Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması
Bu makalede
Özet
Özet
Çentik sinyali, çoklu fizyolojik ve patolojik süreçlerin önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, Notch sinyalizasyonunun doğası, değişen ve bazen çelişkili rollerinin in vitro olarak araştırılmasını bir zorluk haline getirir. Plazma zarına bağlı hem reseptörler hem de ligandlar ile doğrudan hücre-hücre iletişiminin bir bileşeni olarak, Notch sinyali, diğer birçok sinyal yolunda olduğu gibi, kültür ortamına ligandların basit bir şekilde eklenmesiyle in vitro olarak aktive edilemez. Bunun yerine, Çentik ligandları hareketsiz bir durumda hücrelere sunulmalıdır.
Notch sinyal aktivasyonu yöntemlerindeki farklılıklar, kültürlenmiş hücrelerde farklı sonuçlara yol açabilir. Özellikle osteoklast öncülerinde, Notch stimülasyonu ve osteoklast öncü kültürü ve farklılaşması yöntemlerindeki farklılıklar, Notch sinyalinin osteoklast farklılaşmasının pozitif mi yoksa negatif bir düzenleyicisi mi olduğu konusunda anlaşmazlığa yol açmıştır. Farklı Notch stimülasyon koşulları altında osteoklast farklılaşmasının in vitro ve genetik modellerde daha yakın karşılaştırmaları, Notch sinyali ve osteoklastlar ile ilgili tartışmayı büyük ölçüde çözmüş olsa da, kültürlenmiş hücrelerde Notch sinyalinin sürekli ve geçici olarak uyarılması için standartlaştırılmış yöntemler gelecekte bu tür tutarsızlıkları önleyebilir.
Bu protokol, özellikle kültürlenmiş fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalini uyarmak için iki yöntemi tanımlar, ancak bu yöntemler küçük ayarlamalarla herhangi bir yapışık hücre tipine uygulanabilir olmalıdır. İlk yöntem, Notch sinyalinin sürekli olarak uyarılmasını sağlar ve hücrelerin tohumlanmasından önce Notch ligandının bir doku kültürü yüzeyine hareketsiz hale getirilmesini içerir. Agaroz boncuklara bağlı Notch ligandını kullanan ikincisi, zaten bir kültür yüzeyine yapışmış hücrelerde Notch sinyalinin geçici olarak uyarılmasına izin verir. Bu protokol aynı zamanda osteoklast öncülerinde Notch aktivasyonunu tespit etmek için yöntemlerin yanı sıra Notch sinyal aktivasyonunun temsili transkripsiyonel belirteçlerini de içerir.
Giriş
Memeli Çentik sinyal yolu, Drosophila melanogaster, aynı yol homolog olan dört transmembran Çentik reseptörleri (Notch1-4) ve sivri (JAG1 ve JAG2) Delta-benzeri (DLL1, 3 beş zara bağlı ligand içerir ve 4) aileleri 1. Bir alıcı hücreye Çentik alıcısı bir iletim hücresi 2 ligandı ile bağlı olduğunda, Çentik sinyal başlatılır. Bu şekilde trans-aktivasyon sırasında zara bağlı Çentik ligand zara bağlı Çentik alıcısı 3, 4 üzerinde bir germe kuvveti üretir. bağlayıcı ligandın germe kuvveti presenilin-içeren y-sekretaz kompleksi (γ-sekretaz) tarafından aracılık....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
omurgalı hayvanları da içeren tüm araştırma Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde gerçekleştirildi.
1. Kültür Medya Hazırlık
- Ve 100 ml ısı, 900 mi, H2O içinde en az temel ortam (MEM) tozu ve 1.9 g sodyum bikarbonat çözülmesiyle α-MEM hazırlanması ve 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ile takviye inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu. 0.22 mikron polyethersulfone (PES) filtre kullanarak sterilize edin.
- 35 ng α-MEM ilave makrofajın orta hazırlayın / ml rekombinant fare makrofaj kolon....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yöntemin amacı, kültürüne ve osteoklast öncüleri olarak Notch sinyali uyarır. Düzgün kültürlenmiş, osteoklast ön-maddeleri düzgün bir sitoplazma (Şekil 1A) ile esas olarak uzunlamasına aks-benzeri morfolojiye sergiler. Bakım osteoklast öncülerinin immünolojik aktivasyon önlemek için alınmalıdır. Aktivasyonu üzerine, ön-yayılmış ve köpüksü sitoplazma (Şekil 1B) basık hale gelir. Bu "kızarmış yumurta" hücreler SIRA sinyalizasyon dayanıklıdır v.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
protokolü içinde kritik adımlar
Kültür ve osteoklast ön-maddeleri arasında nitro farklılaşmasında osteoclastogenez ve kemik rejenerasyonu ve kemik kütlesinin korunması için terapötik hedeflerin tanımlanması moleküler mekanizmalarının incelenmesi için yararlı bir platform sağlar. Fare osteoklast öncülerini kültürlerken, en kritik unsur, bir naif bir durumda öncüleri bakımıdır. makrofaj-benzeri hücreler olarak, osteoklast ön-maddeleri, bakteriyel bileşenler ve pro-inflamatuar sitokinlere.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Pennsylvania Üniversitesi Kas-İskelet Sistemi Bozuklukları Merkezi (5 P30 AR050950-09), AO Vakfı'ndan (S-16-12A), Philadelphia VA Tıp Merkezi Translasyonel Kas-İskelet Araştırma Merkezi'nden bir hibe ve intramural ortopedik cerrahi bölümü araştırma geliştirme fonu tarafından desteklenmiştir. JWA, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Kurumsal Araştırma ve Kariyer Geliştirme Ödülü (IRACDA; 5 K12 GM081259-08) tarafından finanse edilen Pennsylvania Üniversitesi Araştırma ve Öğretimde Doktora Sonrası Fırsatlar (PENN-PORT) bursu tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Rekombinant fare M-CSF | Biolegend | 576402 | Birden fazla tedarikçiden temin edilebilir, deneylerden önce test aktivitesi |
| Rekombinant fare RANKL | Shenandoah Biyoteknoloji | 200-04 | Birden fazla tedarikçiden temin edilebilir, deneylerden önce test aktivitesi |
| Rekombinant insan Jagged1-Fc | R& D Sistemleri | 1277-JG-050 | Birden fazla tedarikçiden temin edilebilir, deneylerden önce test aktivitesi |
| Protein G agaroz boncukları | InvivoGen | jel-agg-2 | |
| Keçi anti-insan IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Esansiyel Orta toz | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase hücre ayrışma reaktifi | ThermoFisher | A1110501 | Osteoklast öncülerini kaldırmak için kullanılır |
| Asit fosfataz, Lökosit (TRAP) Kiti | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Diferansiye osteoklastları boyamak için kullanılır |
Kaynaklar
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
