Summary
Denne metoden benytter sebrafisk embryoer for effektivt å teste den vaskulære invasiv evne til kreftceller. Fluorescent kreftceller blir injisert i precardiac sinus eller plommesekken utviklings embryoer. Kreftcelle vaskulær invasjon og ekstravasering blir vurdert via fluorescens mikroskopi av halen området 24 til 96 timer senere.
Introduction
Metastatisk sykdom er en vesentlig årsak til kreft dødelighet og mange mekanismer som gjør kreftcelle formidling gjenstår å bli oppdaget en. For at en kreftcelle for å kunne spre, må det først invadere gjennom stroma som omgir en primærtumor, skriv (intravasate) i sirkulasjonssystemet, overleve i transitt, exit (ekstravasere) fra sirkulasjonen, og til slutt etablere en levedyktig koloni på den fjerne organ for 2.. Intravasation og bloduttredelse er dermed avgjørende skritt i metastatisk cascade, men hver kreftcelle er ikke iboende flinke til å forstyrre og migrere gjennom endothelial veikryss 3. Faktisk er det en rekke unike seleksjonstrykk som omgir kreftcelle vaskulær invasjon og fremgangsmåten kan videre påvirkes av en rekke endogene og eksogene fire faktorer. Av disse grunner teknikker som tester den aggressive oppførselen til avansert stadium kreften ofte fokus på vascular invasiv evne som et middel til å forutsi metastatisk spredning.
Ulike modellsystemer eksisterer for å legge til rette studiet av kreft celle vaskulær invasjon in vitro. Den mest benyttede in vitro-analyser innebære enten Transwell-systemer for å vurdere kreftcellemigrering gjennom en endotelial barriere 5 eller elektrisk celle-substrat Impedans Sensing (ECIS) teknologi for å overvåke i sanntid avbrudd av en intakt endotel-monolag av kreftceller 6. Disse analyser mangler vanligvis den væskedynamikk og stromale faktorer som ellers ville påvirke kreftcellebinding til en endotelial vegg. Dette problemet er noe omgått ved perfusable vaskulære nettverk som oppstår fra 3D-kulturen i endothelia med støtte stromale celler, og disse 3D microfluidic systemer representerer nå i forkant av dagens in vitro alternativer 7,8. Likevel, disse metodene utelate robust mikromiljøet av en funksjonell sirkulasjonssystemetog derfor bare delvis erstatning for in vivo-modeller.
Den mest brukte in vivo modell av vaskulær invasjon er musa, hvori eksperimentelle metastase analysene er vanligvis utføres fordi de forekommer i forholdsvis korte tidsrammer, og er generelt et tegn på metastatisk evne 9. Disse analyser innebære direkte injeksjon av kreftceller i omløp og derfor modellere slutten stadier av metastasering, nemlig ekstravasasjon og kreftcelle kolonisering av organer. De eksperimentelle metastase analyser variere basert på tuftene av kreftcelle injeksjon og organene til slutt analysert. I det første analysetype, blir kreftceller injisert inn i halevenen til mus og kreftcelle seeding i lungene overvåkes 10,11. Den andre analysen innebærer utførelse intrakardielle injeksjoner for å lede metastatisk seeding mot benet mikromiljøet 12-14, men også hjernen 15. I den tredje analysen, kreft calen blir injisert inn i milten for å tillate kolonisering av leveren 16, mens den fjerde leveringsruten inn i karotidarterien bærer kreftceller i hjernen 17,18. Uavhengig av kreftcellen leveringsmåte, er organ kolonisering akseptert eksperimentelle endepunktet og er generelt bestemmes via luminescens, histologi, eller PCR-baserte teknikker. Til tross for de fysiologiske fordelene ved å drive eksperimentell metastase analyser innenfor en muse vert, disse eksperimentene fortsatt kreve uker til måneder å fullføre og analysere.
Sebrafisk (Danio rerio) modellen har nylig dukket opp som et nytt system for å studere kreft progresjon 19,20, og åpner for vurdering av kreftcellen vaskulær invasjon innenfor en funksjonell sirkulasjonssystemet over en mye kortere tidsskala sammenlignet med mus 21-24. Metoden benytter en gjennomsiktig sebrafisk stamme som har sin endothelia merket med en grønn rev korall fluorescent protein reporter drevet av kdrl promoter, sebrafisk reseptor for vaskulær endotelial vekstfaktor 25. I analysen blir kreftceller merket med et rødt fluorescerende markør og injisert i precardiac sinus av to dager gamle embryoer. Hvor som helst mellom 48 til 96 timer etter injeksjonen, kan kreftceller som har invadert ut av vaskulaturen og inn i den caudale området av embryoer scores effektivt på et fluorescerende mikroskop. Her kan vi bruke teknikken til et panel av vanlig anvendte humane brystcancercellelinjer for å demonstrere sterk forskjeller i deres vaskulære invasive egenskaper. Videre demonstrerer vi at ved å endre injeksjonsstedet til embryoet plommesekken tillater studiet av heterogene celleinteraksjoner, som cancercellepopulasjoner kan differensielt merket med fluorescerende fargestoffer og injisert i sebrafisk embryoer mangler fluorescerende vaskulatur. I denne sistnevnte analyse, har kreftceller som har invadert den eggeplomme og intravasated inn i vasculature blir scoret i hale regionen 24-48 timer etter injeksjon. På grunn av effektiviteten og bekvemmeligheten av denne modellen, er sebrafisk stadig ansatt for å raskt teste vascular invasiv evne til kreftceller under en fysiologisk innstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: sebrafisk embryoer ble generert i henhold til godkjent IACUC protokollen. Disse eksperimentene ble utført i samsvar med anbefalinger fra Georgetown University Animal Care og bruk komité.
1. Organiser Embryoet for injeksjon og Opprett Stock Solutions
- Generere nødvendige sebrafisk larver å vurdere kreftcelle vaskulær invasjon.
- Sett opp parvis eller gruppe i-cross parring med Tg (kdrl: grcfp) zn1, mitfa b692, ednrb1 B140 fisk.
MERK: Vi ga Tg (kdrl: grcfp) zn1, mitfa b692, ednrb1 B140 sebrafisk, ved å krysse Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, som uttrykker grønn rev koraller fluorescerende protein i endotelceller, med en linje som mangler pigment celler, mitfa b692, ednrb1 B140, utviklet ved Sebrafisk International Resource Center. - Collect egg, rent, og fjerne ubefruktede eller deformerte embryoer neste dag 22.
- Inkuber embryoer ved 28,5 ° C til den er klar for injeksjon med kreftceller, for å oppstå når sebrafisk embryo er 2 dager etter befruktning (2 DPF).
- Sett opp parvis eller gruppe i-cross parring med Tg (kdrl: grcfp) zn1, mitfa b692, ednrb1 B140 fisk.
- Gjør injeksjon plater.
- Smelt 25 ml 1,5% agarose i dH 2 O for hver plate.
- Hell 12 ml av agarose til en 100 mm x 15 mm petriskål og lar det stivne.
- Re-smelte og hell de gjenværende agarose i platen.
- Umiddelbart posisjonere et snitt glass form (3 mm x 7,2 cm brede x 7,5 cm lang), slik at den er i en 30 graders vinkel i forhold til agarose og plassert i sentrum av platen.
MERK: Dette vil skape en bratt 60 ° veggen og en 30 ° skrå rampe. - Tape glass mold på plass og la agarose stivne.
- Fjern forsiktig glass mold og være forsiktig med å rive agarose.
MERK: Former kan lagres i dH 2 O ved 4 ° C.
- Ekvilibrere injeksjon plate med fisk vann (0,3 g / l havsalt).
- Skylle plate to ganger med destillert vann.
- Ekvilibrere plate ved tilsetning av 10 ml av fisk vann til platen og stedet på ristemaskin i 10 min.
- Stabilisere plate en gang med fisk vann.
- Split 2-dagers post-fertilisering (DPF) embryoer til injeksjons grupper ved å overføre dem til retter med fisk vann 22.
- Forbered utvinning retter for hver gruppe til å utnytte etter injeksjon. Sikre at utvinning fatet inneholder 10 ml fisk vann, pluss penicillin (25 ug / ml) og streptomycin (50 ug / ml).
- Fremstille 2x Tricaine oppløsning ved tilsetning av 4 ml bufret Tricaine lager (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) til 50 ml av fisk vann pluss penicillin og streptomycin.
- Oppløs 15 mg lavt smeltepunkt agarose i 10 ml 2x Tricaine løsning for å generere en monterings bedøvelse medium som vil immobilisere levende embryoer for imaging.
MERK: Montering medium består av 1,5% agarose. - Trekk mikroinjeksjon nåler.
- Sette inn glass kapillarrør i en vertikal pipette avtrekker. Trekk lang konisk pipetter ved hjelp av 20 MAMP strøm og en to-spole varmeelement.
2. Merking kreft celler med Lipofile Fluorescent Dye
- Oppretthold kreftceller i sine anbefalte dyrkningsforhold.
MERK: Disse linjene ble opprettholdt i DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 og SK-BR-3. Disse linjene ble opprettholdt i RPMI + 10% FBS: HCC 1806 og T-47D. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C og 5% CO2 i løpet av inkuberingen. - Generere en enkeltcellesuspensjon ved å dissosiere en tilhenger kultur av kreftceller.
- Vask cellene først med PBS og deretter behandle med 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning.
MERK: Trypsin eksponeringstiden vil være avhengig av den cellelinjen. - Nøytralisere trypsin løsning med serum-inneholdende cellekulturmedium etter at cellene løsner.
- Vask cellene først med PBS og deretter behandle med 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning.
- Sentrifuger den trypsin-nøytraliserte cellesuspensjonen i 5 min ved 200 x g, og deretter cellepelleten suspenderes i ferskt kulturmedium for celletelling.
- Telle cellesuspensjonen ved hjelp av en automatisk teller og forberede 1 million celler i 200 ul av cellekulturmedier.
- Bekreft celle levedyktighet med trypanblått fargestoff eksklusjon før injeksjon i sebrafisk embryoer.
MERK: Bare levedyktige cellepopulasjoner skal injiseres i sebrafisk embryoer, som injeksjon av døde celler vil ikke nødvendigvis sant vaskulær invasjon.
- Bekreft celle levedyktighet med trypanblått fargestoff eksklusjon før injeksjon i sebrafisk embryoer.
- Tilsett 2 mL av rødt fargestoff lipofile til kreftcellesuspensjonen for en 1: 100 fortynning, bland godt, og deretter inkuberes blandingen ved 37 ° C i 20 min.
MERK: Konsentrasjon av fargestoff og merking tid kan trenge å bli optimalisert for hver cellelinje. - Etter inkubering tilsett 1 ml friskt medium til røret og deretter sentrifuger i 5 minutter ved200 x g.
- Vask bort rest fluorescerende fargestoff fra kreftcellene.
- Aspirer supernatanten fra celle-pelleten, resuspender pelleten i 1 ml friskt kulturmedier, og sentrifuger i 5 minutter ved 200 x g.
- Gjenta vasketrinnet for andre gang: Aspirer supernatanten, cellepelleten suspenderes i 1 ml friskt medium og deretter igjen Sentrifuger i 5 min ved 200 x g.
- Gjenta vasketrinnet for tredje gang: Aspirer supernatanten, cellepelleten suspenderes i 1 ml friskt medium og deretter igjen Sentrifuger i 5 min ved 200 x g.
- Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes inneholdende 1 million merkede kreftceller i 500 pl friskt medium.
MERK: 0,5 mM EDTA kan legges til media for å forebygge celle klumper.
3. Injisering kreftceller inn i Pre-hjerte Sinus av Sebrafisk embryoer
- Fest mikroinjeksjon dispensersystem til et trykkluft kilde og slå på the mikroinjeksjon tappesystem strømkilde.
- Prøvetrykket ved å trykke inn pedalen. En kort puls av luft skal slippe ut fra nåleholderen.
- Stabilisere injeksjons platene to ganger med 2x Tricaine løsning.
- For hvert Ekvilibreringstrinnet, tilsett 20 ml 2x Tricaine oppløsning til injeksjonsplaten og sted på ristemaskin i 10 min.
- Bruk plast pipette til å overføre en gruppe av embryo til en liten skål som inneholder 2x Tricaine løsning.
- Fylle mikroinjeksjon kanylen med kreftceller ved hjelp av en gel-lasting pipette tips.
- Plassere nålen på en elektrode lagringskrukke med den spisse ende vendt nedover slik at cellene avgjøre nær tuppen.
- Transfer 20 - 30 bedøvede embryo til en injeksjon plate ved å samle embryoene med mye 2x Tricaine i en plast pipette.
- Tillat embryoer å bosette seg i spissen av pipetten.
- Gently utvise embryoer i vanntrauet av injeksjons plate, sprer embryoene langs lengden av rennen.
- Rett embryoer med hodene vendt opp og magen vendt den bratte veggen av trau.
MERK: Tricaine løsningen skal dekke både gjennom lengden og den flate agarose overflaten, med embryoer bare bosatt i trauet. Embryoet er nå klar for injeksjon.
- Sprøyt 50 - 100 kreftceller (2-5 nl) inn i precardiac sinus av sebrafisk embryoer ved hjelp av mikroinjeksjon fordelingssystemet.
- Fest nålen til nål innehaver av en micromanipulator.
- Plasser injeksjon plate under stereoskop med 60 graders veggen til venstre og fokus på toppen embryo ved 25x forstørrelse.
- Plasser mikromanipluatoren slik at når lengre, vil nålen pierce embryo.
- Utvid nålen ved øyet til den er nesten rørende embryo.
- Ser under mikroskopet, justere nålen så that det vil pierce embryo på ytterligere forlengelse.
- Pierce embryoet gjennom plommesekken plassere tips bare, men ikke i den pre-hjerte sinus.
- Injisere cellene ved å trykke inn pedalen. Kraften av injeksjons utviser cellene inn i hjerte sinus. Trekk nålen.
- Ved hjelp av høyre hånd, ut og inn kanylen. Med venstre hånd, foreta finjusteringer for å plassere neste embryo.
- Returner nålen til elektroden lagring glasset mens du setter opp til å injisere en annen plate.
- Overfør embryoene til utvinning fatet når hele platen er injisert.
- Vippe injeksjon platen til bassenget embryoene ved bunnen, vasking eventuelle gjenværende embryoer ut av trauet, og samle dem med plastpipette.
- Tillat embryoene å bosette seg i bunnen av pipetten.
- Overfør embryoene til oppgangen rett i en minimal volum Tricaine.
- Incubate utvinning fatet ved 28 ° C i 1 time.
- Separate levedyktige sebrafisk embryoer fra døde fostre og annet rusk.
- Inkuber fatet ved 33 ° C til den er klar for å score, vanligvis 24-96 timer.
MERK: Denne temperatur bestemmes som et kompromiss mellom 37 ° C, den ideelle temperaturen for kreftceller, og 28,5 ° C, den ideelle temperaturen for sebrafisk.
4. Scoring Ekstravasasjon
- Anesthetize batch av embryoene som skal scoret ved å plassere dem i en skål med Tricaine løsning.
- Plasser en bedøvet larver på en depresjon mikros lysbilde i en dråpe Tricaine.
- Orient larver lateralt for optimal avbildning av hale regionen.
- Tell antall kreftceller som har blitt invadert av blodkar ved å fokusere opp og ned gjennom halen regionen for å tydelig skille intakte celler.
MERK: Det er best å ha minst to personer involvert i tsin prosess, der den enkelte å utføre fisken er blind for den eksperimentelle tilstand blir vurdert.- Resultat larver på en sammensatt fluorescens mikroskop med 10x objektiv. Bruk 20x objektiv for noen vanskelige samtaler.
5. Montering Embryoet bort på lysbilder og påfølgende Fluorescence Imaging
- Smelt 1,5% agarose / Tricaine løsning og få til 37 ° C.
- Anesthetize embryo som skal avbildes ved å plassere den i Tricaine løsning.
- Overfør embryoet i en dråpe Tricaine løsning på bildeflaten. Eventuelt bruke et glass-bottom tallerken eller objektglass.
- Bruke et glass-pipette for å fjerne overskudd Tricaine løsning, beholdt fosteret på bildeflaten.
- Overlegg en dråpe smeltet agarose løsning over fosteret.
- Raskt, før agarose polymeriserer, bruk en delikat verktøy, som en øyenvippe børste, for å orientere embryo lateralt for bildebehandling, noe som gir ekstra omsorgfor å sikre embryoet er avflatet langs den avbildningsflaten.
- Senk nå polymerisert agarose dråpe i henhold Tricaine løsning.
- Emne live sebrafisk embryo til mikroskopisk bildebehandling.
6. Modifikasjon: Injeksjon av kreftceller i plommesekken av Sebrafisk embryoer
- Forbered mikroinjeksjon doseringssystemet og injeksjons plater som tidligere beskrevet i punkt (3) i denne protokollen.
- Merk to celle populasjoner med kontrast fluorescerende fargestoffer som tidligere beskrevet i punkt (2) i denne protokollen.
- Injisere 5-10 nl av 2 x 10 ^ 7 celler / ml i plommesekken. Hold injeksjonsvolumet konstant å injisere identiske celle tall (100 - 200 kreftceller) fra hver celle populasjon
MERK: Man kan bruke gjennomsiktige sebrafisk embryoer mangler fluorescerende blodkar for denne analysen. Passiv inntrengning av partikler inn i vaskulaturen kan kontrolleres for ved å injisere fluorescerende kuler (<10 um) eller, endreopprinnelig, en cellelinje som ikke intravsate. - Gjenopprette de injiserte embryoene som tidligere beskrevet i punkt (3) i denne protokollen og deretter screene for vellykkede injeksjoner.
- Bruk et stereoskop til skjermen og overføre levedyktige embryoer som ble vellykket injisert i en ny matrett.
MERK: Alle embryoer skal ha en konsekvent størrelse masse av celler lokalisert i eggeplomme. Embryoet blir forkastet hvis massen størrelsen er forskjellig, eller hvis noen celler er plassert utenfor av eggeplomme. - Overfør levedyktige embryoer til en ny rett om kreftcellene er synlig i plommesekken.
- Bruk et stereoskop til skjermen og overføre levedyktige embryoer som ble vellykket injisert i en ny matrett.
- Inkuber fatet ved 33 ° C til den er klar for å score, vanligvis 24-48 timer.
MERK: Denne temperatur bestemmes som et kompromiss mellom 37 ° C, den ideelle temperaturen for kreftceller, og 28,5 ° C, den ideelle temperaturen for sebrafisk. - Å score intravasation, følge retningslinjene som er beskrevet i punkt (4) i denne protokollen, men i stedet telle antall cancer celler som har blitt invadert inn i blodkar av hale regionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her testet vi den vaskulære invasiv evne brukte brystkreft cellelinjer i en sebrafisk embryo modell (figur 1). Strenge kriterier var ansatt i scoring bloduttredelse for disse ulike cellelinjer, hvor positive hendelser ble bare telles hvis kreftcellene hadde klart ekstravasert, dette blir gjort først og fremst for å begrense eventuelle falske-positive som kan oppstå fra ledelsen mobilnettet rusk.
Vår analyse viste sterk forskjeller blant streker ved invasjonen ble målt 96 timer etter injeksjon inn i precardiac sinus (tabell 1). Av de 7-cellelinjene som ble testet, sebrafisk embryoer injisert med MDA-MB-231-cellelinjen viste den største antall ekstravaserte kreftceller pr embryo, et funn som er i overensstemmelse med aksepterte metastatisk natur av linjen (figur 2). Vi fant også at BT-474 celler lettest invaded inn i den caudale området til embryoene, mens andre cellelinjer, slik som MCF-7, SK-BR-3 og T-47D-celler, var minimalt invasiv (figur 3). En nysgjerrig oppdagelse var at omtrent halvparten av sebrafisk embryoer injisert med MDA-MB-468 celler hadde ødem i cardial regionen, og disse ble ikke scoret. Som en følge av dette ble et antall embryoer injisert med MDA-MB-468-celler kasseres før vi funnet tilstrekkelig levedyktige prøver som kan kvantifiseres for ekstravasasjon. Til tross for disse forskjeller angivelig, er det bemerkelsesverdig at ekstravasasjon foreligger fra hvert kreftcellelinje testes.
Som en modifikasjon til den precardiac sinus-analysen, utførte vi et konkurranseeksperiment hvor to populasjoner av MDA-MB-231-celler som er forskjellige i deres vaskulære invasive egenskaper 26 ble samtidig injisert i plommesekken for utvikling av embryo. MDA-MB-231 celler formert etter konfluent kultur forhold tidligereinjeksjon utviste en reduksjon i intravasation i sirkulasjonen, og derfor hadde et redusert tilstedeværelse i kaudal region av embryoene ved begge anledninger (figur 4).
| celle~~POS=TRUNC | Nr. # Ekstravasert Cells per Embryo | Område |
| MDA-MB-231 (Subkonfluente) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0.7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0.6 | 0-2 |
| T-47D | 0.3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0.2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0.1 | 0-1 |
Tabell 1: Sammenligning av Vaskulær Invasive Mulighet for brystkreft cellelinjer i Sebrafisk Vanligvis brukes brystkreftcellelinjer ble injisert i precardiac sinus av to dager gamle sebrafisk embryoer og scoret 4 dager senere. Kreftceller invaderer fra vaskulaturen og inn i hale region ble kvantifisert i 10 embryoer pr cellelinje. Det gjennomsnittlige antall ekstravaserte kreftceller er angitt sammen med utvalg.
Figur 1. Visuell Oppsummering av Sebrafisk Cancer Cell Ekstravasasjon analysen. I denne analysen, er kreftceller merket med et fluorescerende fargestoff og injisert i precardiac sinus av to dager gamle sebrafisk embryoer, hvis blodkar er preget av en kontrast fluorescerende reporter. Etter 2 - 4 flere dager, har kreftceller som har invadert inn i kaudal region av embryoet erscorte og kan monteres i en bedøvelse agarose medium for senere bildebehandling. Hvert trinn avbildet i denne skjematiske tilsvarer en del av protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bilde Mosaikk av et Sebrafisk Embryo 4 dager etter injeksjon med MDA-MB-231 celler. Lysfelt (A) og fluoriserende (B) mosaikk vist. Fluorescerende bilder blir vist som den maksimale projeksjon av en z-stabel, i hvilken en grønn farge betegner vaskulaturen og en rød farge angir kreftcellene. Målestokk, 200 um. (C) Et embryo kaudal region er forstørret for å vise ekstravaserte kreftceller. Punktat fluorescerende merking er sett på magnificasjon. Scale bar, 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Eksempel på Eksperimentelle resultater. Her ekstravasasjon demonstreres i et embryo injisert med BT-474 kreftceller, men ikke i et embryo injisert med MCF-7, SK-BR-3 og T-47D kreftceller. Pilspisser betegne ekstravaserte celler. Scale bar, 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Intravasation av MDA-MB-231 cellepopulasjoner 2 dager after plommesekk-injeksjon. (A) plommesekken med grønn (invasiv) og røde (mindre invasiv) merket MDA-MB-231-celler. (B) kaudal region med MDA-MB-231 celler som invaderte det vaskulære karet som nå halen region. (C) antall embryoer sebrafisk med intravasated MDA-MB-231 celler i kaudal region 2 dager etter injeksjon 26. Skala barer, 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknikken utnytter sebrafisk modell for effektivt å teste den vaskulære invasiv evnen av kreftceller (se figur 1). Her påføres vi teknikken til et panel av brystkreftcellelinjer for å tilveiebringe en grunnlinje på hvilken andre forskere kan deretter bygge sine egne studier (se tabell 1; figurer 2 - 3). Den observasjon at MDA-MB-231-celler lett invaderte inn i den caudale området av sebrafisk embryoer ville gjøre denne cellelinjen ideell for testing av midler som kan inhibere vaskulær invasjon. Forholdsvis mindre invasive cellelinjer, som HCC1806 eller MDA-MB-468-celler, for eksempel, kan bli anvendt for å studere faktorer som ellers ville forsterke vaskulær invasjon. Hvis disse typer forsøk kreve innlemmelse av narkotika, så en har to forskjellige rutene for levering, avhengig av hvorvidt behandlingen effekten forventes å være holdbar. Kreftceller kan bli forbehandlet med medikamentet før injeksjon iembryoene eller stoffet kan tilsettes direkte til vannet som huser embryoene hvor den vil påvirke kreftcellene ved diffusjon.
I vår sammenligning, analyserte vi kreftcelle bloduttredelse i sebrafisk embryo halen 96 timer etter injeksjon i precardiac sinus. For celle konkurranse MDA-MB-231 analysen ble intravasation i omløp vurderes 48 timer etter at plommesekken injeksjon. De tidspunkter som er valgt for analyse krever karakteristisk optimalisering for hver cellelinje hvor, for noen eksperimenter, kan toppekstravasering forekomme bare 24 timer etter injeksjonen. Det er verdt å merke seg at sebrafisk embryo har en funksjonell medfødte immunsystemet når de blir injisert med kreftceller 27, og følgelig kan fluorescerende rusk fra kreftcellene bli oppslukt av immunceller som makrofager eller nøytrofile. Aktivitet av det medfødte immunsystemet kan derfor potensielt skape falske positive fluorescerende merking når du forsøker å score extravasation; omsorg må gis til bare scorer celler som robust fluoresce i riktig kanal. Siden nåværende kreftforskning er implicating immunforsvaret i å forbedre kreft metastaser 28, kan sebrafisk embryo modellen gir unik innsikt i dette området ved å tillate for undersøkelse av krysstale oppstår mellom kreftceller og det medfødte immunsystemet. Denne ideen er eksemplifisert ved et par av nyere studier. Den første av disse studier viste at VEGFR hemning innenfor sebrafisk forbedret evne til nøytrofiler til å utløse metastatiske adferd fra kreftceller 29. En annen studie viste at CXCR4-CXL12 immun kjemokin signaliserer aksen er intakt innenfor sebrafisk, som reseptoren på humane kreftceller var i stand til å sanse og reagere på sebrafisk ligand 30, og uttrykk for CXCR4 i kreftceller korrelert med deres invasive evne innenfor det dyremodell. Videre ble det vist at sebrafisk makrofager messensted en kjemotaktisk respons mot menneske CXCL12. En sebrafisk embryo-stamme med fluorescerende merkede nøytrofiler 31, for eksempel, kan bli benyttet for ytterligere å utforske kreftcelleinteraksjoner med immunsystemet i denne modellen.
Noen få skritt i protokollen krever spesiell oppmerksomhet. For det første er det vesentlig at kreftceller blir dissosiert til en enkelt cellesuspensjon for å hindre tilstopping nålen under injeksjon i embryoene. Cellulære aggregater kan også blokkere strømmen av blod og interferere med evnen til kreftcellene for å reise opp i hale region, således forvrenger analysen. Cellular aggregater kan også føre til blodårene til å sprekke, og hvis dette skjer ledelsen med invasiv evne av levende kreftceller i disse regionene verken pålitelig eller anbefalt. Et annet potensielt problemområde gjelder merking av kreftceller med fluorescerende fargestoff. I forsøk i regi av vår lab, har vi funnet ut at lipofile fargestoffer,som DII for eksempel, har en tendens til å produsere den beste merking, men dens fluorescens nivå kan variere mellom cellelinjer. Av denne grunn bør det fluorescerende merking av cancerceller optimaliseres før injeksjon i befruktede egg for å forhindre over-merking. Det er viktig at det overskytende farvestoff blir vasket vekk fra kreftcellene etter at de er blitt merket, og dette oppnås ved de forskjellige sentrifugeringstrinn som er angitt i merkingen delen av protokollen; denne fremgangsmåten kan synes overflødig, men de er absolutt nødvendig. For mye fluorescerende fargestoff kan være giftige for cellene eller lekke inn i blodet, produsere en kunstig fluorescerende bakgrunn. Mange av disse problemene kan omgås via bruk av kreftceller som uttrykker fluorescerende proteiner, og det anbefales at disse systemene bli anvendt i stedet for fluoriserende fargestoff når det er mulig. Til slutt, når ledelsen embryoene for kreft bloduttredelse, er det viktig å bruke konsistente kriterier for alle forhold. Vi finner thinvolvere minst to personer i scoring trinnet hjelper opprettholde vitenskapelig rigor: en person er i oppgave å forberede lysbildene og registrering av resultater, mens den andre personen gjør bloduttredelse dommen og holdes blind til tilstanden som evalueres. Ved å utføre, kan man enten kvantifisere ekstravaserte kreftceller i halen område eller lag binære kriterier for å lette sammenligning. Fluorescens farging av kreftceller produserer punktformet merking som vil være synlig ved meget høy forstørrelse (figur 2c), selv om hele celler er lettere å skjelne ved lavere forstørrelse (figur 3), blir sistnevnte som anbefales for scoring. Skal vi dømme ut mer tvetydige tilfeller av ekstravasasjon kan bli hjulpet av oppkjøpet av optiske skiver på en konfokalmikroskop, hvor kvantifisering bloduttredelse som en prosent av alle celler i halen regionen kan kontrollere for ulik lasting av kreftceller i embryoet.
yolk sac injeksjonsvei er forskjellig fra den precardiac sinus som gjør det mulig for et høyere antall celler og derfor bedre plass til heterogeniteten i en cellepopulasjon. Som vist i figur 4, kan flere forskjellig merkede cellepopulasjoner blir samtidig injisert i plommesekken for å sammenligne deres evne invasive og mønster. Den angiogene egenskaper av injiserte celler og forbedret rekruttering av blodkar kan forenkle kreftcelleinntrengning inn i hale regionen, men dette aspektet har ennå ikke blitt analysert. Teknisk sett plommesekken injeksjoner er lettere å utføre enn en precardiac sinus injeksjon skjønt, på den annen side, er plommesekken et næringsrikt miljø som kan hindre avkjørselen til kreftceller. Det er også mulig at injeksjon nær blodårer i plommen kan tidlig innføre kreftceller i sirkulasjon, og derfor må man nøye skjermen for mislykkede injeksjoner og utelate disse embryoer fra å score. Endelig er det viktig to oppmerksom på at plommen mikromiljøet er noe kunstig, som det mangler en tilsvarende primære stedet i mus eller mennesker.
De ulike modellsystemer som søker å forutsi kreft metastasering er ikke uten sine fordeler og ulemper, og sebrafisk bloduttredelse analysen er intet unntak. Som en stor fordel, gjør denne analysen for vurdering av vaskulær invasiv evne innenfor en funksjonell sirkulasjonssystemet og eksperimentelle spørsmål kan bli besvart etter bare noen få dager. Med den raske behandlingstid, kan et slikt system bli anvendt for å undersøke den aggressive oppførselen til ikke bare etablerte cellelinjer, men også nylig isolerte prøver fra humane cancerpasienter. Den store ulempen er at denne modellen utelater de tidligste og seneste hendelsene i metastatisk kaskade ved å fokusere utelukkende på vaskulær invasjon. Videre er de humane kreftceller injisert inn i disse sebrafisk embryoer tydeligvis ikke opererer i en syngen miljø og noe samspill med than stroma kan dermed gå tapt. Til tross for disse begrensningene, har sebrafisk embryo modellen en fortjent plass i både grunnleggende og translasjonell kreftforskning, som vi har brukt det viser en rolle for Hippo signalveien 26 og keratin-assosiert protein 5-5 32 i vascular invasiv evne til kreft celler. Derfor har denne modellen potensial til å hjelpe etterforskningen av en nøkkel metastatisk kjennetegn på avansert stadium kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
