Summary
Iskemiske hjerneslag er en kompleks hendelse der bidraget av astrocyttene til berørte hjernen regionen utsatt for glukose oksygenmangel (OGD) er vanskelig å studere. Denne artikkelen presenterer en metode for å skaffe isolert astrocyttene og studere deres reaktivitet og spredning under OGD forhold.
Abstract
Iskemiske hjerneslag er en kompleks hjerneskade forårsaket av en blodpropp eller embolus hindrer blodtilførsel til deler av hjernen. Dette fører til deprivasjon av oksygen og glukose, som forårsaker energy feil og neuronal død. Etter en iskemiske hjerneslag fornærmelse, astrocyttene bli reaktive og sprer rundt skade området som det utvikler seg. I dette scenariet er det vanskelig å studere bidraget av astrocyttene til hjernen regionen utsatt for ischemia. Derfor presenterer denne artikkelen en metodikk for å studere primære astrocytter reaktivitet og spredning under en i vitro modell av ischemia-lignende miljø, kalt glukose oksygenmangel (OGD). Astrocyttene ble isolert fra 1-4 dagers-gamle neonatal rotter og antall uspesifisert astrocytic celler ble vurdert astrocytter selektiv markør Glial Fibrillary Sure Protein (GFAP) og kjernefysiske flekker. Perioden der astrocyttene utsettes for OGD tilstanden kan tilpasses, samt prosenten av oksygen de utsatt for. Denne fleksibiliteten gjør at forskere til å beskrive varigheten av iskemiske som betingelsen i forskjellige grupper av celler i vitro. Denne artikkelen omhandler tidsrammer av OGD som induserer astrocytter reaktivitet hypertrofisk morfologi og spredning målt ved immunofluorescence med voksende celle kjernefysiske Antigen (PCNA). Foruten spredning, astrocyttene gjennomgå energi og oksidativt stress, og svare på OGD ved å slippe løselig faktorer til celle medium. Dette mediet kan samles og brukes til å analysere effekten av molekyler utgitt av astrocyttene i primære neuronal kulturer uten celle-til-celle. I sammendraget, kan denne primære celle kultur modellen effektivt brukes til å forstå rollen av isolerte astrocyttene ved skade.
Introduction
Slag er definert som "en akutt Nevrologisk dysfunction av vaskulær opprinnelse med plutselige eller rask utvikling av symptomer og tegn, tilsvarer involvering av fokal områder i hjernen"1,2. Det finnes to typer slag: hemoragisk og iskemiske. Når vaskulær dysfunksjon er forårsaket av aneurisme eller en Arteriovenøs feil, ledsaget av svekkelse med bakre brudd på en arterie, kalles dette hemoragisk hjerneslag3 som, i de fleste tilfeller fører til døden. Når en blodpropp eller en embolus hindrer blodstrøm, kalles forårsaker en midlertidig deprivasjon av oksygen og glukose til en hjernen regionen, det iskemisk slag4. Feil å ernære cellene rundt det berørte området eller iskemisk kjernen fører til en homøostatisk og metabolsk ubalanse, energisk dysfunksjon, neuronal død og betennelse5, som kan indusere en livslang funksjonshemming for pasienter6.
Iskemiske hjerneslag er en multifaktoriell skade som involverer flere typer celler som reagerer og deres effekter på ulike tidspunkt. Mange samhandlinger opprette et vanskelig miljø for å studere atferden til enkeltceller. Så, hvordan vi studere bidrag fra en bestemt celle type under så komplekse miljø? En akseptert i vitro modell av iskemi består av utsette celler til oksygen og glukose deprivasjon (OGD), for en viss periode, etterfulgt av restaurering av celler i et normoxic miljø. Dette systemet simulerer en iskemiske hjerneslag etterfulgt av blod reperfusion. I denne metoden, blir eller vev utsatt for en glukose-frie medier i et miljø renset av oksygen, ved hjelp av en spesialisert hypoxic kammer. OGD inkubasjon tiden kan variere fra noen få minutter til 24 timer, avhengig av hypotesen som ønsker å bli testet. Studier har vist at avhengig av ganger av OGD og normoxic miljø, bestemte fenotyper av hjerneslag (dvs., akutt eller Subkronisk) kan oppnås. Primære isolert astrocyttene, utsatt for OGD med bakre restaurering normoxic forhold, er godt studert mobilnettet modell å etterligne slag i vitro7. Bruke OGD er mulig å avsløre uavhengig molekylære mekanismer av isolerte celler under et slag-lignende miljø.
Som vår kunnskap om astrocytter biologi øker, har det blitt tydelig at de er avgjørende for å opprettholde synapser og opprettholde nevrale reparasjon, utvikling og plastisitet8. Under normale forhold, astrocyttene slipp og svare på cytokiner, chemokines, vekstfaktorer og gliotransmitters, metabolske balanse og homeostase i synapser5,9. I akutt neuroinflammation, for eksempel iskemiske hjerneslag, kan disse cellene bli reaktive, Vis en langsiktig overuttrykte av Glial Fibrillary Sure Protein (GFAP) og Vis hypertrofi i deres morfologi5,10, 11 , 12. som den iskemiske betennelsessykdommer utvikler, homeostase av astrocyttene blir påvirket, om normal glutamat opptak, energi metabolisme, utveksling av aktive molekyler og antioksidant aktivitet13.
Reaktiverte astrocyttene sprer rundt betennelsessykdommer vevet mens leukocytter migrere mot den lesioned område14. Astrocytic spredning kan måles med markører som voksende celle kjernefysiske antigen (PCNA), Ki67 og bromodeoxyuridine (BrdU)15. Denne proliferativ responsen er generert i en tidsavhengige måte og det hjelper danner glial arret, en rekke irreversibelt reaktive astrocyttene langs parenchyma av skadet området etter en skade9. En av de første funksjonene i denne arr er å begrense immun cellen bloduttredelse fra dette området. Men har studier vist at arret blir et fysisk hinder for axons å forlenge, så de slipper molekyler begrenser axonal vekst, og danner en fysisk barriere hindrer axons i å utvide rundt skadde området16. Likevel er det vitenskapelige bevis som viser at etter en ryggmargsskade, fullstendig å hindre glial skjemmende arr kan svekke fornyelse av axons17. Derfor sammenheng der bestemte astrocytic svaret måles, må vurderes på rammen av skaden studerte.
Presentert metodikken kan brukes for å studere individualisert funksjonen av astrocyttene etter glukose oksygenmangel, og det kan endres avhengig av spørsmål som etterforskeren ønsker å svare. For eksempel tillegg morfologiske endringen og markører uttrykt på ulike tidspunkter, OGD, supernatants fra astrocyttene utsatt for OGD kan videre analyseres for å identifisere løselig faktorer utgitt av disse cellene, eller brukes som en betinget media for å vurdere sin effekt i andre hjerneceller. Dette gir studier på astrocytter reaktivitet som kan føre til utviklingen av faktorene som styrer og modulere sine svar i en iskemiske hjerneslag scenario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
postnatal rotter (Sprague Dawley) 1-4 dager gamle brukes til å isolere halvdelene. Euthanasia er halshogging, som er godkjent av NIH retningslinjer.
1. forberedelse av instrumenter og materialer for kirurgi
- Sterilize instrumenter i en autoklav (temperatur: 121 ºC, Press: 15 psi, tid: 30 minutter) ved hjelp av en stålkasse eller et øyeblikk forsegle sterilisering veske. Se materialer i Tabellen of Materials.
2. Fullføre DMEM forberedelse
- i en en liter kanne inneholder 700 mL autoklaveres vann, legge Dulbecco ' s endret Eagle ' s middels pulver ved romtemperatur.
- Legge til 3,7 finans natriumbikarbonat, mens løsningen er rørt med en magnetisk rørestang.
- Justere pH 7,4, med autoklaveres vann bringe volum opp til 1 L, deretter filtrere. For kultur formål, supplere det ønskede volumet av media med 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin, og varm på 37 grader. Se materialer i Tabellen of Materials.
Merk: PH ble justert 7,4 via sette inn pH meter elektroden i media. Mediet må være omrøring, sakte legger 1 M NaOH bruker en dropper.
3. Primære astrocytter kultur
Merk: etter seeding, cellen media må endres hver tre dager og celler kan dyrkes opp confluency (11-13 dager). På den tredje dagen, trykk kolbe flere ganger til heis microglial celler og oligodendrocyte stamfar celler av kulturen, fjerne alle den ' gamle ' media, vask to ganger med 10 mL PBS, Sug opp PBS, deretter legge frisk nye medier. Se materialer i Tabellen of Materials.
- Disseksjon av nyfødte rotte hjernen
- utføre dissection i vev kultur hette. Få 1-4 dager gamle nyfødte rotte unger (2 rotte hjerner brukes per 75 cm 2 kolbe).
- Forberede tre 60 mm petri retter og Pipetter 5 mL av fullstendig DMEM på hvert.
Merk: De kan deles som følger: #1 for hver rotte hjernen, #2 for alle halvdelene av hjernen, og #3 for alle skrelles halvdelene (uten meninges). - Forstå det pup og spray med 70% etanol. Halshugge det og kast kroppen i en liten biohazard avfallsbeholderen.
- Bruker micro-dissekere pinsett, holde hodet og kutt huden på toppen av hodet til å eksponere kraniet.
- Med en saks, kan du gjøre en " T " snitt fra baksiden av skallen mot nesen. Bruke et par pinsett Fjern skallen.
- Fjerne synlige hjernen med et par pinsett og sett hjernen i en av petri retter tidligere fylt med medium.
- Bruker et annet sett av sterile instrumenter for de påfølgende trinnene.
- Bruke mikro-dissekere tang forsiktig plassere én hjerne på invertert lokket av en 60 mm Petriskål. Når Petriskål plasseres på sterilt gasbind, er det mulig å vise hjernen klart og det er enklere å analysere.
- Jevn hjernen med mikro-dissekere tang og separate cerebral halvkulen av forsiktig teasing langs midtlinjen rennen med den skarpe enden av mikro-dissekere pinsett.
- Deflect og Skrell halvdelene, etterlot hvit saken, og overføre dem til en Petriskål, tidligere merket #2. Gjenta dette for alle hjernen, kombinere alle dissekert halvdelene i Petriskål merket #2.
- Ta ut hippocampus fra under hver cortex og kast det.
- Bruker micro-dissekere pinsett og en 60 mm petri forsiktig Peel meninges fra personlige kortikale lobes, og plassere dem i Petriskål merket #3.
- Vev dissosiasjon: homogenizer blender metoden
- hell vev og mellomstore suspensjon (skrelles halvdelene av hjernen) i sterilt blender posen og legge nok medium for å bringe det totale volumet i posen til 5 mL.
- Legg vesken i homogenizer blender, forlater ca 2 cm av posen synlig over lukket døren. Cellen dissosiasjon gjøres under 2,5 min i høy hastighet.
Merk: Alternativt kan dette gjøres ved å lukke posen og forsiktig hamrende det med et beger på panseret. Bruk en klut pose og kanne for å unngå friksjon. - Hell celle suspensjon i et nummer 60 sil og hell deretter filtrert flyten gjennom på antall 100 silen, at det å filtrere av tyngdekraften.
- Bruke 15 mL rør, sentrifuge celle suspensjon på 200 x g i en klinisk centrifuge (fortrinnsvis swing bøtte rotoren) for 5 min.
- Hell av nedbryting i et beaker, så bruker en serologisk pipette, å suspendere og dissociate pellet celleområde i maksimalt 5 mL medier.
- Celle teller
- med brønnene, samle 100 µL av cellen suspensjon i en 1,5 mL microcentrifuge rør og legge 100 µL av trypan blå.
- Sett 10 µL av samlet suspensjon i hemocytometer og telle alle cellene som er levedyktig i de fire hjørnene av torget.
- Formler for å beregne tettheten av cellene før du tilbereder flasker er:
- legge til minst 500 000 celler per 25 cm 2 kolbe. Pipetter opptil 5 mL av DMEM i hver kolbe. Blandingen skal ikke nå halsen av flasken. Plasser dem i en 37 ° C inkubator på 5% CO 2, 3 dager og deretter endre media.
- Astrocytter rensing teknikker: media endre, mekaniske og kjemiske strategier
Merk: metabolske rate av astrocyttene er høy sammenlignet med andre celletyper, derfor i ernæringsmessig fratatt forhold, disse cellene Vis lav overlevelse etter noen dager. I motsetning til astrocyttene, microglia påvirkes ikke av ernæringsmessig deprivasjon og sprer i slike miljøer 18. For å opprettholde et redusert antall microglial celler, endre forfatterne astroglial celle kultur media hver tredje dag. Dette konstant forandring i cellen media vil også redusere befolkningen microglial som kan vokse over astrocytic celle monolayer i kolbe 19.- Bruk en Pasteur pipette inneholder media med ikke-tilhenger microglial celler fra hver av flasker. Vask alle partikler igjen bruker sterilt-filtrert PBS til hver av flasker i en dropwise måte (5 mL/kolbe).
- Legge den sterile-filtrert DMEM (med antibiotika og fetal bovin serum) dropwise til hver kolbe (5 mL/kolbe). Forsiktig røre i en sirkelbevegelse å dekke hele overflaten.
- Sted celler i en 37 ° C inkubator på 5% CO 2 i 8-10 dager før kolber nå confluency (> 95% plate dekning).
Merk: Flere protokoller har vist at når astrocyttene kommer confluency, mekaniske metoder, som skjelvende kulturen fra 2 til 24 h, fører til brøkdel av celler som ligger over disse astrocyttene, hovedsakelig microglia og forløper celler 19 , 20. - Ikke-astrocytic celler er redusert i kultur ved å utføre orbital rister på 180 rpm i 30 min. Etter fjerner celler i nedbryting, frisk media er pipetted i flasken (~ 15 mL).
- å eliminere oligodendrocyte stamfar celler, øke risting hastigheten til 200 rpm for 6 h 21 , 22 , 23, leveringstanken nedbryting og Pipetter frisk media.
Merk: Du kan redusere tilstedeværelsen av microglia i kulturer, to kjemiske metoder kan brukes sekvensielt (ikke samtidig) i primære celle kultur metodikk: Arabinose cytosine (Ara-C) og L-leucine methyl ester (LME) 24. - Umiddelbart når celler nå confluency (100%), 3-4 dager etter mekanisk fjerning av microglia, disse cellene kan behandles med 8 µM av den antimitotic sammensatte Arabinose cytosine (Ara-C) i DMEM i 5 dager (endre å frisk Ara-C i DMEM daglig).
Merk: Tidspunktet til Ara-C er viktig siden denne forbindelsen er en antimitotic stoff, som reduserer antall hurtig-dele celler som microglia 19 , 25 og fibroblaster 26 . I motsetning til microglia, når confluent, astrocyttene stoppe proliferating via kontakt hemming 27. - 2 dager for cellene å gjenopprette fra Ara-C behandling.
- å redusere microglial forurensning, når celler når confluency, bruke 50 mM av L-leucine methyl ester (LME) i DMEM fast ved pH 7.4, 1t på 37 grader.
Merk: LME krysser membran av celler og organelles, og etter som hydrolyzed, L-leucine produsert akkumuleres i lysosomer til disse cellene. Akkumulering av denne aminosyren fører til en osmotisk hevelse og ruptur av lysosomer 28 , 29. LME er svært effektiv på å fjerne microglia, forhold til andre celler 20 , 30.
4. Dyrke astrocyttene i 6-vel plater
- belegg coverslips med poly-D-lysine
- sette en dekkglassvæske i hver 35 mm Petriskål, deretter legge til 100 µL av utvannet Poly-D-Lysine løsningen hver dekkglassvæske og vente 1 h.
- Fjerne Poly-D-Lysine og vask to ganger med 2 mL sterilt vann.
- Fjerne vann og vente på coverslips tørke i panseret. Lagre coverslips på 20 ° C i opptil to uker.
Merk: Fryse utvannet Poly-D-Lysine løsningen; Det kan lagres i opptil to uker.
- Trypsinization
- bruker en Pasteur pipette, Sug opp mediet i flasker. Legge til 5 mL/kolbe av sterile-filtrert PBS forsiktig skylle cellene.
- Leveringstanken av PBS, og deretter legge til 5 mL/kolbe av sterile-filtrert 0,25% Trypsin og 0,5 mM EDTA løsning. Plasser kolbe i de 37 grader, 5% CO 2 inkubator for 10 min.
Merk: Mens cellene er incubating, varme 5 mL/bolle med fersk fullstendig DMEM på 37 ° C. - Etter 10 min inkubasjon agitere for å sikre at alle cellene er løftet av flasken. Raskt legge til 5 mL av varm fullstendig DMEM til hver kolbe, å nøytralisere trypsin.
- Forsiktig Pipetter cellene opp og ned flere ganger for å bryte opp noen " klumper ". Overføre suspendert celler fra to flasker slik 15 mL konisk sentrifuge.
- Sentrifuge for 5 min på 200 x g å samle celle pellets. Å avbryte pellet 500 µL av medium og fortsetter å plassere cellene i kolber.
Merk: Eksempler på analyser gjøres med cellene: 1) omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) til å analysere genuttrykk; 2) Western blot evaluere protein uttrykk. 3) flyt cytometri analyse å tallfeste antallet nevrale stamceller og proteiner steder. 4) immunofluorescence å analysere protein uttrykk og lokalisering.
- Såing astrocyttene
- etter behandling av av primære astrocyttene med trypsin (se 4.2), samle 100 μL celle suspensjon i en 1,5 mL microcentrifuge rør og tilsett 100 μL av 0,5% trypan blå.
- Legge til 10 μL samlet suspensjon i trypan blå til hemocytometer og telle alle cellene som er levedyktig.
- Bruke formlene i trinn 3.3 for å beregne tettheten av cellene før du tilbereder kolber.
- Forbered flere brønnen retter ved å legge en steril, poly-D-Lysine belagt dekkglassvæske i hver brønn. Pipetter 50.000 cellene og fylle resten av volumet i hver multi godt rett med fersk medium (ca 2 mL).
- Plassere flere godt retter i 37 grader inkubator på 5% CO 2, og etter 5-7 dager, astrocyttene kan vokse og dekker hele overflaten av coverslips.
5. OGD-protokoll for primære astrocyttene
- OGD middels forberedelse
- Supplement Dulbecco ' s endret Eagle ' s medium uten glukose med 3,7 finans natriumbikarbonat og 1% Penicillin/Streptomycin. Se materialer i Tabell 4.
- Tømming 20 mL av glukose gratis mediet av bobler med 95% N 2 / 5% CO 2 i 10 min på en strøm av 15 L/min (angitt med flyt meter) ved å sette inn en serologisk pipette gass systemet i medium.
Merk: Etter fjerner mediet av oksygen, justere pH på 7,4 (se oppmerksom på trinn 2.1). - Filtrerer tømte glukose uten mediet bruker en 50 mL tube filtersystem.
Merk: Gjør frisk OGD medium for hver eksperimentet bobler med 95% N 2 / 5% CO 2 før du bruker, slik at cellene blir utsatt for et miljø renset oksygen.
- Eksperimentelle prosedyren
- i vev kultur panseret, fjerne astrocytter media fra tidligere forberedt coverslips (se trinn 4.3.5) og vask med cellular PBS to ganger for å fjerne alle glukose på cellene.
- Legge 2 mL OGD media hver godt og plassere flere godt retter i hypoksi kammeret med deres lokk av
- Koble gass blandingen til inngangen ventilen og la Avslutt ventilen åpen. Tømme kammeret med gassblanding av 95% N 2 / 5% CO 2, på 15 L/min for 5 min.
- Stoppe gasstrømmen, først lukke klemmen på exit valve, og Lukk klemmen på gass inngangen ventil slangen.
Merk: Kontroller det er null gasslekkasjer ved å dekke segl kammeret med såpevann. Hvis selen er sikker, ingen bobler bør danne. - Plasser kammeret i celle kultur inkubator på 37 ° C 1t eller 6 h i OGD.
- Etter inkubasjon tid er over, Sug opp OGD media og nøye Pipetter 2 mL fullstendig DMEM til hver 4,67 cm 2 for normoxic behandle 24 h.
6. Protokoll for primære astrocytter Immunofluorescence forberedelse
Merk: for å vurdere astrocytter renhet, ulike hjernecelle typer som nerveceller, microglia og oligodendrocytes kan oppdaget av immunofluorescence bruker ulike celle markører. Spredning markører, PCNA og propidium iodide (PI) kan brukes på primære astrocyttene utsatt for OGD etterfulgt av normoxic forhold. Se materialer i Tabellen of Materials.
- Immunofluorescence forberedelse
Merk: dette er en generell immunofluorescence protokoll, mindre endringer kan utføres for å oppnå en optimal signal (f.eks, lengre inkubasjon perioder, inkubasjon temperatur). Hver indikator fra tabell 1 kan brukes ifølge produsenten ' s-protokollen.- å vurdere celle levedyktighet, celler kan være ruges i 5 min på 37 ° C med PI (5 µM i fullstendig DMEM) og vask to ganger med 2 mL PBS for 5 min. celler som viser PI flekker er mindre levedyktig.
Merk: Bruk cellene behandlet i trinn 5.2.6. - å fastsette celler etter PI legge 2 mL 4% formalin per 4,67 cm 2 Vel, for 20 min på 4 grader. For prøver merket med PCNA, den foretrukne fikse løsningen er metanol i 10 min på 4 grader.
Forsiktig: Formalin og metanol er giftig.
Merk: Sjekk alltid spesifikt antistoff protokoller fra hvert firma. - Vask celler med 2 mL PBS i 5 minutter og gjenta dette 3 ganger.
- Ruge celler i blokkering løsning (0,5% ikke-ioniske surfactant, 10% FBS i PBS) i 30 min ved romtemperatur med mild risting.
- Vask cellene med 2 mL PBS i 5 min, gjenta vask 3 ganger.
- Ruge på 4 ° C over natten (16 h), med primær antistoff (PCNA, GFAP) i en løsning av 1% FBS i PBS.
- Fjerne den primære antistoff løsningen, vaske cellene med 2 mL PBS i 5 minutter og gjenta dette 3 ganger.
- Incubate med sekundær antistoff konjugert med fluorophore i en løsning av 1% FBS i PBS, 1t, ved romtemperatur.
- Vask cellene med 2 mL PBS i 5 min, Gjenta dette 3 ganger. Legge 1 µg/mL av DAPI (4 ', 6 ' - diamidino - 2-phenylindole) i 5 min stain celle atomkjerner.
- Vask celler med 2 mL PBS 5 minutter, Gjenta dette trinnet to ganger og holde i PBS.
- Forberede coverslips på et mikroskop lysbilde ved hjelp av montering medium.
- å vurdere celle levedyktighet, celler kan være ruges i 5 min på 37 ° C med PI (5 µM i fullstendig DMEM) og vask to ganger med 2 mL PBS for 5 min. celler som viser PI flekker er mindre levedyktig.
- AC confocal mikroskop
- etter definerer mikroskopet, plasserer dekkglassvæske siden ned på mikroskopet scenen.
- Bruke programvaren og velg en laserstråle mot 543nm for GFAP-Cy3 konjugert antistoff.
7. Celle levedyktighet analysen
- Trypsinize og kvantifisere astrocyttene ved å følge trinn 4.3 og 4.4.
- Legge til 1 x 10 4 celler/godt i 96-brønnen plater og vokse dem til confluency.
- Bruker methodology fra trinn 5, utsette kulturperler 96-brønns platene til enten normoxic 1t OGD eller 6 h OGD.
- Etter OGD behandling, normoxic media legges til alle celler for 24t og levedyktighet måles med MTT reagens analysen (bruk som produsent ' s instrukser tilsier).
- Fra en 5 mg/mL MTT løsning, legge til 10% av det totale volumet i hver brønn og ruge for 3t på 37 grader med MTT reagensen.
- Fjerne media og resuspend krystaller med 200 µL dimethyl sulfoxide. Lese platen i et spektrofotometer på 570 nm.
Merk: En redusert absorbansen i forhold til kontrollen celler vil koordinere med mindre levedyktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En av de største bekymringene primære astrocytic kultur er tilstedeværelsen av andre celler som nerveceller, oligodendrocytes, fibroblaster og microglia. I figur 1, isolerte celler fra rotte halvdelene hadde media endringer hver 3 dager og var enten ubehandlet eller behandlet med lagt LME for 1 h. 24 timer senere, celler var immunostained for GFAP og counterstained med DAPI. Ubehandlet celler viste gjennomsnittlig 39% ikke-GFAP positiv celler, mens LME-behandlet celler viste 8%. Disse resultatene viser hvordan LME behandling og media endre effektivt redusert ikke-GFAP positiv celler ved 4.75 fold, produsere en beriket astrocytter kultur. For å fastslå om 1t eller 6 h OGD påvirker astrocytter levedyktighet etter denne metodikken, viser figur 2 en MTT analysen av astrocytter kulturer, 24 timer etter fornærmelse. Ingen signifikant forskjell i levedyktighet ble funnet i alle forhold, viser at begge ganger kan brukes til å studere astrocytter reaktivitet. Celle spredning er en av effektene utløst av OGD i astrocyttene. Voksende celle kjernefysiske antigen (PCNA) i Figur 3 økte fra 10% i normoxic celler, 30% etter 1 h OGD, viser den forventede i vivo astrocytic svar15. Endelig ble astrocyttene utsatt for 6 h OGD etterfulgt av 24 h normoxic forhold. Etter denne tid, ble immunofluorescence mot GFAP utført. OGD-eksponerte celler ble sammenlignet med astrocyttene under normoxic forhold. Astrocyttene uten OGD viser tradisjonelle stellate morfologi (figur 4A) mens celler som gjennomgikk OGD tydelig presentere den karakteristiske hypertrofi av reaktive astrocyttene (figur 4B). Denne hypertrofi kan visualiseres i tilsvarende differensial forstyrrelser kontrast (DIC) bildet av kortikale rotte astrocyttene under normoxic og OGD forhold (figur 5).
Figur 1 . Immunofluorescence å godkjenne primære kortikale rotte astrocyttene kultur renhet GFAP og DAPI. (A) den venstre side representerer GFAP positivt celler (rød), midtre panelet viser kjerner (DAPI, blå), og det høyre panelet flettede bilder av ikke-LME-behandlet (øvre panel) og LME-behandlet (nedre panel) celler. Hvite pilene viser ikke-GFAP-positiv farget celler. (B) kvantifisering av ikke-GFAP positiv kjerner i LME og ikke-LME behandlet celler. En kort t-test ble utført (p < 0,0001) feilfeltene representerer gjennomsnittet med SEM. skala barer representerer 50 mikron og bildene ble tatt på 20 x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Levedyktighet analysen av astrocyttene med 24 h eksponering OGD. Astrocyttene ble dyrket i 96-brønnen plater og utsatt for normoxic, 1 h OGD eller 6 h OGD forhold. Etter behandling, celler ble lagt til normoxic medier for 24t og levedyktighet ble målt ved hjelp av MTT analysen. Absorbansen 570 nm viser cellen levedyktigheten til OGD-eksponert cellene i kultur i forhold til celler i normoxic forhold. Dataene ble analysert med enveis ANOVA (p = 0.9669) og presentert med feilfelt som representerer gjennomsnittet med SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Spredning i rotte astrocyttene øker ved eksponering til oksygen og glukose deprivasjon og kan oppdages ved hjelp av PCNA som en markør. (A) venstre representerer PCNA positive celler (grønn), midtre panelet viser kjerner (DAPI, blå), og det høyre panelet viser flettede bilder av normoxic celler (øvre panel) og 1 h OGD behandlet celler (nedre panel). (B) prosent av PCNA positive celler i normoxic versus OGD behandlet celler. En unpaired-test ble utført (p < 0,0001) feilfeltene representerer gjennomsnittet med SEM. skala barer representerer 50 mikron og bildene ble tatt på 20 x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Uttrykk av Glial Fibrillary Sure Protein (GFAP) konjugert med Cy3 i primære rotte kortikale astrocytter kultur. (A) astrocyttene i et normoxic miljø show karakteristiske stellate morfologi. Derfor protein, GFAP, fyller cellen legemer og strekker seg inn i tynne cytoplasmatiske prosesser. (B) etter 6 h OGD eksponering astrocyttene vedtatt en hypertrofisk morfologi. Skalaer representerer 20 mikron og bildene ble tatt på 40 x forstørrelse i en AC confocal mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Kortikale rotte astrocyttene under normoxic og oksygen-glukose deprivasjon. Immunofluorescence av astrocyttene under normoxic forhold (øvre venstre panel) eller 6 h OGD (nedre venstre panel), beiset med en Cy3-konjugerte antistoffer mot GFAP. Tilsvarende differensial forstyrrelser kontrast (DIC) bildet vises på det høyre panelet. Skala linjen representerer 20 mikron og bildene ble tatt på 20 x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Formål | Antistoff/indikator | Beskrivelse |
| Astrocytter kultur validering | IBA-1 | Oppdager microglial celler |
| NeuN | Identifiserer modne nerveceller | |
| Olig1 | Oppdager moden oligodendrocytes | |
| Olig2, NG2 | Oppdager oligodendrocyte forløper celler | |
| GalC | Identifiserer umodne eller eldre oligodendrocytes | |
| Spredning | PCNA | Binder p36 protein, uttrykt på høye nivåer i voksende celler |
| Cellen levedyktighet | Propidium iodide (PI) | Binder seg til DNA, denne indikatoren viser mangel på cellen levedyktighet |
Tabell 1. Liste over reagenser brukes stain ulike typer celler og mobilnettet prosesser
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver isolering av astrocyttene fra rotte halvdelene. I denne metoden er det viktig å redusere forurensningen med andre cellulære typer som microglia, oligodendrocytes og fibroblaster. Flere tiltak kan iverksettes for å redusere antall microglia,: endre media, orbital risting og kjemiske behandlinger. Når kultur renhet er bekreftet av immunofluorescence bruke selektiv mobilnettet markører eller fremste celle forurensninger, kan eksperimenter utføres. Antistoff mot ionisert kalsium bindende adapter molekylet 1 (Iba-1) kan for eksempel brukes til å oppdage microglia. Neuronal død starter tidlig i kultur og disse cellene er eliminert med oligodendrocyte precursor celler (OPCs) etter kolbe tappe og media endre på dag 331. Oligodendrocytic forløper celler kan identifiseres ved hjelp av antistoffer som olig2 eller NG2. GalC kan brukes til å identifisere umodne eller eldre oligodendrocytes, men på dette stadiet kultur dette er usannsynlig å bli funnet. Alternativt, ikke-GFAP positiv celler kan kvantifiseres og miljøgifter kan estimeres. Denne siste metoden skille ikke mellom de aktuelle cellene, men vil være en raskere og mer økonomisk metode for å finne ut prosentandelen av ikke-astrocytic celler i kulturen.
Når en astrocytter beriket kultur er produsert, kan OGD eksperimenter utføres for å studere astrocytter reaktivitet. Fjerne en løsning med nitrogen av bobler å erstatte oksygen er en brukte protokollen32. I vår metodikk bruker vi den boblende metoden for å tømme oksygen med nitrogen gass (95% N2, 5% CO2) til glukose-gratis media på en strømningshastighet på 15 L/min, i 10 min, for et totalt volum på 0.025 L. For å bekrefte at oksygen er renset, målt vi oksygen konsentrasjon igjen i media med en oksygen måler for væsker og luft. Oksygen konsentrasjon igjen i media etter sletting for 10 min redusert fra 7.9 mg/L til 0,3 mg/L. For å finne ut hvor lenge kammeret må slettes for å erstatte oksygen, tømmer med N2 ble utført med ikke mindre enn kammer produsentens forslag (20 L/min, 2-5 minutter). Etter 5 min av purging på 15 L/min, var oksygen konsentrasjon igjen i kammeret 0%. Andre metoder som bruker lignende chambers har renset på en 8-20 L/min infusjonshastigheten og for 5-10 min å erstatte luften oksygen med nitrogen33,34.
Som andre cellulære modeller, OGD har begrensninger og resultater bør fortolkes med forsiktighet. OGD kan være skadelig for nerveceller, men astrocyttene kan tåle disse forholdene for opptil 24 h35. En annen begrensning er at astrocyttene er isolert i dette systemet, mangler signalene fra andre celler. En måte å løse denne begrensningen er å bruke betinget medier fra andre celler under samme iskemiske-lignende forhold. Alternativt kan cytokiner eller andre faktorer legges til media etter OGD36.
En alternativ metode å studere virkningene av energi mangel i celler, er å legge ouabain til media. Denne forbindelsen hemmer hovedsakelig natrium/kalium pumpen, som reduserer intracellulær produksjon av ATP, ligner på effekten av OGD37,38. Denne metoden har imidlertid ulempen at alle dets mekanismer ikke er fullt ut forstått og medfører off-målet effekter, som introduserer variablene som utgjør en urealistisk iskemiske hjerneslag scenario.
Oppsummert er metoden OGD en isolert celle-system som tillater oss å teste direkte effekten av ulike astrocytic narkotika mål i vitro som kunne bidra videre til neuroprotection. Det gir også et verktøy for å studere grunnleggende astrocytter biologi. Denne modellen kan lage et sterkt grunnlag av bevis for å rettferdiggjøre eksperimentelle forhold for utvikling av narkotika ved hjelp av en i vivo modell av slag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Paola López Pieraldi for teknisk assistanse. A.H.M. er takknemlig for tilskudd 8G12MD007600 og U54-NS083924 som støttes av denne publikasjonen. Vi takker NIH-NIMHD-G12-MD007583 stipend for anlegget støtte. D.E.R.A. er takknemlig for fellesskap av NIHNIGMS-R25GM110513. Vi er takknemlige for bruk av vanlige instrumentering og ved hjelp av Dr. Priscila Sanabria for bruk av optisk Imaging anlegg av programmet RCMI ved å gi G12MD007583. I tillegg ønsker vi å takke Jose Padilla for sin enestående rolle i filming og redigering visual protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments for Surgery - Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation - step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture - step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation - step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence - step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody. |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody. |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining. |
| Confocal microscope | Olympus |
References
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscience. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
