Probleme bei der Verarbeitung biologischer Proben für die Rasterelektronenmikroskopie umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus feuchten Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Kostengünstige und relativ schnelle Protokolle, die sich für die Vorbereitung anspruchsvoller Proben wie Blütenmeristeme, Oomycetenzysten und Pilze (Agaricales) eignen, werden hier zusammengestellt und detailliert beschrieben.
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Methodenartikel
Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Häufige Probleme bei der Verarbeitung von biologischen Proben für Beobachtungen mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM) umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Mit jungen Blütengewebe, oomycete Zysten und Pilzsporen (Agaricales) als Beispiele spezielle Protokolle empfindliche Proben zu verarbeiten hier beschrieben werden, die einige der wichtigsten Herausforderungen in der Probenbehandlung für die Bilderfassung unter dem SEM überwinden.
Floral meristems mit FAA fixiert (Formalin-Acetic-Alkohol) und mit dem kritischen Punkt Dryer (CPD) verarbeitet nicht Zellwände oder verzerrt Organe kollabiert Display. Diese Ergebnisse sind von entscheidender Bedeutung für die Rekonstruktion der Blütenentwicklung. Eine ähnliche CPD-basierte Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen, wie beispielsweise die mit Glutaraldehyd fixierten Oomyceten Zysten ist optimal die differentielle Wachstum von diagnostischen Eigenschaften zu testen (beispielsweise die Zyste Stacheln) auf verschiedenen Arten von substrates. Die Zerstörung der Nährzellen an Pilzsporen wurde nach Rehydrierung vermieden, Dehydrierung und der CPD-Behandlung, ein wichtiger Schritt für die weitere funktionelle Studien dieser Zellen.
Die Protokolle detailliert hier repräsentieren preiswerte und schnelle Alternativen für den Erwerb von qualitativ gute Bilder Wachstumsprozesse zu rekonstruieren und diagnostischen Eigenschaften zu studieren.
Einleitung
In der Biologie ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Untersuchungen von Strukturentwicklung erweitert, vergleichende Morphologie, Organentwicklung und Charakterisierung von Populationen oder 1 - Arten. Mit seiner zweidimensionalen Ansicht von mikroskopischen Strukturen, Bereiche wie Mikromorphologie und Systematik profitierte von SEM - Technik Fortschritte seit der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts. Beispielsweise hat die Einführung der Sputter - Beschichtungsmethode in den 1970er Jahren möglich , Beobachtungen von empfindlichen Materialien wie Spross Scheiteln und Blüten der Abbildungs aus nichtleitendem Geweb....
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Protokoll
HINWEIS: Dieses Protokoll enthält sechs Hauptbereiche, drei gewidmet bestimmte Organismen (Abschnitte 1-3), und drei der Beschreibung der Verfahren, die für alle (4-6). Sternchen (*) zeigen Schritte, die von den Experimentatoren modifiziert.
1. Studium der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed
- Sammlung und Fixierung
- Wenn das Pflanzenmaterial in einem Ort ohne Zugang zu einem Abzug gesammelt wird, einführen und das Material in 70% Ethanol in Zentrifugenröhrchen eintauchen. Idealerweise tauchen Sie das Material nach 48 h in FAA (Schritte 1.1.1-1.1.3) übermäßige Dehydratisierung in Ethanol zu verm....
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Ergebnisse
Floral Entwicklung und Fixierung der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed
Mit dem FAA-CPD-Protokoll hier beschrieben, junge und reife Pflanzengewebe optimal fixiert und dehydriert für SEM-Bildgebung. Prozesse wie Blütenentwicklung kann rekonstruiert werden , weil die Topographie und die Form der Knospen nicht durch Zellschrumpfungs (Figuren 1b, 1d, 4a-f) verzerrt. Strukturen mit komplizierten Formen kön.......
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Diskussion
In Bezug auf die Standard-SEM-Protokolle, präsentiert die Verfahren hier sind relativ schnell, einfach zu folgen, und Low-Cost-Methoden. Je nach der Menge der Proben und auf die Leichtigkeit der Verarbeitung, dauert es vier bis fünf Tage, um Bilder von guter Qualität erhalten. Einschließlich einer angemessenen Sicherheitsvorkehrungen für die CPD und SEM-Betrieb sind die Verfahren einfach zu handhaben. Besondere Vorsicht ist mit Formalin und Glutaraldehyd (siehe Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 und 2.1.5 des Protokolls) entnomme.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Dieses Projekt hat die Finanzierung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Finanzhilfevereinbarung Nr erhielt 634429. Diese Publikation des Autors, die Ansichten reflektiert, und die Europäische Kommission kann nicht für die weitere Verwendung gehalten werden, die von den Informationen gemacht werden können, darin enthalten sind. Wir erkennen auch die finanzielle von Real Jardín Botánico, CSIC Beitrags. SR dankt der Europäischen Union [ITN-SAPRO-238550] für die Unterstützung ihrer Forschung in Saprolegnia. Wir wollen auch für bieten Francisco Calonge danken Sie bitte die Phellorinia herculanea Bilder und B....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Essigsäure | Kein spezifischer Lieferant | Hautreizungen, Augenreizungen | |
| Aluminiumstummel | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Zentrifugenröhrchen | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1.083.421.000 | |
| Doppelseitiges Klebeband | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Ethanol absolut | Kein spezifischer Lieferant | Entzündlicher | |
| europäischer bakteriologischer Agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filterpapier | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Pinzetten | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Formalin 4% | Kein spezifischer Lieferant | Gesundheitsschädlich, akute Toxizität, Hautsensibilisierung, Karzinogenität. | |
| Abdeckgläser aus brennbarem Glas | Kein spezifischer Lieferant | ||
| hermetischer Glasbehälter | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Glutaraldehyd 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mykologisches Pepton | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| Nadeln | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Petrischalen | Kein bestimmter Lieferant | ||
| Kunststoffbehälter | Kein bestimmter Lieferant | ||
| Probenhalter mit Deckel für den Trockner an der kritischen Stelle | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| Skalpelle | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Rasterelektronenmikroskop | Hitachi | S3000N | |
| Software für REM | |||
| Lösung A: NaH2PO4 | |||
| Lösung B: Na2HPO4 | |||
| Probenhalter | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Sputter-Coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomikroskop | Kein spezifischer Lieferant | ||
| Transmissionselektronenmikroskop (TEM) Gitter | Elektronenmikroskopie | Wissenschaften G200 (Quadratmasche) | www.emsdiassum.com |
| Pinzette | Kein spezifischer Lieferant |
Referenzen
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputte....
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Nachdrucke und Genehmigungen
