Adipositas-afgeleide stromale cellen kunnen nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuw weefsel uit de eigen cellen van een patiënt. We presenteren een protocol voor de isolatie van een subpopulatie van humane adipositas-afgeleide stromale cellen (ASC's) met een verhoogd osteogeen potentieel, gevolgd door toepassing van de cellen in een in vivo calvariaal genezingsassay.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Invasieve kankers, ernstige verwondingen en infecties kunnen botdefecten veroorzaken die te groot zijn om te worden gereconstrueerd met bestaand bot uit het eigen lichaam van de patiënt. De mogelijkheid om bot de novo te laten groeien met behulp van de eigen cellen van een patiënt, zou het mogelijk maken om botdefecten te vullen met adequaat weefsel zonder de morbiditeit van het oogsten van eigen bot. Er is interesse in het gebruik van vetafgeleide stromale cellen (ASC's) als bron voor weefsel engineering omdat deze worden verkregen uit een overvloedige bron: het eigen vetweefsel van de patiënt. Echter, ASC's zijn een heterogene populatie en sommige subpopulaties kunnen effectiever zijn in deze toepassing dan andere. Isolatie van de meest osteogene populatie van ASC's zou de efficiëntie en effectiviteit van een bot engineering proces kunnen verbeteren. In dit protocol worden ASC's verkregen uit subcutaan vetweefsel van een menselijke donor. De subpopulatie van ASC's die de marker BMPR-IB tot expressie brengt, wordt geïsoleerd met behulp van FACS. Deze cellen worden vervolgens toegepast op een in vivo calvarial defect genezingstest en het wordt gevonden dat ze een verbeterd osteogeen regeneratief potentieel hebben in vergelijking met ongesorteerd cellen.
Inleiding
Grote botdefecten als gevolg van letsel, infectie of invasieve kanker hebben een aanzienlijke invloed op het herstel en de kwaliteit van het leven van een patiënt. Technieken bestaan om deze gebreken gezond bot vulling van elders in lichaam van de patiënt, maar deze overdracht draagt zijn eigen morbiditeit en risico van complicaties 1, 2, 3. Bovendien zijn sommige gebreken zo omvangrijk of complex die voldoende donorbot beschikbaar is om het defect te vullen. Protheses zijn een mogelijke optie voor het vullen van botdefecten, maar deze zijn geassocieerd met een aantal nadele....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Monsters werden verkregen van patiënten die geïnformeerde toestemming gaf. Alle protocollen zijn beoordeeld en door de passende Stanford University Institutional Review Board goedgekeurd. Terwijl de behandeling van menselijke weefsels en cellen, altijd houden aan Biosafety Level 2 (BSL2) voorzorgsmaatregelen, zoals gespecificeerd door uw instelling.
1. Bereiding van reagentia
- Bereid FACS-buffer: Voeg 10 ml FBS, 5 ml Poloxameer 188 en 5 ml Pen-Strep tot 500 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Bereid verteren mengsel: Voeg 0,375 g C. hemolyticum collagenase type II poeder en 5 ml Poloxame....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Micro CT scan uitgevoerd op de dag van de operatie zal duidelijk de schedel defect. Op dit moment is er geen ingroei in de 4 mm defect. Latere scans worden verkregen in de tijd om de grootte van het defect kwantificeren in tijd ten opzichte van de basislijn. Defecten geënt met BMPR-IB + cellen moeten aantonen snellere sluiting van het defect vergelijking met BMPR-IB en gesorteerde cellen (Figuur 5). Bovendien kan het deel van de schedel dat het defect wordt ontkalkt en v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen in het protocol
Tijdens de oogst van ASC, de kritische stap is voldoende vertering van vet met collagenase. Onvoldoende vertering leidt tot een lage opbrengst van ASC. Tijdens FACS sortering van BMPR-IB + cellen, is het belangrijk om de poort zorgvuldig definiëren positiviteit. Het definiëren poorten te los kan resulteren in gesorteerde populaties die niet zuiver zijn. Tijdens het maken van de calvarial defect, is het essentieel om het defect te boren door het bot van de sched.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen onthullingen te doen.
Dankbetuigingen
C.D.M. werd ondersteund door de American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. werd ondersteund door de California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L. en M.T.L. werden ondersteund door de American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. werd ondersteund door NIH grant R01 GM087609 en een schenking van Ingrid Lai en Bill Shu ter ere van Anthony Shu. H.P.L. en M.T.L. werden ondersteund door het Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine en The Oak Foundation. M.T.L. werd ondersteund door NIH grants U01 ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100 micron celzeef | Falcon | 352360 | |
| 15 mes scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 wellsplaat | Corning | 3524 | |
| 40 micron celzeef | Falcon | 352340 | |
| 50 mL konische centrifugeerbuisjes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon hechtdraad, 18", P-3 naald, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primaire antilichaam | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI chirurgische handschoenen | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorfine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo naaldhouder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 naakte muis | Charles River | 086 | |
| Collageenase Type II poeder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM-medium | Gibco | 10564-011 | |
| Boor: Circulaire mes 4,0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Boor: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand absorberende onderlaag, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand steriele katoengaas, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Verwarmingspad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS-medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isofluraand | Henry Schein | 050033 | |
| Microtang met tanden | Roboz | RS-5150 | |
| Microtang met tanden | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffine film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA-scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined steriele werkveld, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Snij een rechthoekig gat van de juiste grootte |
| Polysucrose-oplossing: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidon-jood voorbereidingsoplossing | Medline | MDS093944H | |
| Puralube vaseline oogzalf, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC-lysebuffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prepoepstukjes | Covidien | 6818 |
Referenties
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
