Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem
Bu makalede
Özet
Özet
Tüberkülozun (TB) etkeni olan Mycobacterium tuberculosis, tüm dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir. Çoklu ilaca dirençli TB'NIN (MDR-TB) artan yayılımıyla birlikte, M. tuberculosis enfeksiyonlarına karşı yeni terapötik stratejiler geliştirmek için gerçek bir aciliyet vardır. Geleneksel olarak, bileşikler, et suyunda in vitro büyüme koşulları altında antibakteriyel aktivitelerine göre değerlendirilir; bununla birlikte, M. tuberculosis gibi hücre içi patojenler için sonuçlar genellikle yanıltıcıdır, çünkü et suyu içi fenotipik tarama koşulları insan vücudundaki gerçek hastalık koşullarından önemli ölçüde farklıdır. Makrofajların içinde çalışan inhibitörlerin taranması, M. tuberculosis'in karmaşıklığı, enfeksiyondaki değişkenliği ve yavaş replikasyon hızı nedeniyle geleneksel olarak zor olmuştur. Bu çalışmada, bir makrofaj enfeksiyonu modelinde bileşiklerin M. tuberculosis'in canlılığı üzerindeki etkinliğini hızlı bir şekilde değerlendirmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz. Bir sitotoksisite testi ve bir et suyu içi M. tuberculosis canlılık testinin bir kombinasyonunu kullanarak, ilgilenilen bileşiklerin kapsamlı bir analizini üreten bir tarama sistemi oluşturabildik. Bu sistem, çoğu laboratuvarın ulaşabileceği düşük bir maliyetle nicel veriler üretme yeteneğine sahiptir ve yine de büyük endüstriyel ortamlara uyacak şekilde yüksek düzeyde ölçeklenebilir.
Giriş
Mycobacterium tuberculosis, Tüberküloz (TB) neden olan madde, dünyada morbidite ve mortalitenin başlıca nedenidir. İlaç duyarlı TBC 6 aylık bir süre için birden fazla antibiyotik gerektiren tedavi edilebilir bir hastalıktır. Tedavi edilebilen bir hastalık olmasına rağmen, TBC ölüm 2015 1 1.5 milyon olarak tahmin edilmiştir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde, ilaca dirençli M. tuberculosis yaygınlığı kaygıları var artmaktadır. Ilaca dirençli TB (MDR-TB), en azından isoniazid (INH) ve Rifampisin (RMP), ve en çok MDR-TB kökler böylece tedavi seçenekleri sınırlayıcı ikinci satırı TBC ilaçların seçilmesi de dirençlidir dirençli TB olarak t....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Bakteriyel soyun ve Gelişim Ortamı
- büyükbaş hayvan serum albümini, 25 g dekstroz, 10.0 g, deiyonize su, 460 mL sodyum klorür, 4.05 g çözündürülmesi ile albümin dekstroz ve tuz stok çözeltisi (ADS) konur. 4 ° C'de ADS ve mağaza Filtre sterilize.
- 7H9 toz, 4.7 g ve arıtılmış suyun 900 mL gliserol 2 ml ilave edilerek 7H9 suyu olun. 10 dakika boyunca 121 ° C 'de 7H9 suyu Otoklav ve devam etmeden önce, oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. ADS 100 mL ve 7H9 suyu 900 mL Tween® 80, 0.5 mL ilave edilerek 7H9ADST olun. 4 ° C'de saklayın.
- kanamisin sülfat, 50 mg tartılır ve deiyonize su içinde 1 mL içinde çözülür; son konsantrasyo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Lüsiferaz genini M. tüberküloz kullanan yüksek çıktılı hücre içi tarama
Şekil 2A ve Tablo 1 luminometre ile toplanmış ham veriler, THP-1 hücreleri içinde M. tuberculosis ile TB ilaç rifampisin artan konsantrasyonunun etkisini gösteren, nispi ışık saçan birimleri (RLU) olarak ifade içerir. Şekil 2A, rifampisin, çeşitli konsantrasyonları için RLU ölçülen ham lümin.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmanın amacı, M. tuberculosis için bir insan hücre içi enfeksiyon modeli kullanılarak basit ve düşük maliyetli HTS yöntemini yaratmaktı. Tüberküloz, M. tuberculosis ile alveoler makrofajların enfeksiyonu ile karakterize edilen bir insan hastalıktır. Nedeniyle bio, bakteri ve konak hücrelerin hem biyolojik modellerini kapsayan araştırma, geçmişte kullanılmıştır. Ancak, vekil bakteri ve insan olmayan modellerin kullanımı ilaç tarama iyi M. tuberculosis 19,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bu çalışma için herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma BC Akciğer Derneği ve Mitacs tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamin | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson ve Şirketi | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albümin, Sığır pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dekstroz | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodyum Klorür | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamisin sülfat | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N, N< / em>- Dimetilformamid (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hidrokolorik asit (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Asetik asit | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Gliserol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu | TIB-202 | |
| M. tüberküloz H37Rv | |||
| 96 kuyulu düz tabanlı beyaz plaka | Corning | 3917 | |
| 95 oyuklu düz tabanlı şeffaf plaka | Corning | 3595 | |
| Şeffaf plaka kapatıcı | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spektrofotometre | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Mikroplaka spektrofotometresi | Biotek | Epoch | |
| luminometre | Uygulamalı | Biyosistemler Tropix TR717 |
Kaynaklar
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
