Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

Lorena Benedetti; Anna Ghilardi; Laura Prosperi; Maura Francolini; Luca Del Giacco

doi:10.3791/55297

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Methodenartikel

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

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DOI:

10.3791/55297

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26. Juni 2017

Lorena Benedetti¹^,²^,³ , Anna Ghilardi⁴ , Laura Prosperi⁴ , Maura Francolini^*¹ , Luca Del Giacco^*⁴

¹Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, ²Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, ³Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, ⁴Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen, indem Zebrafischembryonen in einem in vivo-System zusammen mit einem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) basierenden genetisch kodierten Spannungsindikator (GEVI) verwendet werden, der selektiv in dem interessierenden Zelltyp exprimiert wird.

Zusammenfassung

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen es Forschern, die Zellkommunikation zu untersuchen, ohne die Integrität der Umgebung, in der sich die Zellen befinden, zu verändern. Konkret wurden sie entwickelt, um die elektrische Aktivität von erregbaren Zellen, wie z.B. Spinalneuronen, zu analysieren. In einem solchen Szenario ist es entscheidend, die Integrität der Wirbelsäulenzelle zu erhalten, aber es ist auch wichtig, die Anatomie und die physiologische Form der beteiligten Systeme zu erhalten. In der Tat muss das Verständnis der Art und Weise, wie das Nervensystem - und andere komplexe Systeme - funktionieren, auf einem systemischen Ansatz beruhen. Aus diesem Grund wurde der lebende Zebrafischembryo als Modellsystem ausgewählt und die Spannungsänderungen der Spinalneuronenmembran bewertet, ohne die physiologischen Bedingungen der Embryonen zu beeinträchtigen.

Hier wird ein Ansatz beschrieben, der die Verwendung von Zebrafischembryonen mit einem FRET-basierten Biosensor kombiniert. Zebrafischembryonen zeichnen sich durch ein stark vereinfachtes Nervensystem aus und eignen sich aufgrund ihrer Transparenz, die den Einsatz von fluoreszenzbasierten Spannungsindikatoren an der Plasmamembran während der Entwicklung des Zebrafisches ermöglicht, besonders für bildgebende Anwendungen. Die Synergie zwischen diesen beiden Komponenten ermöglicht es, die elektrische Aktivität der Zellen in intakten lebenden Organismen zu analysieren, ohne den physiologischen Zustand zu stören. Schließlich kann dieser nicht-invasive Ansatz mit anderen Analysen (z. B. spontanen Bewegungsaufzeichnungen, wie hier gezeigt) koexistieren.

Einleitung

In-vivo- systemische Komponentenanalyse ermöglicht es Wissenschaftlern, zelluläres Verhalten auf die zuverlässigste Weise zu untersuchen. Dies trifft besonders dann zu, wenn die zu prüfende Aktivität stark durch Zell-Zell-Wechselwirkungen (sowohl kontakt- als auch berührungsabhängig) beeinflusst wird, wie im Nervensystem, wo Membranspannungsänderungen die Kommunikation zwischen erregbaren Zellen antreiben. Das Verständnis der Informationen, die von diesen elektrischen Signalen codiert werden, ist der Schlüssel zum Verständnis der Art und Weise, wie das Nervensystem sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen arbeitet.