监测星形胶质细胞反应性与增殖 体外 在模拟缺血条件下

摘要

缺血性脑卒中是一种复杂的病理事件，其中星形胶质细胞在暴露于氧糖剥夺（OGD）的脑区所发挥的特定作用难以研究。本文介绍了一种获取分离星形胶质细胞的方法，并研究其在氧糖剥夺条件下的反应性及增殖能力。

摘要

缺血性脑卒中是一种由血栓或栓子阻塞脑部血流引起的复杂脑损伤。这会导致脑组织缺氧和葡萄糖供应中断，进而引发能量衰竭和神经元死亡。在发生缺血性脑卒中后，星形胶质细胞会活化，并在损伤区域周围增殖。在此情况下，难以研究星形胶质细胞对缺血脑区所起的特定作用。因此，本文介绍了一种用于研究原代星形胶质细胞在缺血条件下活化与增殖反应的方法 体外 模拟缺血样环境，称为氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation, OGD）。星形胶质细胞从出生后1至4天的大鼠幼鼠中分离获得，并通过星形胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）及细胞核染色评估非特异性星形胶质细胞的数量。星形胶质细胞接受OGD处理的时间可自定义，其所暴露的氧气浓度百分比也可调节。这种灵活性使科研人员能够在不同细胞组中表征缺血样条件持续的时间 体外本文讨论了通过增殖细胞核抗原（PCNA）免疫荧光检测所评估的氧糖剥夺（OGD）诱导星形胶质细胞活化、肥大形态改变及增殖的时间进程。除增殖外，星形胶质细胞还会经历能量与氧化应激，并通过向细胞培养基中释放可溶性因子来响应OGD。该培养基可被收集并用于分析星形胶质细胞释放的分子对原代神经元培养物的影响，且无需细胞间直接接触。综上所述，该原代细胞培养模型可有效用于理解损伤条件下孤立星形胶质细胞的作用。

引言

脑卒中被定义为"一种血管源性的急性神经功能障碍，其症状和体征突然或迅速出现，对应于脑部局部区域的受累"^1,2。脑卒中分为两种类型：出血性脑卒中和缺血性脑卒中。当血管功能障碍由动脉瘤或动静脉畸形引起，并伴有动脉壁薄弱继而破裂时 ，称为出血性脑卒中³，这种情况多数会导致死亡。当血栓或栓子阻塞血流，导致脑区暂时性缺氧和葡萄糖供应不足时，则称为缺血性脑卒中⁴。若受累区域周围细胞无法获得足够营养，即缺血核心周围的组织出现稳态和代谢失衡、能量功能障碍、神经元死亡及炎症反应⁵，可导致患者终身残疾⁶。

缺血性脑卒中是一种多因素损伤，涉及多种细胞类型，这些细胞在不同时间点发生反应并发挥各自的作用。众多相互作用使得研究单个细胞的行为变得困难。那么，在如此复杂的环境中，我们如何研究特定细胞类型的贡献呢？一种被广泛接受的 体外 缺血模型包括将细胞暴露于无氧无糖（OGD）环境中一定时间，随后将细胞恢复至常氧环境。该系统模拟缺血性脑卒中后血流再灌注的过程。在此方法中，细胞或组织被置于无葡萄糖培养基中，并在经特殊低氧舱去除氧气的环境中进行培养。OGD孵育时间....

方案

采用出生后1至4天的幼年大鼠（Sprague Dawley品系）分离大脑皮层。根据美国国立卫生研究院（NIH）指南批准的方法，以断头法实施安乐死。

1. 手术器械与材料的准备

1. 使用钢盒或快速封口灭菌袋，将器械在高压灭菌器中灭菌（温度：121 ºC，压力：15 psi，时间：30 分钟）。参见材料表中的材料。

2. 完全DMEM培养基的配制

1. 在含有 700 mL 经高压灭菌水的一升烧杯中，于室温下加入 Dulbecco 改良 Eagle 培养基粉末。
2. 在使用磁力搅拌器搅拌溶液的同时，加入 3.7 g/L 碳酸氢钠。
3. 用高压灭菌水将体积补至 1 L，同时调节 pH 至 7.4，然后进行过滤。用于培养时，按所需体积补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，并在 37 ˚C 下预热。参见材料表中的材料。
   注意： 将 pH 计电极插入培养基中，将 pH 调节至 7.4。调节过程中培养基必须持续搅拌，并使用滴管缓慢加入 1 M NaOH。

3. 原代星形胶质细胞培养

注意：

结果

原代星形胶质细胞培养的主要问题之一是存在其他类型的细胞，例如神经元、少突胶质细胞、成纤维细胞和小胶质细胞。图1显示从大鼠皮层分离的细胞每3天更换一次培养基，部分细胞未接受处理，另一部分则添加LME处理1小时。24小时后，对细胞进行GFAP免疫染色，并用DAPI复染。未经处理的细胞中平均有39%为GFAP阴性细胞，而经LME处理的细胞中仅为8%。这些结果表明，LME处理结合换液可使GFAP阴性细胞减少4.75倍，从而获得富集的星形胶质细胞培养物。为了确定1小时或6小时的氧糖剥夺（OGD）在此方法学条件下是否影响星形胶质细胞的存活率，图2展示了损伤后24小时星形胶质细胞培养物的MTT检测结果。各组之间细胞活力无显著差异，表明这两种时间点均可用于研究星形胶质细胞的反应性。细胞增殖是OGD在星形胶质细胞中诱导的效应之一。图3中的增殖细胞核抗原（PCNA）表达从常氧细胞的10%上升至1小时OGD后的30%.......

讨论

本方案描述了从大鼠大脑皮层中分离星形胶质细胞的方法。该方法的关键在于减少小胶质细胞、少突胶质细胞和成纤维细胞等其他细胞类型的污染。为减少小胶质细胞的数量，可采取多种措施：更换培养基、轨道振荡以及化学处理。一旦通过免疫荧光法使用特异性细胞标志物或针对主要污染细胞类型的标志物确认培养物的纯度，即可开展实验。例如，可使用针对离子化钙结合接头分子1（Iba-1）的抗体来检测小胶质细胞。神经元死亡在培养早期即开始发生，这些细胞以及少突胶质前体细胞（OPCs）会在第3天敲击培养瓶并更换培养基后被清除。³¹ 可使用如olig2或NG2等抗体来鉴定少突胶质前体细胞。GalC可用于鉴定未成熟或成熟的少突胶质细胞，但在该培养阶段，这些细胞不太可能存在。此外，也可通过定量非GFAP阳性细胞来估算污染细胞的比例。这种最后一种方法虽不能区分具体的细胞类型，但是一种更快且更经济的评估培养物中非星形胶质细胞比例的方法。

星形胶质细胞富集培养建立后，可进行氧糖剥夺（OGD）实验以研究星形胶质细胞的反应性。通过向溶液中通入氮气以置换氧气，是一种常用的实验方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>外科手术器械 - 第1步
操作剪刀 5.5”	Roboz公司	RS-6812	用于断头处死大鼠的工具。
弯头镊子 7”	Roboz公司	RS-5271	在移除大鼠颅骨时固定其皮肤。
微型解剖剪 4”	Roboz 公司	RS-5882	同时切开大鼠的皮肤和颅骨。
显微解剖镊子 4” 倾斜的，精细锋利的	Roboz公司	RS-5095	在移除大鼠颅骨时固定其皮肤。
显微解剖镊 4” 轻度弯曲 0.8	Roboz 公司	RS-5135	用于分离皮质的工具。
显微解剖镊	Roboz 公司	RS-4972	剥离脑膜
解剖显微镜	Olympus	SZX16	对去除大脑皮层的脑膜至关重要。
<强>DMEM 制备——步骤 2
杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM培养基	GibCo. 公司	11995-065	支持细胞生长。
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich 公司	S7277	细胞培养基添加剂
胎牛血清（FBS）	GibCo. 公司	10437-010	细胞培养用血清补充剂
青霉素-链霉素	GibCo. 公司	15140-148	抑制细胞培养中细菌的生长。
1L滤器系统，孔径0.22μm	康宁	431098
<强>星形胶质细胞培养 - 步骤3
5 mL 血清移液管	VWR	89130-896	将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。
10 mL 血清移液管	VWR	89130-898	将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。
25 mL 血清移液管	VWR	89130-900	将DMEM用移液器加入含有细胞的容器中。
离心15 mL锥形管	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
安全锁扣管 1.5 mL	Eppendorf	022363204
200 µL 防污染吸头	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
屏障吸头 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
生物危害橙色袋 14 x 19"	VWR	14220-048
60 mm 培养皿	Falcon	351007
无菌纱布垫	霍尼韦尔安全防护	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar 实验室系统	030010019	匀浆脑组织。
Stomacher 80 均质器无菌袋	Sewar 实验室系统	BA6040	拍击式均质器用无菌袋
400 mL烧杯	Pyrex	1000
无菌细胞分离筛，60目	Sigma-Aldrich 公司	S1020	获得均匀的单细胞悬液。
无菌细胞分离筛，孔径 #100	Sigma-Aldrich 公司	S3895	获得均匀的单细胞悬液。
倒置相差显微镜	尼康	Eclypse Ti-S	检测细胞是否存在污染或异常生长。
75 cm² 无菌培养瓶	Falcon	353136
多孔板	Falcon	353046
18毫米圆形盖玻片	VWR	48380-046
亮线血细胞计数板	Sigma-Aldrich 公司	Z359629
巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20D
乙醇	Sigma-Aldrich 公司	E7023
L-亮氨酸甲酯盐酸盐 98%（LME）	Sigma-Aldrich 公司	L1002	促进原代皮质星形胶质细胞培养物中小胶质细胞的清除。
胞嘧啶 β-D-阿糖呋喃糖苷（Ara-C）	Sigma-Aldrich 公司	C1768
聚-D-赖氨酸氢溴化物，分子量 70,000-150,000	Sigma-Aldrich 公司	P0899
胰蛋白酶/EDTA	GibCo. 公司	15400-054
台盼蓝	Sigma-Aldrich 公司	T8154
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂	Calbiochem	524650
无菌水	Sigma-Aldrich 公司	W3500
<强> OGD 培养基制备——步骤 5
50 mL 圆锥形离心管离心	VWR	89039-658
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’无糖培养基	Sigma-Aldrich 公司	D5030	支持细胞生长。
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich 公司	S7277	细胞培养基添加剂
青霉素-链霉素	GibCo. 公司	15140-148	抑制细胞培养中细菌的生长。
200 mM  L-谷氨酰胺	GibCo. 公司	25030-081	促进细胞生长的氨基酸。
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂	Calbiochem	524650
50 mL 0.22 μm 孔径滤器系统	康宁	430320
50 mL 圆锥形离心管离心	VWR	89039-658
单一流量计	Billups-Rothenberg	SMF3001	测量氧气吹扫中的气体流量。
缺氧培养箱	干细胞	27310	为细胞培养提供低氧环境。
可追溯溶解氧测定仪	VWR	21800-022
95% N2 / 5% CO2 气体混合物	Linde		清除环境中的氧气。
<强>原代星形胶质细胞免疫荧光——步骤6
磷酸盐缓冲液（PBS）片剂	Calbiochem	524650
中性缓冲福尔马林溶液 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	用于固定细胞的溶液。
甲醇	Fisher	A4544	用于固定细胞的溶液。
非离子型表面活性剂（Triton X-100）	Sigma-Aldrich	T8787
胎牛血清（FBS）	GibCo. 公司	10437-010	细胞培养用血清补充剂
抗 NeuN	细胞信号传导	24307	检测成熟神经元，用于验证星形胶质细胞培养。
抗PCNA	细胞信号传导	2586	检测增殖细胞。
碘化丙啶（PI）	Sigma-Aldrich 公司	P4170	细胞凋亡染色
抗Olig1	Abcam	AB68105	检测成熟的少突胶质细胞。
抗Iba1+	和光	016-20001	检测小胶质细胞。
抗GFAP-Cy3抗体	Sigma-Aldrich 公司	C9205	检测经处理细胞中的反应性星形胶质细胞。
Alexa Fluor 488	分子探针生命科技	A1101	抗小鼠二抗
Alexa Fluor 555	分子探针生命科技	A21428	抗兔二抗
4’,6’-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Sigma-Aldrich 公司	D9542	细胞核染色
共聚焦显微镜	Olympus