauberstab Algorithmus zur Identifizierung createa Maske des Herzbereich für jeden Quer M-Modus-Bild. Segment den maskierten Bereich und mit einem Spitzenfindungsalgorithmus die systolischen und diastolischen Stellen zu identifizieren. Berechnen Sie die zeitabhängigen Herzdurchmesseränderungen von den Quer M-Modus-Bilder.
  3. Basierend auf den erfassten zeitabhängigen Herz Durchmesser, berechnen die Herzparameter wie HR, Herzaktivitätsperiode (CAP), Ende der Diastole Durchmesser (EDD), Ende der Systole Durchmesser (ESD), Ende der Diastole Bereich (EDA) und Systole Bereich Ende ( ESA). Berechnen Sie die fraktionelle Verkürzung (FS) mit Gleichung 1
  4. Verwenden Sie ImageJ die 3D-OCM Bilder zu analysieren, um die strukturelle Entwicklung der Fliege Herz zu visualisieren.

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Representative Results

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Die Längsherzbildgebung wurde mit dem 24B-GAL4 / + Dehnung bei Raumtemperatur mit OCM mit den Fruchtfliegen durchgeführt. Messungen wurden bei L2, L3, und bei 8 Stunden Intervallen von PD1 bis PD4 und Erwachsenen Tag 1 durchgeführt (AD1) die Metamorphose - Verfahren (Tabelle 1) zu verfolgen. Larve, früh puppen, späte Puppe und erwachsenen Fliegen wurden auf den Glasobjektträger aufgebracht , wie in 1A gesehen. Die Segmentmerkmale des Herzens für Larven und erwachsenen Fliegen wurden in den schematischen Darstellungen in 1B gezeigt.

In dieser Entwicklungsstudie, 4.096 Frames wurden in 32 sec mit unseren kundenspezifischen OCM-System zu verfolgen, den Herzschlag einer Fruchtfliege erworben. Zur Verbesserung der Messgenauigkeit, fünf wiederholten Messungen wurden für jede Probe in jeder Entwicklungsstufe genommen. 3D-Daten können auch die Herzstrukturänderungen während der Metamorphose zu beobachten, erhalten werden.

Quer M-Modus und 3D-Bilder waren c reated mit benutzerdefinierten Matlab-Programme und ImageJ. En face Bilder und axiale Abschnitte wurden auch aus den gewonnenen Daten konstruiert , um den Umbauprozess des Herzens während der Drosophila - Metamorphose (Abbildung 2) zu visualisieren. Um die Herzfunktion von Fruchtfliegen zu quantifizieren, wurde die Herzregion automatisch segmentiert aus allen 4096 Rahmen eines benutzerdefinierten Matlab-Programm. Die Fliege Herzfrequenz (HR) aus den M-Modus OCM Bilder (Abbildung 3a) quer quantifiziert werden. Während Puppenstadien, hört auf zu schlagen die Drosophila Herz gelegentlich 16. Wir führten ein neues Herzfunktionsparameter, Herzaktivitätsperiode (CAP) , um das Verhältnis der Periode mit einem Herzschlag auf die Gesamtaufnahmezeit (Abbildung 3b) zu quantifizieren. EDD, ESD, EDA, ESA und FS wurden auch die Herzkammer Veränderungen in beiden axialen und Querabmessungen während der Drosophila - Entwicklung zu quantifizieren. 16

content "> At Larvenstadien beginnt die Herzrohr am hinteren Bauchbereich A8 mit einem breiteren Lumen (A5 - A8 in 1B) und endet an der vorderen dorsalen Segment A1 mit engerem Durchmesser (T3 / A1 - A5 in 1B ). die Kammer Herzen gelegen war medial und dorsal und wuchs während L2 (Bild vergrößern 2 a, b) und L3 (Abbildung 2 c, d). Nach PD1 Eingabe wurde das Herz Rohr beobachtet in axialer Richtung über die Spitze eines sich bewegenden Luft läuft Blase (Abbildung 2 e, f) Etwa 10 -. 13 Stunden später verschwand die Blase nach Pupariumbildung und die breiten Lumen wurde umgestülpt Da das vordere Herzrohr ventral gelegen war, das ganze Herz Rohr unsichtbar war außer der hinteren Region in der. . OCM Bilder ~ 12 Stunden nach Pupariumbildung Später während PD2, die Herzkammer entlang der dorsalen Abdomen und der hintere Teil (A6 - A8) sukzessive ausgerichtet des Herzens wurde eliminiert (Abbildung 2 g, h) 42,43. Eine konische Kammer begann ~ A1 zu entwickeln - A4 - Segment während PD2 und wuchs in der Größe bis zum Erwachsenenstadium (Abbildung 2 i - m).

Neben Beobachtung struktureller Veränderungen wurden viele funktionelle Veränderungen auch bei kardialen Remodeling gefunden. Der M-Modus - Bilder in Abbildung 3 zeigen , daß der Herzschlag signifikant von der Larve zur Verpuppung verlangsamt, und dann erhöht sich wesentlich von Puppe zu Erwachsenen. Signifikante HR Veränderungen wurden während des Lebenszyklus (Abbildung 4a) beobachtet. Weiterhin wurde die Herzaktivitätsperiode (CAP) für alle analysierten Proben gemessen von L2 zu AD1 (Abbildung 4b). Wie in Figur 4 gezeigt ist , hält HR bei ~ 277 Schlägen pro min (bpm) für L2 und L3. Nach den frühen Puppenstadien Eingabe gibt es eine deutliche Abnahme der HR und CAP. HR wird auf 86 ± 11 bpm zu Beginn PD1 reduziert und weiter auf 26 ± 8 bpm durch die e zu verringernnd von PD1 kommt schließlich zum Stillstand früh in PD2. Eine interessante Entdeckung ist die längere Zeit der Herz Inaktivität beobachtet rund PD2 Stufe (~ 24 h - 48 h nach Pupariumbildung), die als Herzentwicklungs diastalsis 16. Am Ende des PD2, langsam intermittierende Schläge fortgesetzt (HR 17 bpm ± 6 mit CAP 5 ± 2). Während PD3 und PD4, HR und CAP Anstieg bis zum Erreichen 392 ± 32 bpm und 95 ± 3% am ersten Tag der erwachsenen Stadium (5 Tage nach der Verpuppung beginnt).

Abbildung 1
Abbildung 1. Montage von Drosophila in verschiedenen Stadien und Schematische Darstellung des Herzens Metamorphose. (a) Montage der Larven, Puppen und Erwachsener WT (24B-GAL4 / +) fliegt auf Glasobjektträger. (b) Schematische Darstellung des Herzens Metamorphose. Rote Pfeile auf Larve und adulte schematibezeichnen c die OCM M-Mode-Bildgebung Stellen bis PD1 24 Stunden und für nachfolgende Zeitpunkte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Drosophila Herz Morphologische Veränderungen. En face und axiale Schnitt OCM Bilder eines WT Drosophila erhalten bei (a, b) L2 (c, d) L3 (e, f) PD1 (g, h) PD2 (i, l) PD4 und (k, m) für Erwachsene Stufen. M-Modus - Bilder des Drosophila Herzen wurden von der A7 Segment bis PD1 und von A1 - Segment für den späteren Stufen erhalten. Die Maßstabsbalken in en face und axiale Schnittbilder bezeichnen 200 & mgr; m und 500 & mgr; m, respectively. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Drosophila Herz Funktionsänderungen. (a) M-Modus - Bilder in verschiedenen Stadien der Entwicklungs HR Veränderungen in Lebenszyklus zeigt. (b) Beispiele Herzaktivitätsperiode (CAP) Berechnung zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Quantitative Analyse der funktionalen Herz Parameters in WT Fliegen in verschiedenen Entwicklungsstadien, einschließlich L2, L3, Pupal Stages in 8 Stunden Intervallen und AD1. (a) HR. (b) CAP. Die Fehlerbalken jeder Gruppe repräsentiert die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Entwicklungsstadium
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8 Stunden 16 Stunden 24 Stunden 32 h 40 Stunden 48 Stunden 56 h 64 h 72 Stunden 80 Stunden 88 h
Probennummer 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

Tabelle 1. Anzahl der WT Taufliegen bei verschiedenen Entwicklungsstadien in der Cardiac Entwicklungsstudie gemessen.

Video 1
Video 1. Verfolgung von Herzschlag Entlang zeitliche Dimension und entsprechende Herzkammer Durchmesser Änderung entlang der z - Richtung (axiale Richtung) in einem WT fliegen bei L2. Das Herz schlug relativ schnell mit einer konstanten Rate. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .) p>

Video 2
Video 2. Verfolgung von Herzschlag entlang zeitliche Dimension und entsprechende Herzkammer Durchmesser Änderung entlang der z - Richtung (axiale Richtung) in einem WT fliegen bei PD1. Die HR begann zu verringern. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)

Video 3
Video 3. Verfolgung von Herzschlag entlang zeitliche Dimension und entsprechende Herzkammer Durchmesser Änderung entlang der z - Richtung (axiale Richtung) in einem WT fliegen bei PD2. Das Herz vollständig gestoppt während der Zeit zu schlagen. Die Oszillation des aufgetragenen z-Durchmesser war aufgrund der Abbildungsrauschen. target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit.)

Video 4
Video 4. Verfolgung von Herzschlag entlang zeitliche Dimension und entsprechende Herzkammer Durchmesser Änderung entlang der z - Richtung (axiale Richtung) in einem WT fliegen bei PD4. Nach PD2 begann die HR und GAP zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)

Video 5
Video 5. Verfolgung von Herzschlag entlang zeitliche Dimension und entsprechende Herzkammer Durchmesser Änderung entlang der z - Richtung (axiale Richtung) in einem WT Fly bei AD1. Die HR war der höchste unter allen Phasen und CAP war fast 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download bereit.)

Video 6
Video 6. 3D - Struktur - Rendering eines Larven Fliege. Bitte klicken Sie hier , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)

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Discussion

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Die schnellen Herzschlag von Drosophila, mit einem Maximum HR rund 400 bpm bei Larven und adulte Stadien, erfordert eine hohe Abbildungsgeschwindigkeit der Herz Diastolen und Extrasystolen (nicht weniger als 80 Bilder / s auf den Erfahrungen basiert) zu lösen. Aufgrund der geringen Größe und Herzkammer micron Skala Herzwanddicke (von 5 bis 10 & mgr; m), eine hohe räumliche Auflösung (besser als 2 & mgr; m) wird zur Lösung der Herzrohrstrukturen erforderlich. In dieser Studie wurde eine hohe Auflösung und Ultraspeed-OCM-System entwickelt, in dem ein Spektrometer mit 600 Linien / mm Transmissionsgitter und ein 2.048-Pixel-Zeilenkamera verwendet wurden. Ein A-Abtastrate von 20 kHz wird durch die Zeilenkamera zur Verfügung gestellt. Die Bildrate von 128 Bildern / sec ist schnell genug , um den Herzschlag Drosophila an mehreren Entwicklungsstadien zu erfassen, einschließlich L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5 und Erwachsenen. Die Lichtquelle war eine große Bandbreite Superkontinuum-Lichtquelle mit einer zentralen Wellenlänge und Bandbreite von ~ 800 nm und ~220 nm bzw. und erhalten eine axiale Auflösung von ~ 1,3 um im Gewebe. Ein 10X-Objektiv wurde in der Probe Arm zu erkennen, eine Quer Auflösung von ~ 3,9 um verwendet. Da das Herz Rohr von Drosophila ca. 200 & mgr; m unterhalb der dorsalen Oberfläche ist, wird eine Bildtiefe von Hunderten von Mikrometern erforderlich. A 45 ° Stabspiegel kann eine ringförmige Probenstrahl und erstrecken sich die Tiefenschärfe in der Probe 44 zu erzeugen , verwendet werden. Die Empfindlichkeit und 3 dB Roll-off bestimmt 96 dB zu sein, und 600 & mgr; m, jeweils mit dem Probenarm Leistung von ~ 9 mW. Eine benutzerdefinierte Computerprogramm wurde verwendet, um die OCM-System zu steuern und die Messungen durchzuführen. Die Herz-Strukturbilder und Funktionsparameter erhalten demonstrieren die Machbarkeit OCM der Verwendung der Herz - Morphologie und Funktion von Drosophila während seines gesamten Lebenszyklus quantitativ zu charakterisieren.

Derzeit werden mehrere andere Techniken auch um ein kleines Bild verwendetTierherz Struktur oder Funktion, wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRI) und Ultraschall. OCM bietet eine höhere räumliche und zeitliche Auflösungen als dieser Techniken ermöglicht die Visualisierung von feinen Strukturen und schnelle Dynamik in Tierherzen. Die konfokale Mikroskopie ist eine andere weit verbreitete Imaging-Technik, aber seine geringe Abbildungs ​​Durchdringung und Anforderung von Imaging-Kontrastmittel begrenzen ihre Anwendungen in lebenden Tieren. Vergleichsweise ermöglicht OCM High-Speed-und markierungsfreie Bildgebung für eine schnelle Herzdynamik nicht-invasiv in kleinen Tieren zu visualisieren. Es gibt jedoch immer noch Beschränkungen OCM. Zum Beispiel wird die Abbildungstiefe von OCM bereitgestellt durch Lichtstreuung von einigen hundert Mikron bis etwa 1 mm in Gewebe begrenzt, während Ultraschall Eindringtiefen von bis zu 10 cm aufweist. Im Vergleich zu der konfokalen Mikroskopie, hat OCM eine höhere Geschwindigkeit und eine bessere Bildtiefe, aber mit geringerer Auflösung und schlechter molekularen Kontrast. Darüber hinaus ist unser aktuelles OCM System based auf Spectral-Domain-Detektionssysteme. Höhere Bildgebungsgeschwindigkeit basierend auf gepfeilten Quelle 45 OCM kann deutlichere Bilder der schnellen Dynamik wie der Herzschlag sorgen.

Längsschnittstudie des Herzschlags in Drosophila mit OCM, gibt es mehrere wichtige Schritte in dem Protokoll auszuführen. Die Fliegen muss in allen Phasen des Experiments sehr fein verarbeitet werden. Verwalten Larve sollte besonders schonend, da es einfach ist, die Larve zu beschädigen, die Herzstruktur und -funktion in den folgenden Entwicklungsstadien beeinflussen könnten. Die Fliegen muss sehr genau auf dem Abdeckglas und der Abbildungsstufe positioniert werden. Unzureichend positioniert Fliegen wird es schief strukturelle und funktionelle Qualität Bilder zu erfassen und kann Werte Herz Parameter verursachen schwierig machen. Zusätzlich Übertragen adulte Fliegen von einem Rohr zum anderen und die Wattebausch Verstopfen sollte sehr schnell sein, um ihr Entweichen aus dem Rohr zu verhindern.

Verschiedene Studien überDrosophila Herzentwicklung kann durch Modifizierung des Protokolls durchgeführt werden. Die Temperatur, bei der die Fliegen kultiviert werden, können von 25 ° C erhöht oder verringert werden, um die Herz-Genexpression Ebene zu ändern und die Zeit fliegen Entwicklung ändern. Durch die Zugabe können einige Bestandteile wie Kokos- oder ATR an die Standardnahrung, die Herzentwicklung verändert werden. Spezielle Untersuchungen können in Wildtyp oder transgenen Fliegen durchgeführt werden. Wenn Fruchtfliege Herz Erforschung der Entwicklung des longitudinal, unterschiedliche Zeitintervalle verwendet werden können, die OCM Messungen durchzuführen, könnte beispielsweise ein 8-Stunden-Intervall während der Puppenstadien verwendet werden. Aufgrund der begrenzten Empfindlichkeit unserer OCM Systems wird viel einheitlicher Speckle-Rauschen in den Quer M-Modus-Bilder gefunden, die es richtig schwierig machen kann zu Herzkontraktionssignale mit Matlab-Programme identifizieren und die Effizienz der Datenanalyse zu verringern. Die Empfindlichkeit kann durch eine Verbesserung der Ausrichtung des OCM Systems erhöht werden. Optimierte FilteralgorithmenEs wird empfohlen, einen Teil der Speckles zu entfernen.

Das beschriebene Protokoll wurde das Schweigen der menschlichen zirkadianen Orthologe dCry und dclock induzierte Herzfehler in Drosophila zu untersuchen angewendet. Verminderte HRs wurden in verschiedenen Entwicklungsstadien, einschließlich Larve, Puppe und Erwachsenen 15,16 beobachtet. Die Rolle der zirkadianen Gene in Herzentwicklung offenbart wurde, die den Zusammenhang zwischen Herz-Kreislauf-Erkrankungen und zirkadianen Rhythmus bezogenen Aktivitätsmuster können erklären. High-fat-Diät (HFD) induzierte Herzerkrankungen wurden auch durch die Analyse von Herz funktionelle Veränderungen der Fruchtfliegen gefüttert mit HFD 15 untersucht. Diese Studien zeigten , nicht nur Drosophila als ein mächtiges Werkzeug in der Entwicklungsstudie der Herzstruktur und Funktion, sondern auch die Bedeutung der Herz-Langzeitstudie zum Verständnis angeborene und postnatalen Krankheiten beim Menschen. Die OCM-Plattform wird ein breites Spektrum an zukünftigen Studien ermöglichen in Gen menschlichen Herzerkrankungen im Zusammenhang.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

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<em>Drosophila</em> Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion <em>in vivo</em> unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)
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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

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