Summary
Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis, Tüberküloz (TB) neden olan madde, dünyada morbidite ve mortalitenin başlıca nedenidir. İlaç duyarlı TBC 6 aylık bir süre için birden fazla antibiyotik gerektiren tedavi edilebilir bir hastalıktır. Tedavi edilebilen bir hastalık olmasına rağmen, TBC ölüm 2015 1 1.5 milyon olarak tahmin edilmiştir. Geçtiğimiz 10 yıl içinde, ilaca dirençli M. tuberculosis yaygınlığı kaygıları var artmaktadır. Ilaca dirençli TB (MDR-TB), en azından isoniazid (INH) ve Rifampisin (RMP), ve en çok MDR-TB kökler böylece tedavi seçenekleri sınırlayıcı ikinci satırı TBC ilaçların seçilmesi de dirençlidir dirençli TB olarak tanımlanmaktadır . ilaç direnci etkilerini İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü (HIV) ile ko-enfekte hastaların tedavisi için daha büyük bir sorun oluşturabilir; 400.000 kadar hasta 2015 1 'de HIV ile ilişkili TB öldü. Hayal kırıklığıyla, ABD Gıda ve İlaç Dairesi'ninrasyon Son 40 yılda 2, MDR-TB, Bedaquiline karşı tek yeni TB ilacı onayladı. Daha iyi ve daha kısa TB terapileri bulmakta gelişmeler acilen TB ve MDR-TB ile mücadelede önde kalabilmek için ihtiyaç vardır.
Geleneksel olarak, TB ilaç ekranlar bileşiklerin artan bir kültüre ilave edilmiştir ve mikroorganizmalar yok etmek etkinlikleri katı ortam üzerinde koloni oluşturan birim (CFU) sayımı ile tespit edilir ve böylece büyüme ortamında in vitro büyüme koşulları altında gerçekleştirilir. CFU sayımları emek yoğun, zaman tüketen ve masraflı olduğu için, çeşitli dolaylı yöntemler bu sorunu hafifletmek için geliştirilmiştir. Bu yöntemler, Alamar Mavisi canlılığı deneyi 3, yeşil floresan protein (GFP) veya lusiferaz sentezleyen bakterilerden lüminesans 5'ten floresan 4 belirlenmesini ve toplam adenozin trifosfat tahmin (A içerirTP) 6, 7.
Tipik TB bakterileri bulunan ve alveoler makrofajlar 8 fagozomların içinde replike akciğer, bir M. tuberculosis enfeksiyonuna ile karakterize edilir. basit-et suyu fenotipik ekran hücre dışı patojenlerin uygun olabilir; Ancak tarihsel perspektifte, bu yöntem kullanılarak tespit M. tuberculosis bileşikler genellikle enfeksiyon modellerinde mansap doğrulama adımları sırasında beklentileri yaşamak için başarısız çarptı. Biz TB ilaç iyi bir intraselüler konakçı hücresi enfeksiyon modelinde yapılır öneriyoruz. Bununla birlikte, hücre içi modeller yüksek verimli tarama (HTS) gelişimine birçok teknolojik ve biyolojik engelleri sahiptirler. Büyük bir engel sayıda adımları ve yıkama-arasında hücre dışı bakteri ayrıntılı çıkarılması ile örneklenen, enfeksiyon süreci karmaşıklığıdır. İkinci büyük engel uzun zaman yeniden olduğunugerekliliklerine göre çıkarılabilirdir normal CFU kültür levhaları üzerinde sayılarak yapılır büyüme tespiti olarak tamamlamak için üzerinde 3 hafta süren bir işlemdir. CFU sayımları yerine bir çözüm floresan bakteri ile birlikte otomatik floresan mikroskobu tarafından sağlanmıştır. Ancak bu çözüm birçok araştırma laboratuvarları için ulaşamayacağı bir başlangıç ekipman yatırım gerektirir. Basit, düşük maliyetli ve hastalığa ilgili HTS yöntemi büyük ölçüde ilaç keşif sürecini artıracak.
Bu çalışmada, hücre içi M. tuberculosis bileşiklerin aktivitesini belirlemek için uygun bir hızlı ve yüksek ölçekli, ancak ekonomik, tahlil sağlamayı hedefleyen yeni modüler HTS sistemi bildirmektedir. (I), hücre içi, (ii) sitotoksisite, ve (iii) 'de-et suyu çorbası deneyleri: Bu sistem üç modülden oluşmaktadır. Birleştirilen Nihai sonuç işlevinin potansiyel modu için ek bilgi ile, bileşik özelliklerinin geniş kapsamlı bir açıklama sağlar. Bu scsistem reening ilaç sinerji 9 analizi de dahil olmak üzere etki modu hedef çeşitli bileşik kütüphaneleri, çeşitli projelerde kullanılmıştır, otofajinin 10 stimülasyonu ve M. tuberculosis inhibisyonu, hastalık oluşturma faktörü (yayınlanmamış) tarafından salgılanan. Eylem bilinmeyen modu bileşikleri ayrıca 11 incelenmiştir. Bu yöntemin bir tadil edilmiş bir versiyonu da, hücre içi, M. tuberculosis 11 karşı yeni bileşiklerin belirlenmesi için birinci tarama yöntemi olarak endüstriyel ortak tarafından kabul edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriyel soyun ve Gelişim Ortamı
- büyükbaş hayvan serum albümini, 25 g dekstroz, 10.0 g, deiyonize su, 460 mL sodyum klorür, 4.05 g çözündürülmesi ile albümin dekstroz ve tuz stok çözeltisi (ADS) konur. 4 ° C'de ADS ve mağaza Filtre sterilize.
- 7H9 toz, 4.7 g ve arıtılmış suyun 900 mL gliserol 2 ml ilave edilerek 7H9 suyu olun. 10 dakika boyunca 121 ° C 'de 7H9 suyu Otoklav ve devam etmeden önce, oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. ADS 100 mL ve 7H9 suyu 900 mL Tween® 80, 0.5 mL ilave edilerek 7H9ADST olun. 4 ° C'de saklayın.
- kanamisin sülfat, 50 mg tartılır ve deiyonize su içinde 1 mL içinde çözülür; son konsantrasyon 50 mg / mL'dir. Filtre ile sterilize edilir ve -20 ° C'de saklayın. 7H9ADST 1 L başına stok solüsyonu kanamisin 0.5 mL ekleyin.
Bu ortam, taze yapılmalıdır, bu nedenle kültür büyüklüğüne göre uygun hacimleri ölçek: NOT. - 7H'da M. tuberculosis büyütün9ADST kültüründe kanamisin ile takviye edilmiştir. Günlük kültürünü çalkalayın ve OD600 kümelenmeyi önlemek 1,0 ulaşmadan önce seyreltin.
NOT: Bu yöntemin geliştirilmesi için kullanılan, M. tuberculosis türü H37Rv pJAK2.A plazmid 12 ile transforme edilmiştir. pJAK2.A hsp60 promotörü 'dan ateş böceği lusiferaz geninin yüksek düzeyde ifade edilmesini sağlayan ve kanamisin kullanılarak seçilebilir pMV361 vektörü göre entegre bir plazmiddir.
2. THP-1 Orta ve Bakım
- RPMI tam olmayan ortam (yaklaşık% 10 FBS ve 2 mM glutamin) yapmak için ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve RPMI 1640, 500 mL, 200 mM L-glutamin, 5 mL, 50 mL ekleyin.
- Standart protokol 13 uyarınca bir THP-1 hücre kültürünün muhafaza edin. pas arasındaki ortamın mL başına 1 milyon 0.2 bir hücre yoğunluğuna korurken Kısaca, RPMI tam olmayan bir ortam içinde, THP-1 hücreleri büyütmekBilgeler.
3. Yüksek verim Hücre içi Eleme Lusiferaz ifade eden M. tuberculosis H37Rv'den kullanma
- 600 nm bir dalga boyunda bir spektrofotometre aktif olarak büyüyen bir bakteri süspansiyonu optik yoğunluk ölçülür. ML başına 0.1 OD600 = 3 x 10 7 bakteri dönüştürme faktörü kullanılarak bakteriyel yoğunluğa hesaplayın.
- Yeni bir santrifüj tüpü içine 1: enfeksiyon, 10 (MOI) bir çokluğu için yeterli bakterileri Pipet. 10 dakika boyunca 3000 x g'de Pelet ve sıvı aspire. RPMI1640 450 uL insan serumu, 50 uL ekleyin. Deney için değerleri uygun kaynaklarına hacmini Ölçek.
- Bakteri opsonize için,% 10 insan serumu içeren RPMI1640 500 uL başına 1 x 10 8 bakteri yoğunluğunda pelletini. Karışım 30 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkada bırakın. Bir hemasitometre ve ters mikroskobik ile sayma ile THP-1 hücre kültürü yoğunluğunun belirlemepe.
- 100 xg steril santrifüj tüplerinde pelet hücreleri ve 10 dakika için 37 ° C. Süpernatant aspire ve eksik mL için 1 milyon hücre yoğunluğunda RPMI hücreleri tekrar süspansiyon. 40 ng / ml nihai konsantrasyona, forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ekleyin.
NOT: Bu farklılaşma karışımı olarak anılacaktır. - 10 MOI'de THP-1 farklılaşma karışımı ile opsonize M. tuberculosis birleştirin: 1 ve bir 96-gözlü düz dipli beyaz plaka oyuk başına 100 uL nihai karışım kısım. Düzenli bütünlüğü sağlamak için karışım karıştırılır. Farklılaşma ve enfeksiyon,% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de gece boyunca devam izin verin.
- RPMI her 100 uL kuyular iki kere yıkayın. Eksik RPMI içinde arzu edilen konsantrasyonlara kadar seyreltildi bileşikler ilave edin ve 3 gün inkübe edilir.
- kuyu ortamı aspire. Her kuyuya lusiferaz deneme ayıracı 50 mcL ekleyin. t plakaları sızdırmazransparent yapışkan plaka ayırıcılar. 22 ° C'de inkübasyondan 5 dakika bekleyin, daha sonra 1 saniye bir luminometrede bir okuma elde etmek ile sabitleştirilir.
4. Sitotoksisite Analizi: 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromit (MTT) kullanılarak Deney 14
- RPMI içinde, THP-1 hücreleri ayırt eksik açık 96 oyuklu plakalar içinde PMA 40 ng / ml ile takviye edilmiştir. Hücre mL başına 1 milyon yoğunluğu ve kısım oyuk başına 100 uL koruyun. Farklılaşma,% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de gece boyunca devam izin verin.
- çukurlara eksik RPMI içinde seyreltilmiş bileşikler ekleme kuyulardan orta aspire edilmiş ve RPMI 1640 ile iki kez yıkayın. 3 gün boyunca inkübe.
- 5 mg / mL'lik bir stok çözelti yapmak için fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 100 mL MTT 0.5 g eritin. uzak ışık -20 ° C'de steril filtre ve depolamak; Bu çözüm, taze hale getirmek için en iyisidir.
- 2.5 saat beforE 3 günlük kuluçka süresinin sonunda, her bir göze MTT çözeltisi 25 mcL ve kuluçka dönemi doldurun.
- % 50 N hazırlanması, N-dimetil formamid (DMF), deiyonize su, 250 mL DMF, 250 mL karıştırılarak.
- aşağıdaki şekilde MTT ekstraksiyon tamponu hazırlayın: 500 mL'lik bir şişe içinde SDS 100 g tartılır ve% 50 DMF ve 300 ml. SDS ile erimesi için düşük ısı uygulayın. Saf asetik asit içinde 10 mL 1 M HCI 12.5 mL ekleyin. % 50 DMF ile 500 ml işaretine kadar doldurmak; ekstraksiyon tamponu nihai bileşimin% 50 DMF,% 20 SDS,% 2.5 asetik asit ve% 2.5 1 M hidroklorik asittir.
- Tedavi süresinin sonunda, her bir göze (herhangi bir kristallerin çözünmesi için 45 ° C'ye kadar ısıtıldı), öz çıkarma tamponu içerisinde 100 uL ilave edin. Karışım, 37 ° C'de gece boyunca inkübe izin verin % 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde ° C. 570 nm de absorbans okuyunuz.
NOT: sitotoksisite deneyi iyi bir hücreler arası paralel olarak gerçekleştirilirTHP-1 hücrelerinin, aynı kesikli ve yaş ile ular ekranı.
5. In-suyu Aktivite Analizi Bir Resazurin Deney 3 kullanma
- Orta log fazı (- 0.8 OD 600 ~ 0.5) 7H9ADST M. tuberculosis büyütün. 0.01 OD 600 7H9ADST ile kültür seyreltin. her bir her bir seyreltilmiş bileşik test konsantrasyonları ve kısım 100 uL 2x 7H9ADST bileşikleri seyreltin.
- Her kuyuya seyreltilmiş bakteri süspansiyonu 100 uL aktarın. Plakalar 5 gün için nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de kuluçkada bırakın. iyonu giderilmiş su ve steril filtre 100 mL resazurin 10 mg çözülür.
- 30 uL resazurin çözeltisi ekleyin ve 48 saat sonra renk değişikliği izlemek; Bakteri üremesi pembe mavi bir renk dönüşümü ile gösterilir.
NOT: nicel analizi de 530 eksıtasyonla 590 nm'de floresans, ya ölçülerek yapılabilir - 560nm ya da 570 nm 'de absorbans 600 nm ile 15 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lüsiferaz genini M. tüberküloz kullanan yüksek çıktılı hücre içi tarama
Şekil 2A ve Tablo 1 luminometre ile toplanmış ham veriler, THP-1 hücreleri içinde M. tuberculosis ile TB ilaç rifampisin artan konsantrasyonunun etkisini gösteren, nispi ışık saçan birimleri (RLU) olarak ifade içerir. Şekil 2A, rifampisin, çeşitli konsantrasyonları için RLU ölçülen ham lüminesans saçılma grafiğidir. Hata çubukları ortalamanın (SEM) standart hatasını gösterir. Şekil 2B, muamele edilmemiş gözlere kıyasla işlenmiş oyuklarda lüminesans yüzde azalmayı gösterir. Veri rifampisin 0.1 ug / mL'lik bir konsantrasyonda, hücre içi M.tüberkülozun RLU bir>% 99.9 azaltma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Bu previousl uygundury 0.1 ila 0.4 | ig / mL 16 arasında MIC yayınladı. Her bir kuyucuk üretilen Lüminesans M. tuberculosis ile ifade edilen toplam lusiferazın bir göstergesidir ve bu nedenle de iç M. tuberculosis metabolik durumunun göstergesidir. Ham lüminesan seviyeleri deneyler arasında değişir için normaldir. Bunun gibi, ham verilerin karşılaştırılması güvenilmez sonuçlar üretecektir. Bu nedenle, veriler yalnızca DMSO ile muamele edilen numuneler olacak belirli bir negatif kontrol karşısında normalize edilmesi gerekmektedir. M. yüzde azalma oyuklara (Şekil 2B) tuberculosis olarak elde edilen değerler, ifade edilebilir.
MTT tahlili kullanılarak sitotoksisite analizi
MTT deneyi, ökaryotik sitotoksisite için iyi bilinen bir deneydir. Bu kolorimetrik MTT (sarı) dönüştürülmesi yoluyla, canlı hücreleri belirtirmor renkli formazan.tuzuna. Bakteri bileşiklerin gözlemlenen zehirliliğini azaltan MTT, metabolize etme yetisine sahip olan, bu deney, bir M. tuberculosis enfeksiyonuna olmadan gerçekleştirilir. MTT analizi için yaygın bir öneri 570 nm at 17 emilmeden ötürü pH göstergesi fenol kırmızısı olmadan ortam kullanmaktır. Bununla birlikte, bu yöntemde tarif edildiği asidifiye ekstraksiyon tamponu 17, fenol kırmızısı neden olduğu girişimi en aza indirmek için mümkün olduğu.
Şekil 3, bir test bileşiği kodlanmış G1-1H artan bir konsantrasyonunun neden olduğu sitotoksisite göstermektedir. Normal olarak, bir% 50 inhibitör konsantrasyon (IC50), sitotoksisite düzeyini belirtmek için kullanılır. G1-1H durumunda, 10 uM, 3 uM konsantrasyonları IC50 konsantrasyonu oldukça altında bulunmaktadır.
In-et suyu etkinlik analizi bizeresazurin deneyi ing
Resazurin analiz genellikle ökaryotik hücrelerde sitotoksisite analizi için kullanılır, ama aynı zamanda suyu 3 canlı bakteri izlemek için kullanılabilir. Resazurin deney MTT deneyi benzer bir redoks tabanlı deneyidir. Bu resorufine, kırmızı fluorofor içine resazurin dönüşüm yoluyla NADPH seviyelerini ve NADPH dehidrogenaz aktivitesini ölçer. ilaç etkinliğini belirlemek için en kolay ve hızlı yolu kuyuları renkte mavi kalır düşük tedavi konsantrasyonu için bakmaktır. Şekil 4, M. tuberculosis ile dönüşüm resazurin antibiyotik apramisin çeşitli konsantrasyonlarda var etkilerini gösteren bir 96-çukurlu plaka parçasını göstermektedir. içinde suyu MIC 2.5 ve 5 ug / mL arasında olduğu belirlenmiştir. Bu, / 18 mL 1.5 ug, daha önce yayınlanmış değerden biraz daha yüksektir, ancak Acceptab dahilindedir halale aralık. Birçok durumda, renk değişimi oldukça kademeli, yüzden emin bir tespitte zordur. Bu koşullar altında, emicilik ya da floresans kullanarak dönüşüm resazurin gerçek miktarını ölçmek için daha iyidir. Nedeniyle resazurin ve resorufine MIC tespiti emicilik kullanılarak benzer absorbans özelliklerine iki farklı dalga boylarında ve karmaşık hesaplama 15 kullanılarak ölçümler gerektirir. Bu nedenle, en iyi yöntem, üreticinin literatürde 15'te tarif edildiği gibi, 530-560-nm uyarılma dalga boyunu ve 590 nm emisyon dalga boyu kullanılarak floresan ölçmektir.
Şekil 4, büyük ölçüde tarama sonuçlarını değiştirebilecek olan çok günlük inkubasyon ile bağlantılı tutarsızlık potansiyel kaynağını göstermektedir. Bu nedenle deney için kullanılan 37 ° C inkübatör uygunsuz nemlendirilmesi için, p kenarlarında kuyu lates önemli ölçüde daha fazla buharlaşma yaşadı. Tüm 15 DMSO ile tedavi edilen gözler özdeş olması gereken, ancak sol ve üst kenarları boyunca kuyu hacimleri azaltmıştı. Bu kuyular, ayrıca plakanın ortasına diğer DMSO-verilmiş kuyu farklı bir renge sahip olduğu görülmektedir. Aynı tutarsızlık 2.5 ug / mL, apramisin işlenmiş oyuklarda gözlenebilir. Bu durumda, azaltılmış hacmi de bir spektrofotometre ve flüorometrede tarafından kantitatif okumaya yol açacak. bakım tutarsızlık bu kaynağı önlemek için iyi nemlendirilmiş kuvözleri tutmak için alınması gereken böylece Buharlaşma, uzun kuluçka süreleri ile tüm deneyler için önemli hale gelir.
Şekil 1: Yöntem Şemalar. yüksek verimli bir tarama sistemi 3 ayrı modüller için deney şemaları gösteren diyagram. _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: bir hücre içi den Örnek Veri THP-1 Hücrelerinde içinde M. tuberculosis giderilmesinde Rifampisin Etkinliğinin incelemek için. Her bir tedavi (rifampisin) konsantrasyonu için (göreli ışık birimleri) okuma ortalama lüminesans (A), grafik. Hata çubukları, her bir üç kopya için ortalama standart hata ile gösterilir. Daha yüksek değerler daha yüksek etkinliğini göstermektedir rifampisin bir tedavi neden lüminesans hesaplanan azalma yüzdesi (B) grafik. Bu durumda,% 90 inhibitör konsantrasyon (IC90), yere 0.01 ve 0.1 ug / mL arasındadır."Nk> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir sitotoksiklik (MTT) deneyi ile ilgili Örnek Veri Farklılaştırılmış THP-1 hücreleri üzerinde Bileşik G1-1H toksik etkilerini incelemek için. daha yüksek değerler daha sağlıklı, THP-1 hücreleri gösterir tedavi bileşiği G1-1H, her bir konsantrasyonu için değerler hesaplanır "kontrol yüzdesi" grafiği. Bu durumda, IC50 arasında bir yerde 10 ve 30 uM'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir Resazurin Denemesi 'nden gelen Örnek Veri E incelemek içinIn-suyu M. tuberculosis İnhibisyonunda apramisin arasında ffectiveness. Sadece nitel veri nedeniyle biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL3) laboratuvarda ekipman sınırlamaları bu durumda toplanır. Verilmedi DMSO ya da apramisin arasında değişen miktarlarda ile tedavi edilen M. tuberculosis ihtiva eden 96 oyuklu bir plakanın bir kısmını gösterir. DMSO ile tedavi edilen gözler pembe mavi renk dönüşümü ile gösterildiği gibi, resorufine resazurin dönüşüm göstermiştir. apramisin-muamele edilmiş numuneler açıkça 5 ug / mL 'nin altında bir renk dönüşümü yapıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| [Rifampisin] | REP1 | rep2 | REP3 | % azalma | |
| 4 ug / ml | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 ug / ml | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0.1 ug / ml | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0.01 ug / ml | 19200 | 24400 | 23919 | 22506 | 54 |
| 0 ug / ml | 39877 | 49655 | 57728 | 49087 | 0 |
Tablo 1: rifampisin hücre içi IC90 tayini için lusiferaz analizi ham veriler.
| [G1-1H] | Rep 1 A570 | Rep 2 A570 | Rep 3 A570 | Ortalama A570 | Muamele edilmemiş ve% |
| 30 uM | 0.056 | 0.056 | 0.055 | 0.056 | 7 |
| 10 uM | 0.518 | 0.488 | 0.492 | 0.499 | 62 |
| 3 uM | 0,652 | 0.638 | 0.656 | 0,649 | 80 |
| 0 um | 0.822 | 0.782 | 0,815 | 0.806 | 100 |
Tablo 2: Differe de sitotoksisite testi Bileşiği G1-1H belirlenmesi için, MTT Deneyi Ham verilernt Konsantrasyonları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın amacı, M. tuberculosis için bir insan hücre içi enfeksiyon modeli kullanılarak basit ve düşük maliyetli HTS yöntemini yaratmaktı. Tüberküloz, M. tuberculosis ile alveoler makrofajların enfeksiyonu ile karakterize edilen bir insan hastalıktır. Nedeniyle bio, bakteri ve konak hücrelerin hem biyolojik modellerini kapsayan araştırma, geçmişte kullanılmıştır. Ancak, vekil bakteri ve insan olmayan modellerin kullanımı ilaç tarama iyi M. tuberculosis 19, 20 ile enfekte insan hücrelerinde yapılır belirten ilaç geliştirilmesinde isabet-potansiyel müşteri başarı için iyi bir tahmin olduğunu gösterilmiştir, 21, 22.
Bu yöntemde, ileri ve insan makrofaj benzeri, THP-1 hücre hattı için mevcut state-of-the-art tarama protokolleri adapte edilmiştir. yüksek ulaşmak içinüretilen iş, biz enfeksiyon protokolüne birkaç teknik iyileştirmeler. Her şeyden önce, biz CFU belirlenmesinde yer alan tüm adımları değiştirildiği ve bir lusiferaz tabanlı raportör sistemi ile bunları ikame. Ateşböceği Lusiferaz nedeniyle basit uç nokta deneyi, konakçı hücre lizozom enzimler tarafından hızla degradasyona ve en az ekipman ihtiyaçları için seçildi. Bu ikame etkili bir şekilde, 30 günlük bir kuluçka dönemi, aynı zamanda kaplama ve koloni sayma adımlarla bağlantılı emek ve sarf maliyetlerini ortadan kaldırmıştır.
Yaptığımız ikinci bir önemli gelişme daha basit bir enfeksiyon protokolü ile kuyu arasındaki hacmi ve sürekliliği daha toplu işlem ve enfeksiyon, oldu. tek bir adımda içine farklılaşma ve enfeksiyon aşamaları birleştirerek, bir gün protokolünü kısaltmak başardık. Aynı zamanda, normal olarak farklılaşma ve enfeksiyonundan arasında ortaya çıkabilecek yıkama üç tur düşürebilmiştirnedeniyle ayrılması mümkün THP-1 hücre kaybı kaynağıdır n.
Bu protokol çeşitli avantajlar sağladığını THP-1 hücre hattı, iç taranması için geliştirildi. THP-1, bir ölümsüzleştirilmiş hücre kuşağı gibi, üzerinde 20 pasajlar 23 için in vitro olarak güvenilir bir şekilde kültüre edilebilir. Yüksek verimli bir kurulum sağlamak için yeterli hücrelerini korumak için zor olabilir büyük tarama kampanyaları için özellikle önemlidir. Buna ek olarak, THP-1 test sonuçlarını değişkenliği en aza indiren bir homojen genetik arka plan sağlar. Bu konak hücre yanıtları 10 etkileyen bileşimlerin test edilmesi için son derece faydalıdır. Ek bir avantaj olarak, THP-1 hücre hattında gen ekspresyonu küçük müdahale RNA'lar (siRNA'lar), 24 ile aşağı regüle olabilir. Bu, isabetli bileşiklerin etki moduna mansap araştırmalar için değerli bir araç sağlar. bu yöntem, THP-1 hücre çizgisi kullanılarak tasarlanmış olmasına rağmen, buDaha önce 10'da gösterildiği gibi kolayca, periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), insan, birincil hücreler için uyarlanabilir.
En iyi alveoler makrofajlar ve M. tuberculosis arasındaki gerçek etkileşimi taklit etmek için, hücre-içi analiz protokolü bakteri opsonize için bir adım içerir. Insan serum kat M. tuberculosis ile opsonizasyon ve kompleman reseptörü 3 (CR3) 25 yoluyla hücre girişini kolaylaştırır. Çıplak bakteri lektin reseptörü 8 üzerinden makrofajlar girmek için daha olasıdır. Bronşiyal alveoler sıvı insan serumu 25, opsonizasyon veya bunların olmaması bileşenlerini ihtiva ettiği bilinen göz önüne alındığında, bir tarama sonucu üzerinde temel bir etkiye sahip olabilir. Bununla birlikte, bir miktar daha enfeksiyon süreci 16 basitleştirmek için bu adımı atlamak için tercih edilebilir, ya da bağlı li boyutuna kadar insan serum elde etmek için uygun olmayabilirbrary 11 tarandı.
hücre içi deney öncesinde lusiferaz reajanı eklenmesi için kuyulardan serbest malzeme içeren tüm sıvının çıkması için bir adım içerir. Bu adım, yuva başına kullanılan miktar reaktif azaltırken sinyal-gürültü oranını artırmak için tasarlanmıştır. Müstakil ve THP-1 ve serbest yüzen M. tuberculosis kaldırılmış olacaktır lize Bununla birlikte, bu aşamada dahil, yanlış pozitif THP-1 öldürmek bileşiklere ilişkin verileri ama M. tuberculosis oluşturabilir. Bu nedenle, her bir lusiferaz reaktifi (100 uL) eşit miktarda ilave edilmesi, üreticinin tavsiye edilen protokol sitotoksik bileşiklerini ihtiva eden kuyulardaki M. tuberculosis hayatta kalmak için tahlil edilmesi için izlenmelidir.
Ateşböceği lusiferaz sistemin aksine, bakteriyel lux sistemi sinyal üretimi 26 dış reaktifler gerektirmez. Ancak,ateşböceği sistem aşağıdaki nedenlerle lüks sistemi daha fazla tercih edilir: İlk olarak, bakteriyel sistem mikobakteriler 26 toksik olabilir. İkinci olarak, daha karmaşık bir raportör sistemi (firefly 1 geninin karşılık lux için 5 genler), test bileşikleri tarafından inhibisyonu sinyal karşı daha hassastır. Son olarak, ateş böceği lusiferaz deneyi için ticari olarak temin edilebilen reaktifler uygun bir sinyal üretmek için gerekli koşulları sağlar. Öte yandan, bakteriyel lusiferaz sistemi ATP üretimi ve sinyal üretimi için bakteri içinde mevcut kofaktörler dayanır. Bu farklı tedaviler arasında değişir ve kontrol etmek kadar kolay değildir olabilir. Bu nedenle, ateş böceği lusiferaz sisteme reaktif eklenmesinin reaksiyon koşulları standart hale ile bütün tedaviler arasında lusiferaz aktivitesi daha güvenilebilir ölçümler içerir.
CFU belirlenmesi uzun bakteriyel yoğunluk miktarının belirlenmesi için altın standart olmaya gelmiştir. sözleşme olarak, BioluminEscence çoğu gazetecilere gibi, bakterilerin doğrudan ölçüsü değildir. Bunun yerine, RLU CFU ve bakterilerin metabolik haldeki bir fonksiyonudur. Diğer özel koşullar altında 5 biyolüminesan mikobakteri için RLU ve CFU arasında çoğunlukla doğrusal bir ilişki olduğunu göstermiştir. Herhangi bir durumda, lusiferaz deneyi sinyali anlamlı bir azalma, konakçı hücre içinde M. tuberculosis uygunluğun Lusiferaz enzim faaliyetini olur göstermektedir bir azalma gerçek inhibisyonu daha altta yatan nedeni-Diğer bir madde. Bu nedenle, bu bileşikler bir ilaç tarama açısından ilgi olacağını ve yöntem geliştirme ardı edilmemelidir.
Lusiferaz tabanlı hücre içi tarama protokolü bir alternatiftir otomatik floresan mikroskopi dayalı yaklaşım 11, 27, 28, 29. lusiferazDeney çıkış bir lüminometre ile ölçülmüştür ve floresan mikroskobu nitel görüntüleri üretir, oysa elde edilen veriler, kantitatif edilir. Ancak, akıllı bilgisayar programlama yoluyla, görüntüler nicel verileri oluşturmak için analiz edilebilir. Ayrıca, flüoresan mikroskopi gibi hücre canlılığı, hücre sayımı ve enfeksiyon geçerli oran olarak değerli parametreleri toplamak için çok yararlı olan, birden fazla floroforlar eş zamanlı olarak kullanılacak sağlar. Tahmin edileceği gibi, bu faydaların bazıları aksiliklere ile gelir. Otomatik floresan mikroskopi ekipman üzerinde ilk yatırım bir luminometre veya flüorometrede maliyeti kat kat fazladır ve birçok araştırma laboratuarları için ulaşamayacağı nedenle. ekipmana sahip olanlar için, numune işleme görüntü elde etme ve veri analizi öncesinde düşünülmelidir. Bu iki adım Kütüphane boyutundaki artışlarla toplam süresi yatırımı etkiler. konakçı hücreler requir ilave floresan etiketler dahilBu şekilde ek bir kullanıcı müdahalesi ve zaman yatırımı gerektiren es sabitleme, boyama ve yıkama aşamaları,. Ayrıca, floresan mikroskopi veri toplama ve analiz, otomatik rağmen hala basit lusiferaz deney, okuma göre çok daha fazla zaman ve kaynak gerektirir. Bu nedenle, lusiferaz raportör dayalı hücre içi bir tarama yöntemi basit ve daha yüksek verim yeteneğine sahiptir.
lusiferaz dayalı hücre içi bir tarama metodu floresan mikroskop bazlı tarama yöntemleri ile karşılaştırıldığında önemli bir kısıtlama mevcuttur. Bu lusiferaz analiz konak makrofajlar sağlık durumu ile ilgili hiçbir veri sağlar olmasından kaynaklanmaktadır. Sitotoksik bileşikler, makrofajlar ölümüne neden olur ve böylece canlı bakteri ortamına salınan edilebilir ve artık nihai lusiferaz deneyi sinyali katkıda bulunacaktır. Bunun bir sonucu olarak, sitotoksik bileşikler bu nedenle, hücre içi, M. tüberküloz ve generat ölümüne neden olduğu görülmektediryanlış pozitif ea büyük bir sayı. Bu sorunu çözmek için, ana bilgisayar makrofajlar üzerindeki bileşiklerin sitotoksisitesini değerlendirmek için bir MTT analizi ile yöntemini tamamlanmaktadır var. tarama yönteminin Bu modül bize ilgi bileşiklerin drugability hakkında ek bilgi verir ve daha az ideal olmayan ilaç adaylarının erken ortadan kaldırılmasını sağlar.
Alternatif olarak, bir de, önceki otomatik floresans mikroskobu gerçekleştirmek için lusiferaz dayalı hücre içi tahlil kullanabilir. Büyük bileşik koleksiyonlarının ekranlarında bu makrofaj enfeksiyon modelinde bileşik etkinliğinin hızlı ve verimli değerlendirilmesi için izin verir. Önceden yayınlanmış çalışmanın 11 tarafından gösterildiği gibi bir sonucu olarak, otomatik floresan mikroskopi, daha iyi adaylar hakkında ayrıntılı çalışmalar için rezerve edilebilir.
lusiferaz tabanlı hücre içi tayinin düşük maliyetli ve basit doğa da büyük ölçüde küçük test etmek isteyen araştırmacılar yararlarıkimyasal kütüphaneler er. Genel olarak, lusiferaz tabanlı hücre içi tahlil tüm kalibre araştırma laboratuarları ve çeşitli büyüklükteki projeleri tarama için son derece esnek bir araç olduğu kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
