我们介绍了一种磁力悬浮技术，该技术结合了自动化成像与分析功能，既可用于兼容智能手机的设备，也可用于嵌入成像与处理模块的设备。该方法可用于测量细胞的密度分布，并展示了两项生物医学应用：镰状细胞病的诊断，以及白细胞与红细胞的分离。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
目前，许多临床诊断方法复杂、昂贵、效率低下，且全球大量人群难以获得。由于需要专用设备和经过培训的专业人员，许多诊断检测必须在偏远的中心化临床实验室中进行。磁悬浮是一种简单而强大的技术，可应用于悬浮细胞，当细胞悬浮于顺磁性溶液中并置于磁场中时，其位置由磁力与浮力之间的平衡决定。本文介绍了一种用于即时检测（point-of-care diagnostics）的多功能平台技术，该技术结合磁悬浮、显微成像和自动分析，用于测定患者细胞的密度分布，作为一项有价值的诊断指标。我们展示了基于该原理的两种平台：（i）一种与智能手机兼容的版本，利用智能手机内置摄像头对磁场中的细胞进行成像，并通过智能手机应用程序处理图像，测量细胞的密度分布；（ii）一种自包含式版本，采用摄像头模组采集图像，并通过嵌入式处理单元及配套的薄膜晶体管（TFT）屏幕完成测量并显示结果。已验证的应用包括：（i）测量具有疾病表型的细胞群体与健康表型相比的分布变化，该方法已应用于镰状细胞病的诊断；（ii）基于细胞特征性密度差异实现不同类型细胞的分离，该方法已用于将白细胞与红细胞分离，以进行白细胞细胞计数。此类应用以及该便携式、用户友好型平台技术所支持的未来扩展性密度测量，将显著提升即时检测环境下的疾病诊断能力。
引言
本文介绍了一种技术平台和方法，该方法结合磁力悬浮与自动成像及分析技术，通过分析患者细胞的密度分布来评估疾病状况。这种基于密度的流式细胞分析方法具有广泛适用性，最终可应用于多种疾病的诊断。然而，为了适用于即时检测（POCT）并在发展中国家推广应用，该技术必须满足低成本、便携性和易用性的要求。设备和耗材应易于获取且价格低廉；样品制备过程需简单，分析过程应实现自动化，尽量减少用户操作和结果解读的复杂性，并能快速获得结果。此外，设备必须结构紧凑、便于携带，以便在临床环境和发展中国家均可有效使用。因此，我们开发了一种设备和方法，将磁力悬浮技术与自动成像及图像分析相结合，实现符合即时检测要求的技术平台，用于获取患者细胞群体密度分布的结果。
即时检测技术相较于当前的临床实验室检测流程具有显著优势。目前可用的技术要么过于昂贵，无法由临床医生个人拥有，要么操作过于复杂，难以由医护人员直接实施。许多检测流程需要由经过培训的技术人员执行繁琐耗时的操作步骤。因此，患者样本（如血液或尿液）通常在医生诊所采集后，需转运至远程的集中式检测实验室进行临床检测，医生往往需要数天时间才能获得检测结果。这种情况在某些病例中可能导致治疗延误或并发症，使检测过程变得极为昂贵且低效（给保险支付方带来经济负担），并进一步导致许多诊断技术在资源匮乏地区和发展中国家中无法获得。
本文介绍了一种磁力悬浮技术，该技术结合了自动成像与分析功能，既可用于集成成像与处理模块的装置....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
伦理声明：所有涉及人血样本的操作均按照机构规定进行。所有方案均经过机构审查委员会审核并批准。所有参与者均签署了知情同意书。
1. 镰状细胞病诊断的样本制备5,8
- 在 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中配制 50 mM 的钆布醇溶液。
- 将 10 mM 的焦亚硫酸钠溶解于钆溶液中。
注意：焦亚硫酸钠吸入后有毒，对皮肤和组织有强刺激性。与水混合后呈腐蚀性酸性。高温加热时可能分解，释放出有毒的硫和钠氧化物烟雾。 - 通过指尖采血或静脉穿刺获取血样。
- 使用带有洁净一次性采血针的采血笔进行采血。在穿刺部位附近施加压力，并用棉签擦拭形成的血滴 3 至 4 次，然后使用移液器收集血液；注意不要通过挤压组织“挤奶”式采血，以免组织液混入样本造成污染。
- 或者，采用标准静脉穿刺程序采血14。
注意：若样本需保存数小时以上，应将血液收集至含有抗凝剂（如 EDTA）的真空采血管中。
- 将少于 1 µL 的血液加入 100 µL 钆-焦亚硫酸钠溶液中。
2. 白细胞计....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
对于用于镰状细胞病诊断的细胞密度分布分析，其目的是确定细胞群体分布宽度。无镰状细胞病患者的血细胞将局限于可预测的分布宽度内，而镰状细胞病患者的细胞则分布在更宽的区域，并在细胞分布图上呈现向下偏斜的趋势（见图4）。针对特定应用，可在对照样本与健康样本的分布宽度之间设定阈值，作为区分“健康”与“疾病阳性”的 cutoff 值5,8。
图4： 利用磁力悬浮分析血液样本中密度分布以.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
实验方案中的关键步骤
此过程中的关键因素包括磁铁的正确对齐。如果装置内的磁铁发生移位或分离程度超过正常范围，则可能影响实验结果。为控制该故障或过程中其他潜在问题，可定期使用密度受控的颗粒（如聚苯乙烯微球）来监测随时间发生的变化。此外，悬浮时间至关重要，需给予足够时间使细胞达到平衡状态。对于红细胞，10 分钟足以使所有细胞达到平衡。但需注意，较小的颗粒或细胞可能需要更长时间才能达到平衡。可通过每 5 秒拍摄一次延时图像，并绘制限制宽度随时间变化的曲线来评估这一过程；当限制宽度的变化可忽略不计时，即可判定为达到平衡状态。
该方案中的其他关键步骤包括精确浓度的钆溶液的配制，因为这会显著影响样品的悬浮高度。钆溶液可预先配制并使用储备液，但必须妥善密封，以避免溶液蒸发导致浓度意外升高。此外，必须注意维持所用细胞的健康状态。对于通过指尖采血获取的人血，应在采血后一小时内使用，并通过储存于密封容器中防止干燥。对于通过静脉穿刺获取的人血，样品应加入抗凝剂（本实验使用了常见的抗凝剂乙二胺四乙酸（EDTA））并在4 °C下保存不超过一周。对于贴壁细胞系，在胰酶消化前应彻底清洗去除死细胞，并.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者Stephanie Knowlton和Savas Tasoglu是mBiotics公司的创始人，并在该公司持有股权利益。mBiotics是一家初创企业，致力于将本文所述的磁力悬浮平台技术商业化，用于即时诊断解决方案。针对本文描述的技术，已提交一项临时专利申请，标题为“Magnetic Levitation with On-Board Optical Imaging and Image Analysis for Density-Based Separation, Identification, And Measurement”，专利申请号为UCONN Case No. 16-027。
致谢
作者谨此感谢波士顿儿童医院/达纳—法伯癌症研究所的 Matthew Heeney 博士和耶鲁—纽黑文医院的 Farzana Pashankar 博士提供镰状细胞病患者样本。作者还要感谢 Chu H. Yu 和 Ashwini Joshi 在样本检测和数据整理方面提供的帮助。
S.T. 感谢美国心脏协会科学家发展奖（15SDG25080056）和康涅狄格大学研究卓越计划对该研究的经费支持。S.K. 感谢本研究工作获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1247393）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 加达维（Gadavist，Bayer） | 杰斐逊医学与影像公司（Jefferson Medical and Imaging） | 2068062 | 加达维（Gadavist）含有1M钆布醇（gadobutrol），为钆的螯合物。我们购买了每盒15支的2 ml小瓶装产品。 |
| 方形玻璃毛细管 | Vitrocom | 8270 | 长度50 mm已足够 |
| 焦亚硫酸钠 | Sigma-Aldrich | S9000 | 化学式：Na2S2O5 |
| 徕卡显微系统冷冻密封管密封剂（Leica Microsystems Critoseal tube sealant） | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 02-676-20 | |
| 汉克平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution） | Sigma-Aldrich | H9269 SIGMA | |
| 胰蛋白酶-EDTA（Trypsin-EDTA） | Sigma-Aldrich | T4049 | 也可使用针对所用细胞类型推荐的其他试剂 |
| MICROLET 2 可调采血针装置 | 沃尔格林（Walgreens） | 246567 | 只要按照生物安全规程使用，任何采血针装置均可接受 |
| Microlet 采血针头 | 沃尔格林（Walgreens） | 667474 | 必须为一次性使用，不得重复使用 |
| 豪斯亮线相位血细胞计数板（Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer） | 费舍尔科技公司（Fisher Scientific） | 02-671-6 | 也可使用任何其他偏好的细胞计数方法 |
| ACK裂解缓冲液（ACK Lysing Buffer） | 赛默飞世尔科技（ThermoFisher） | A1049201 |
参考文献
- Tasoglu, S., Khoory, J., Tekin, H., Thomas, C., Karnoub, A., Ghiran, I., Demirci, U. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Tasoglu, S., Yu, C. H., Liadudanskaya, V., Guven, S., Migliaresi, C., Demirci, U. Magnetic L....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
