Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die schnelle Verarbeitung von post-mortem diffuse intrinsische Ponsgliom Proben für die Einrichtung von Patienten stammenden Zellkulturmodellen oder direkte Charakterisierung von Tumor und Mikroumgebungs Zellen.
Abstract
Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG) ist eine Kindheit brainstem Tumor, der eine universell fatal Prognose trägt. Weil die chirurgische Resektion keine praktikable Behandlungsstrategie und Biopsie ist nicht routinemäßig durchgeführt wird, ist die Verfügbarkeit von Patientenproben für die Forschung beschränkt. Folglich Anstrengungen, diese Krankheit zu studieren wurden durch eine geringe Zahl von treuen Krankheitsmodelle in Frage gestellt. Um diesem Bedarf zu begegnen, beschreiben wir hier ein Protokoll für die schnelle Verarbeitung von post-mortem Autopsie Gewebeproben , um dauerhaft Patienten stammenden Zellkulturmodelle zu erzeugen , die verwendet werden können in in vitro - Assays oder in vivo orthotope Xenograft - Experimenten. Diese Modelle können verwendet werden, um mögliche Angriffspunkte für Medikamente zu screenen und Grund pathobiologischen Prozesse innerhalb DIPG zu studieren. Dieses Protokoll kann weiter ausgedehnt werden Tumor- und Mikroumgebungs Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS), die anschließende Analyse der Gen ex ermöglicht zu analysieren und zu isolieren,pression, Proteinexpression oder epigenetische Modifikationen von DNA an der Bulk-Zelle oder Einzelzellebene. Schließlich kann dieses Protokoll auch Patienten stammenden Kulturen für andere zentrale Nervensystem Tumoren zu erzeugen, angepasst werden.
Introduction
DIPG ist eine aggressive zentrale Nervensystem Malignität , die in den ventralen pons entsteht, in der Regel in der Zwischen Kindheit 1, 2. Trotz Jahrzehnten klinischer Studien ist die derzeitige Behandlung der Strahlentherapie begrenzt, die vorübergehende Verbesserung oder Stabilisierung der Symptome liefert und bezieht sich nur mediane Überlebenszeit um durchschnittlich 3 Monate. Selbst mit einer Strahlentherapie, mediane Gesamtüberleben ist nur 9 Monate bei 90% der Kinder von der Krankheit innerhalb von 2 Jahren von der Erstdiagnose. Wegen der infiltrative Art des Tumors und die kritischen Funktionen des Hirnstamms, ist die chirurgische Resektion nicht möglich. Darüber hinaus ist in den Vereinigten Staaten, hat chirurgische Biopsien für DIPG Erhalt historisch nicht 3 durchgeführt wurde, wie die histopathologische Analyse bei der Führung der klinischen Behandlung und Diagnose keine aktuelle Rolle kann in der Regel durch Neuroimaging allein gemacht werden. Somit ist die Verfügbarkeit von Tumorgewebe foder Studie ist eingeschränkt, die Bemühungen um Begrenzung der Forschung über die Kandidatenwirkstoffmoleküle und der zugrunde liegenden Tumorbiologie zu führen. Insbesondere Verbesserungen in der bildgebenden Verfahren und stereotaktische Techniken für die Entwicklung von sicheren Biopsien DIPG in den letzten Jahren erlaubt 4, die, wenn sie mit Fortschritten in der Molekularbiologie kombiniert, das Verständnis der Krankheit verändert haben. Derzeit sind mehrere klinische Studien unter Verwendung von Upfront - Biopsie und molekulare Profilierung von DIPG für individualisierende Behandlungspläne laufenden (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG und andere pädiatrische hochgradigen Gliomen repräsentieren verschiedene Krankheiten , die von ihren erwachsenen Glioblastom Kollegen 6, 7, und so treu experimentellen Modellen von DIPG sind notwendig , um seine einzigartigen Pathophysiologie und entdecken wirksame therapeutische Strategien zu verstehen. In den letzten Jahren konzentrierte Bemühungen DIPG Tumor t zu erhaltenProblem für die Forschung zum Zeitpunkt der Autopsie oder, seltener, Biopsie haben unser Verständnis von und die Fähigkeit zu studieren DIPG revolutioniert. Genomweite Sequenzierung Bemühungen ergab eine rezidivierende Mutation im Histon H3, Familie 3A (H3F3A) und Histon - Cluster 1, H3b (HIST1H3B) Es ist das erste Beispiel für Menschen durch Mutationen in Histon - Krankheit verursacht Proteine kodieren , 8, 9, 10, 11 . Weiterhin drückt eine Teilmenge von DIPGs Mutationen im ACVR1 - Gen, das zuvor noch nicht in Krebs berichtet worden , sind aber identisch mit Entwicklungsstörung fibrodysplasia ossificans gefundenen Mutationen in der kongenitalen Kindheit progressiva 8, 9, 10, 11. Wie gut, die ersten Patienten stamm DIPG Zellkulturen und orthotope Xenograft models wurden nun 1 hergestellt wurde, 2, 12, 13, 14, sowie Mausmodellen durch die direkte Xenotransplantation von Tumorzellen in immundefizienten Mäusen etabliert serielle Xenotransplantate 3, 14, 15 erzeugen. Erste Wirkstoff - Screening Bemühungen , diese Patienten stammenden Modelle verwendet haben vier vielversprechende neue Wirkstoffe für klinische Umsetzung identifiziert, 14 und haben den Grundstein für mindestens eine klinische Studie (NCT02717455) gelegt.
Diese ersten Schritte in Richtung Fortschritt sind nur der Anfang, und zahlreiche Patienten stammenden Gewebeproben und Kulturmodellen wird notwendig sein, Subtypen der Erkrankung zu definieren und die wirksamsten therapeutischen Strategien zu entwickeln. Genetisch MotorEred Mausmodelle von DIPG erleichtern auch bei der Förderung unserer grundlegenden Verständnis der Krankheit abzielen Studien. Bemühungen genetische Modelle für DIPG erzeugt werden durch die grundlegende genomischen Untersuchungen oben diskutiert unterstützt werden, aber gegenwärtig gibt eine begrenzte Anzahl von Optionen zur Verfügung. Ein solches Modell, das brainstem Gliome histologisch ähnlich hochwertigen erzeugt, nutzt die viralen RCAS / tv-ein System zum Antrieb PDGF-B - Überexpression und Ink4a-ARF Verlust in Nestin-positiven Zellen in der hinteren Schädelgrube von neugeborenen Mäusen 5, 16. Ein weiterer Ansatz beinhaltet mehrere große DIPG-assoziierte Mutationen (Histon H3.3 K27M Mutation, p53 Verlust und PDGFRA Aktivierung) in neuralen Vorläuferzellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen abgeleitet rekapitulieren, die diese Zellen tumorerzeugend 6, 7, 17 zu rendern ausreicht. Die Kombination von genetischen Methoden und Patienten-derived-Modelle werden präklinischen Tests ermöglichen und die Entwicklung wirksamer Therapien fördern.
Um die Herausforderungen zu DIPG Forschung adressieren wurde oben beschrieben, diese schnelle Autopsie - Protokoll Patienten stammenden Zellkulturen zur Untersuchung 8 zu erzeugen , entwickelt 9, 10, 11, 12, 14. Das Protokoll soll die Lebensfähigkeit des Gewebes zu schützen und die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von langlebigen Kulturen trotz der Herausforderungen im Zusammenhang mit erweiterten Post-mortem-Intervalle und Transportzeit assoziiert zu maximieren. Wenn erfolgreich erzeugt wird , können diese DIPG Kulturen in anschließenden in vitro - Manipulationen und in vivo - Xenotransplantat - Experimenten verwendet werden, so dass für die Bewertung der potentiellen therapeutischen Molekülen auf Patienten stammenden Zellen.
Protocol
Dieses Protokoll wurde mit der Zustimmung aus dem Institutional Review Board mit entsprechenden de-Identifizierung aller Patientendaten und in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Erhalten Sie alle geeigneten Institutional Review Board Genehmigung und informierte Zustimmung von der Familie des Patienten, bevor sie mit diesem Protokoll zu arbeiten.
1. Gewinnung Gewebeproben
HINWEIS: Eine kritische Komponente dieses Protokoll erfordert die korrekte Handhabung des Spenden Gewebe sofort zum Zeitpunkt der Autopsie beginnen. Die gesamte Probe Lebensfähigkeit hängt maßgeblich von der Post-Mortem - Intervall (PMI) minimiert wird , sofort das Gewebe in das entsprechende kalte Medium mit Antibiotika / Antimykotika, halten die Probe auf nassem Eis während der Beförderung ergänzt Übertragung und Aufrechterhaltung einer sterilen Technik während des gesamten Protokolls.
- Nach einer entsprechenden Meldungeiner drohenden Spende, eine Probenentnahme-Kit vorbereiten. Mit einer Transportkiste mit einem isolierten Behälter, der direkt für den Rücktransport der Gewebeprobe verwendet werden kann, umfassen die folgenden Materialien:
- Fügen Sie Materialien für sterile Zubereitung, einschließlich sterile Handschuhe, Vorhänge und Skalpelle.
- Fügen Sie 8 - 10 sterile 50 ml konischen Röhrchen mit 30 ml Versand Medien in dem isolierten Behälter mit Eis oder Kältepackungen.
HINWEIS: Während jede Standard-Zellkulturmedien arbeiten können, ist die beste Probe Lebensfähigkeit mit Hibernate-A mit Antibiotika / Antimykotika ergänzt erhalten wird. - Fügen Sie alle weiteren Probenröhrchen für andere Analysen (zB Fixierer).
- Wenn der Autopsie wird nicht am Standort des Forschers durchgeführt werden, umfassen ein Dokument, das eindeutig fest, wie die Tumorprobe zu sammeln. Dazu gehören Details wie Aufrechterhaltung der Sterilität, Probenröhrchen auf nassem Eis zu halten, und auch Proben aus dem Mittelhirns und der Medulla als tumor Zellen eindringen oft diese Regionen.
- Pflegen Sie Sterilität bei der Autopsie. Betrachten Sie das Gehirn steril im Inneren des Schädels, so beobachten sterile Technik (einschließlich der Änderung Handschuhe), wenn der Schädel geöffnet ist. Vermeidung von Kontamination mit Haut und Haar ist von entscheidender Bedeutung.
- Präparieren Sie den Tumor von der Bauchseite (dem "Bauch" des Pons, siehe Zusatz Abbildung 1). Mit einem sterilen Skalpell, klein geschnitten 1 cm Stücke aus dem Tumor und übertragen sofort in kalte Versand Medien (siehe Hinweis in Schritt 1.1.2) und auf nassem Eis gelegt. Platz 10 ml Gewebe in jedes Röhrchen, was zu einem Endvolumen von Gewebe und Medium in jedem Röhrchen von 40 ml.
Hinweis: Im Fall von DIPG infiltriert das Tumor diffus Pons und häufig der Rest des Hirnstamms. 4 Rohre (30 - - 40 ml Gewebe) von Pons und 1 bis 2 Schläuche (10 - 20 ml Gewebe) jeweils aus Mittelhirns und Medulla so viel von der Probe wie möglich, typischerweise einschließlich 3 als solche sammeln. - Sammeln Sie samsätze aus dem Mittelhirns und der Medulla zur Brücke gegenübergestellt, die oft viele Tumorzellen enthalten.
- Nach der Probensammlung, versenden die Proben O / N auf nassem Eis in dem isolierten Behälter. Nicht auf Trockeneis versenden die Probe, wie das Einfrieren der Zellen zu töten.
2. Vorbereitung der Probenbearbeitung
- Vor der Probenvorbereitung beginnen, Gewebekulturhauben zusammen mit Rasierklingen, gebogen hemostats und alle anderen nicht-sterilen Werkzeugen unter UV-Licht für 1 h sterilisieren. Führen alle der folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen Kontamination der Kulturen zu verhindern.
- Vorbereiten und Sterilfilterlösungen.
- Zur Herstellung von 1,8 M Saccharose-Lösung, lösen sich 308,07 g Saccharose in 300 ml destilliertem Wasser. 50 ml 10x Hank's-gepufferter Saline Solution (HBSS) ohne Calcium oder Magnesium und bringen auf 500 ml Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser. Lagerung bei 4 ° C.
- Um die enzymatische Verdauung Lösung vorzubereiten, nehmen 50 ml HBSS mit Calcium und Magnesium für jede 10 ml zerkleinerte Gewebe und füge 500 & mgr; l 5 mg / ml Desoxyribonuclease I (Endkonzentration 50 ug / ml), 500 ul 2,5 mg / ml Kollagenase I / II und Dispase - Lösung (Endkonzentration 25 & mgr; g / ml) und 500 ul 1 M HEPES-Puffer. Vorwärmen Aufschlusslösung in einem 37 ° C Wasserbad.
- Um Tumorstamm Medien (TSM) Basis vorbereiten, mischen 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium: Nährsalzgemisch F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x Antibiotikum-Antimykotikum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L- Glutamindipeptid (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES-Puffer, 5 ml 100 mM Natriumpyruvat und 5 ml 100x MEM nicht-essentielle Aminosäuren.
- Zur Vorbereitung komplette TSM mit Wachstumsfaktoren, die folgenden Ergänzungen TSM Base: 50x B27 Supplement Minus Vitamin A (1:50), humanen epidermalen Wachstumsfaktor (H-EGF, 20 ng / ml), menschliche Fibroblasten-Wachstumsfaktor (H- FGF 20 ng / ml), menschliches Platelet-derived Growth Factor AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),menschliche Platelet-derived Growth Factor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml) und Heparin-Lösung (2 & mgr; g / ml).
- Vorzukühlen einer Laborzentrifuge mit einem Schwenkbecherrotor auf 4 ° C ausgestattet.
3. Mechanische Distanzierung
- Übertragen Sie das Gewebe in eine Hoch walled 100 mm x 20 mm Zellkulturschale. Entfernen Sie das Medium Überbleibsel aus Versand und ersetzen mit 10 bis 15 ml kaltem Kulturmedien.
- die gekrümmten hemostats mit einer Rasierklinge zu erfassen, um das Gewebe fein hacken, während offensichtlich Blutgefäße oder Hirnhaut zu entfernen.
HINWEIS: Die endgültige Gewebefragmente sollte kleiner als 1 mm sein (siehe 1B). - Übertragen Sie das Gewebe in einen sauberen 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Zellkulturschale mit weiteren 5 ml kaltem Kulturmedien und Transfer zum konischen Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt nach Bedarf verbleibende Gewebe zu übertragen.
- Mit einem 10 ml serologische Pipette, verreiben sanft (4 - 5 mal). Lassen Sie größere tissue Fragmente zum Boden des Röhrchens absetzen. Falls erforderlich, Zentrifuge kurz auf die Probe für 1 min (350 × g, 4 ° C).
- Sammeln Sie die mechanisch dissoziiert Fraktion.
- Entfernen Sie den Überstand und filtern sie durch einen 100 & mgr; m-Filter in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit "Mechanische Distanzierung." Kehren Sie die Filter über dem ursprünglichen konischen Röhrchen und waschen mit Kulturmedien Gewebefragmente zu erholen.
- Zentrifugieren Sie die "Mechanische Distanzierung" Fraktion für 5 min (350 × g, 4 ° C).
- Entfernen Sie den Überstand aus dem pelle "Mechanical Dissociation" Fraktion und resuspendieren das Gewebe in kaltem Kulturmedien. Wenn es mehr als 5 ml Gewebe in der "Mechanical Dissoziation" konischen Rohr ist, teilen das Gewebe in anderen 50 ml konischen Röhrchen, so dass kein Rohr mehr als 5 ml Gewebe hat.
- Lagern Sie die mechanisch dissoziierten Fraktion auf Eis, bis der Sucrosegradientenzentrifugation Schritt (Step 5). Alternativ kann die mechanisch dissoziierte Bruch gehen während der enzymatischen Spaltung Inkubationszeit zu Schritt 5 (Schritt 4.4).
4. Enzymatische Dissoziation
- Wenn es mehr als 5 ml Gewebe in der Röhre ist, die verbleibenden größeren Gewebefragmente enthält, aufgeteilt das Gewebe in andere neue 50 ml konische Röhrchen, so dass kein Rohr mehr als 5 mL Gewebe hat.
- Zentrifugieren Sie die konische Röhre (n) enthalten, die restlichen Gewebefragmente für 5 min (350 × g, 4 ° C).
- Entfernen Sie den Überstand und fügen die vorgewärmtem enzymatische Aufschlußlösung, so dass es 5 ml Aufschlußlösung pro 1 mL Gewebe (zB 25 ml Digestionslösung für 5 ml Gewebe).
- Verschließen Sie die konische Gefäßdeckel mit Laborfilm und brüten die Reaktion auf einem Rotator bei 37 ° C für 30 min.
- Nach der Inkubation verreiben die Proben vorsichtig (siehe Abbildung 1C).
- Mit einem 10 ml serologische Pipette,Pipette die Probe auf und ab 6 - 8 mal. Vermeiden Sie übermäßige Luftblasen zu erzeugen.
- Fügen Sie ein 1000 ul Pipettenspitze bis zum Ende der Pipette und verreiben zusätzlich 6 - 8 mal.
- Erlauben die verbleibenden Stücke an den Boden des Röhrchens absetzen. Entfernen und filtern den Überstand mit den Zellen noch ein 100 & mgr; m-Filter in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit "Enzymatische Dissoziation" und speichern auf Eis suspendiert durch.
- Wenn bedeutende Gewebefragmente bleiben, fügen Sie eine zusätzliche 10 ml HBSS mit Calcium und Magnesium zu den Fragmenten und wiederholen Sie die Schritte 3.5.1 und 3.5.2. Filtern endgültige Lösung durch ein 100 & mgr; m-Filter in die "Enzymatische Dissoziation" Rohr.
- Zentrifugieren Sie die "Enzymatische Dissoziation" Röhrchen 5 min (350 × g, 4 ° C) und weiterhin Sucrosegradientenzentrifugation.
5. Sucrosegradientenzentrifugation
- Werden die Proben noch in Lösung, centrifu suspendiertge für 5 min (350 · g, 4 ° C).
- Entfernen des Überstandes und Resuspendieren Gewebe in 20 ml kaltem HBSS ohne Calcium und Magnesium. Bringt Volumen von bis zu 25 ml insgesamt mit kaltem HBSS.
- Langsam 25 ml Lösung 1,8 M Saccharose hinzufügen und das Rohr invertieren zu mischen. Dies resultiert in einer 0,9 M Sucrose-Gradienten.
- Zentrifuge ohne Bremsen für 10 min (800 · g, 4 ° C). Verwendung einer Zentrifugation Bremse wird der Gradient stören und die Ausbeute verringern (siehe Figur 1D für ein Beispiel einer Probe vor und nach der Zentrifugation).
- Sorgfältig absaugen Myelin Trümmer und so viel Saccharose-Lösung wie möglich. Waschen Sie die Probe durch Zugabe von 30 ml kaltem HBSS ohne Calcium und Magnesium und Mischen sanft. Zentrifuge für 5 min (350 · g, 4 ° C).
6. ACK Red Blood Cell Lysis
- Entfernen Sie den Waschüberstand. Werden 5 ml ACK-Lysepuffer und resuspendieren sanft das Zellpellet, wirbelnde das Röhrchen für 1 min bei RT.
- Quenche die llyse von 30 ml kaltem HBSS Zugabe ohne Calcium und Magnesium.
- Zentrifuge für 5 min (350 · g, 4 ° C).
7. Vorkultur Wartung
- Resuspendieren der endgültigen Zellpellets in 10 bis 15 ml warmem komplette TSM mit Wachstumsfaktoren und zu quantifizieren Lebendzelldichte auf einem Hämozytometer Trypanblau-Ausschluss verwenden.
HINWEIS: Der Bereich der lebenden Zellen weit variiert je nach den Umständen des Gewebespende abhängig, und die Quantifizierung kann in diesem frühen Stadium aufgrund Überbleibsel Zelltrümmer schwierig sein. Im Idealfall wollen eine Million lebende Zellen pro Probe zu haben. In Fällen, in denen eine übermäßige Schutt, Platte bei einer geringeren Dichte in einem T175-Kolben bleibt. - Übertragen Sie die endgültige Zellsuspensionen auf eine neue T75 Kulturflasche. Spike in zusätzlichen Wachstumsfaktoren jeden zweiten Tag insgesamt Wachstumsfaktor Niveau zu halten und zu überwachen für die Entwicklung von Tumorzellen Neurosphären (siehe Abbildung 1E und Abbildung 2).
- Alternativ Verfahren enzymatisch dissoziierten Zellen für eine weitere Analyse, einschließlich der Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung.
- Nach der Entwicklung der Neurosphären (die im Durchschnitt 3 nimmt - 4 Wochen, aber liegt im Bereich von einigen Tagen bis so lange wie 2 Monate) in umgekehrter Probenfilter 100 & mgr; m Nylonmaschenfilter mit der Menge an Ablagerungen zu verringern.
HINWEIS: Das Filtrat sollte in Kultur bei tragfähige einzelne Zellen oder kleine Kugeln vorhanden sind, beibehalten werden. - Die Integrität und Reinheit der Kultur durch DNA-Fingerprinting Durchführung während Passagierung auf den Anfangspatientenprobe verglichen wird.
Representative Results
Das Protokoll beschrieben wird als eine fünfstufigen Arbeitsablauf mit Bildern des Gewebes in verschiedenen Stufen der Verarbeitung in Figur 1 zusammengefaßt. Die Probe wird zunächst durch eine schnelle sterile Autopsie erhalten. Während der mechanischen Dissoziation wird das Gewebe fein zerkleinert, während die Blutgefäße und Meningen aus der Probe entfernt wird, und durch ein 100 um Nylonnetzfilter. Verbleibende Gewebefragmente werden enzymatisch in einem Wärmeofen distanzierte. Als nächstes Trümmer werden durch Saccharosegradienten-Zentrifugation reduziert, von der Probe eine bestimmte Schicht von Myelin zu isolieren. Zusätzlich sichtbar ACK Lyse reduziert die Menge der roten Blutzellen in der Probe vorhanden. Schließlich werden die Zellen in serumfreiem Medium mit Wachstumsfaktoren ergänzt ausplattiert.
Supplemental Figur 1 ist ein Beispiel des Tumors bei der Autopsie. Der Tumor wächst als diffuse Infiltration des pons eind die angrenzenden Regionen des Hirnstamms. Während der Probenpräparate, klein ~ 1 cm x 1 cm Stücke sollten in kaltes Versand Medien auf Eis geschnitten und sofort gestellt werden.
Figur 2 zeigt verschiedene Beispiele dafür , wie die Proben aus der frühen Phasen der Züchtung zu einer dauerhaften Kultur erscheinen kann. Zunächst überzogen und frühen Kulturen (A, B) erscheinen oft nicht viele überlebenden Zellen zu enthalten. Darüber hinaus oft frühen Zellhaufen (C, D) zeigen nicht den Grad der Kontrast typischerweise mit Neurosphären verbunden. Bemerkenswerterweise kann die Dauer der Zeit in Kultur vor dem Auftreten von Zellclustern Wochen dauern, um ein paar Monate. die anfängliche Durchgang dieser Zellcluster in Kombination mit Rückwärtsfilterung von Zellclustern, können gesunde Tumorzellen isolieren, jedoch die in der Lage sind Kugeln (F) zu bilden. Das Filtrat (E) enthält in der Regel übrig gebliebenen Trümmer; jedoch empfehlen wir die Plattierung und die Aufrechterhaltung der Filtrat und Überwachung für die Entwicklung von Zellclustern. Diese Patienten stammende Proben können dann in Kultur für die mehrfachen Durchgänge (G, H) gehalten werden.
Abbildung 3 zeigt die Fähigkeit dieser Zellen in Mäuse xenotransplantierten sein. In jedem dieser Fälle wurden die DIPG Zellen mit einem GFP-Luciferase-Reporter transfiziert die Entwicklung der Tumoren durch Biolumineszenz (A) zu überwachen. Die Tumore können auch histologisch, beispielsweise untersucht werden, um Tumor engraftment (B) oder Expression von spezifischen Markern (C) zu beobachten. Diese in vivo - Modelle, kombiniert mit in vitro - Assays können verwendet werden , um die Effekte verschiedener Arzneimittel oder Genmanipulationen zu bewerten (beispielsweise 8, 9, 10, 11, 14).
les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg "/>
Abbildung 1. Gewebeproben bei verschiedenen Stufen der Verarbeitung. (A) zu erhalten , die Probe durch sterile Autopsie Verfahren und über Nacht Versand auf nassem Eis. (B) Von links nach rechts: (Reihe 1) Röhren Tumorgewebe in Versandmedien enthält; frisches Gewebe in einer 100 mm x 20 mm Zellkulturschale; anfängliche Hacken- von Gewebe; (Zeile 2) teilweise zerkleinerte Gewebe; Entfernung von Hirnhaut und Blutgefäße; Endgröße von zerkleinerten Gewebestücke. (C) Von links nach rechts: (Reihe 1) Gewebe inkubiert auf einem Drehtisch in einem 37 ° C heißen Ofen; (Zeile 2) Verreiben des Gewebes durch eine 1000 ul Pipettenspitze in einen 10 ml-Pipette befestigt ist; Filterung von dissoziierten Gewebe durch ein 100 & mgr; m Nylon-Mesh-Filter. (D) Von links nach rechts: dissoziiert in 0,9 M Saccharoselösung suspendiert Gewebe vor der Zentrifugation; dissoziierten Gewebe über einen Saccharosegradienten nach Zentrifugation abgetrennt; eine sichtbare Schicht of Myelin Trümmer auf dem Saccharosegradienten; eine endgültige Zellpellet nach ACK Lyse und zu waschen. (E) Die endgültige Probe kann in anderen Downstream - Analysen in Kultur gebracht oder verwendet werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Bilder von Primärkulturen und frühen Passage Zellen. (A - B) Kulturen plattiert unmittelbar nach der Dissoziation (SU-DIPG-XXX, A), oder, die nicht Neurosphären noch (SU-DIPG-XXIX, B) gezüchtet. (C - D) frühe Auftreten von Neurosphären in Primärkulturen von SU-DIPG-XXVIII (C) und SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Erster Durchgang der Primärkultur von D 100 & mgr; m Nylonfilter mit fiFiltrats (E) und umgekehrt Filtrat (F) überzogen. (G - H) Mature Neurosphären aus dem ersten Durchgang der SU-DIPG-XXVII (G) und dem dritten Durchgang der SU-DIPG-XXV (H) in Kultur zu wachsen. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Patienten abgeleiteten Zellkulturen einprägen und Formular - Tumoren in Mäusen. (A) Bioluminescence Bildern von vier verschiedenen Patienten stammenden Zellkulturen mit einem GFP-Luciferase - Reporter transfiziert. (B) Sagittalschnitt von einer Maus - Xenograft - Tumorzellen zeigt , die in der Maus pons engrafted. Grün: GFP, Rot: Myelin basisches Protein. Maßstabsbalken = 1 mm. (C) Beispiel immunofluoreszenz Bild zeigt GFP-Tumorzellen in einem Mausgehirn transplantiert. Blau: DAPI, Grün: GFP, Rot: IGF2R. Maßstabsbalken = 40 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Supplemental Abbildung 1. Autopsy Muster eines Pontine Tumor. Immediate post-mortem Auftreten einer diffusen intrinsischen Ponsgliom. Der Tumor erscheint als großes, Myelin reiche Masse auf der Bauchseite der Brücke. Bitte klicken Sie hier um das Bild herunterzuladen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur schnellen Verarbeitung von post-mortem Spenden Tumorgewebe Patienten stammende Zellkulturen zu entwickeln, die in einer Vielzahl von in - vitro- oder in - vivo - Experimenten verwendet werden können. Aufgrund der Art der mit der Autopsie Proben arbeiten, Probe Lebensfähigkeit Aufrechterhaltung stellt eine erhebliche Herausforderung. Mehrere Faktoren, einschließlich der Post-mortem-Intervall oder die Zeit für den Transport von Gewebe erforderlich Autopsie sollte so weit wie möglich minimiert werden, aber oft sind schwer zu kontrollieren. Unserer Erfahrung nach einer Obduktion Intervall von weniger als 6 - 8 Stunden (ab dem Zeitpunkt des Todes zu der Zeit, dass das Gewebe in eiskaltem Versand- und Transportmedien platziert ist) hat die beste Chance der Schaffung einer dauerhaften Zellkultur ergab. Am besten ist es dann, das Gewebe im Labor innerhalb von 24 h erhalten, und für die Kultur unmittelbar nach Erhalt zu verarbeiten.
Da die Lage dieser seltenen Fällen ist sehr unterschiedlich, unddie Qualität der Schritt Gewebeentnahme stark die Chance auf Erfolg auswirkt, kann eine Herausforderung sein die Logistik der Autopsie durchführen. In vielen Fällen, um die 6-8 Stunden Zeitrahmen zu erreichen, ist es nicht möglich, das Gewebe Ernte in einem akademischen Zentrum zu leiten. Stattdessen auf Abruf eine Gewebe-Recovery-Service, die das Tumorgewebe bei der Beerdigung zu Hause unter einem IRB-genehmigten Protokoll wiederherzustellen, ist oft sinnvoller für die Gewebewiederherstellung. Beziehen informierte Einwilligung im Voraus über den Tod wird empfohlen, und erleichtert die logistische Planung. Vorbereitung in sich geschlossene Autopsie-Kits mit klaren und ausführlichen Anweisungen und Sterilgut für Gewebeentnahme (Handschuhe, Vorhänge, Skalpelle) wird dringend empfohlen. Darüber hinaus unter den Ermittler, Pathologen klare Punkte der Kommunikation etablieren und Bestattungs ist kritisch. Zum Beispiel sollte der Prüfer das Protokoll mit dem Pathologen diskutieren vor der Autopsie und häufige Fehler zu markieren. Diese Fehler umfassen Mikrobial Kontamination (in der Regel Hefe) während der Gewebeentnahme, Versagen durch über Nacht / Expressversand und Versagen zu versenden Sie die Probe auf ausreichend nassen Eis in einem thermoinsulated Behälter zu versenden. Schließlich empfehlen wir den Versand der Probe eine Tür-zu-Tür-Kurierdienst mit Transportzeit zu minimieren.
Vorsicht ist auch bei Gewebedissoziation genommen werden die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Zum Beispiel entwickelt, um die Nutzung von Medien für den Transport (Hibernate-A ergänzt mit Antibiotika / Antimykotika) erhöht sich die Chance zum Erzeugen einer erfolgreichen Kultur Nervengewebe Gesundheit zu erhalten. Es ist auch wichtig, um die Probe bei einer kalten Temperatur während des gesamten Protokolls zu halten, indem sie immer auf Eis, um die Proben zu übertragen. Sammeln sowohl mechanische als auch enzymatische Dissoziation Fraktionen zusammen mit Verreiben minimieren können Protokoll Erfolg verbessern, da beide Schritte Zellen traumatische sind. Unserer Erfahrung nach, während erfolgreichsten Kulturen wachsen aus beiden FraktionenHaben wir Fällen hatte, wo nur eine der beiden Präparate eine dauerhafte Kultur etabliert, was möglicherweise die empfindliche Natur dieser Proben widerspiegelt. Ein weiterer traumatischer Schritt in dem Protokoll ist Verreiben; Eine Strategie, die den Grad der Verreibung reduzieren kann, erforderlich ist, Proben zu gewährleisten, sind am Anfang der Zubereitung gründlich zerkleinert. Andere Beispiele für Aspekte des Protokolls entwickelt , um die Probe Lebensfähigkeit zu verbessern gehören das Hinzufügen Puffern (zB HEPES) während des gesamten Protokolls, das bei der enzymatischen Spaltung besonders kritisch ist.
Eine mögliche Abwandlung dieses Protokolls weiter die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen, ist die Entfernung der roten Blutkörperchen ACK Lyse. Jedoch wird in diesem Fall ist es dann oft notwendig, eine ACK Lyse während der ersten Woche in Kultur durchzuführen, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Ein weiterer Aspekt dieser Protokoll, das modifiziert werden kann, ist die Beseitigung von Myelin und Zellbruchstücke einen Sucrose densit Verwendungy-Gradienten. Insbesondere andere Strategien , die gemeldet wurden die Lebensfähigkeit der Zellen von Mikroglia - Zellen zu verbessern , sind auch möglich , bei diesem Schritt, wie beispielsweise einem diskontinuierlichen Percoll - Dichtegradienten 18 oder magnetischen myelin Entfernen Perlen.
Schließlich variiert die Dauer zwischen der anfänglichen Gewebe Dissoziation und das Auftreten von Neurosphären zwischen den Proben und kann überall von einer Woche bis zu einem Monat oder länger dauern. Da sich die anfänglichen Kulturen typischerweise ein hohes Maß an toten Zellen und Zelltrümmer enthalten, kann es schwierig sein, festzustellen, ob lebende Zellen bleiben; 8 Wochen (Bild 2) - die Kultur sollte für mindestens 4 gehalten werden. Eine Strategie zur Isolierung von wachsenden Zellen aus dem verbleibenden Schutt wird hier vorgestellt (dh Reverse Filterung Zellclustern und Wieder Plattierung in frischen Medien). Die Entscheidung darüber, ob sie weiterhin eine Kultur zu pflegen ist letztlich eine von Fall zu Fall entschieden, auf Faktoren rund um the Autopsie (zB eine längere postmortalen Intervall, Probleme bei der Gewebetransport), die Dissoziation Gewebe (zB übermäßige Blut oder Schmutz) und wie die Probe in Kultur erscheint. short tandem repeat Analyse oder eine ähnliche Methode verwendet, einen Vergleich der Kultur zu einer Probe des ursprünglichen Tumors zurückgehalten zu diesem Zweck einmal eine Kultur hergestellt wird, sollte die Identität von DNA-Fingerprinting validiert werden. Es wird empfohlen, regelmäßig Kulturen durch DNA-Fingerabdrucks Validieren, um sicherzustellen, dass keine Kontamination durch andere Kulturen aufgetreten ist, zB alle 3 - 6 Monate.
Die Erzeugung dieser Patienten stamm DIPG Kulturen stellt einen wichtigen Schritt in der erfolgreichen Entwicklung von wirksamen Therapien. Die Erweiterung der zur Verfügung stehenden Patienten stamm DIPG Kulturen und Xenotransplantatmodellen wird entscheidend sein, die wirksamsten therapeutischen Strategien zu identifizieren und letztlich dieser verheerenden Krankheit zu überwinden.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Unterstützung der McKenna Claire Foundation, Nationales Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall (NINDS K08NS070926 und R01NS092597), Department of Defense (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 und RN3-06510), Alex 'Lemonade Stehen Foundation, The Cure Starts Now Foundation und DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Entwirren Pediatric Cancer, Kindheit Brain Tumor-Stiftung, Matthew Larson-Stiftung, V-Stiftung, Godfrey Family Fund in Erinnerung an Fiona Penelope, die Wayland Villars DIPG Foundation, der Dylan Jewett Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, und Jennifer Kranz Memorial Funds, N8-Stiftung, Virginia und DK Ludwig Fonds für Krebsforschung, Child Health Research Institute an der Stanford Anne T. und Robert M. Bass Endowed Fakultät Stipendium in Pediatric Krebs und Blutkrankheiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
