Summary
Bu protokol, biyomalzemeler kullanılmadan kalp dokusunun 3D biyoprintini açıklamaktadır. 3D biyoprote edilmiş kalp yamaları bileşen küremsiklerin mekanik entegrasyonunu sergiler ve kalp dokusunun yenilenmesinde ve kalp hastalığının 3D modellerinde son derece umut vericidir.
Abstract
Bu protokol, sadece hücreler kullanılarak, biyomalzemeler kullanılmadan kalp dokusunun 3D biyoprintini açıklamaktadır. Kardiyomiyositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar önce izole edilir, sayılır ve istenen hücre oranlarında karıştırılır. Bunlar, ultra-düşük ek 96 delikli plakalar içinde bireysel kuyularda birlikte kültürlenir. 3 gün içinde sopoidler atılır. Bu sfero daha sonra vakum emiş kullanarak bir meme tarafından toplanır ve bir 3D bioprinter kullanarak bir iğne dizisi üzerine monte edilir. Daha sonra sferoidlerin iğne dizisi üzerinde sigortalanmasına izin verilir. 3D biyoprintten üç gün sonra, sferoidler, bozulmamış bir yama olarak çıkarılır; bu zaten kendiliğinden dayaktır. 3D biyoprote edilmiş kalp yamaları bileşen küremsiklerin mekanik entegrasyonunu sergiler ve kalp dokusunun yenilenmesinde ve kalp hastalığının 3D modellerinde son derece umut vericidir.
Introduction
3D biyoprintleme için birçok farklı yöntem vardır 1 , 2 , 3 . 3D biyoprinting, mürekkep püskürtmeli biyoprint, mikro ekstrüzyon biyoprint, lazer yardımlı biyoprint, metotların bir kombinasyonu veya daha yeni yaklaşımlar gibi örneklerle baskı teknolojisi 1 ile sık sık sınıflandırılır. 3D biyoprinting, iskeleye bağlı olmayan veya iskeleye bağlı yöntemler olarak sınıflandırılabilir. 3D biyoprintinin çoğu metodu, biyo-materyallere, örn., Biyometrik bağlantılar 5 veya iskele 6'ya ihtiyaç duyulduğunda, iskeleye bağlıdır. Bununla birlikte, iskele bağımlı 3D biyoprinting, iskele materyalinin immünojenisitesi, patentli bioink maliyeti, bozunma ürünlerinin yavaş hızı ve toksisitesi gibi birçok konuyu ve sınırlamaları 4 , 7 ile karşı karşıya bırakıyor.
ScafKüresel olmayan kardiyak doku mühendisliği, iskeleye bağlı doku mühendisliğinin bu dezavantajlarının üstesinden gelebilecek potansiyele sahip 8 olarak denenmiştir. Bununla birlikte, yazarların bu makalede belirttiği gibi, biofabrikasyon sürecinde sferoidleri sabit yerlerde sağlam bir şekilde tutmak ve konumlandırmak zordu. 3D biyoprint ve sferoya dayalı doku mühendisliğinin birlikte kullanımı bu zorlukların üstesinden gelme potansiyeline sahiptir. Bu protokolde, yalnızca sfero formundaki hücreleri kullanarak, diğer biyomalzemeler olmadan kardiyak dokunun 3D biyoprintini açıklıyoruz.
İskeletsiz sferoid tabanlı 3B biyoeneratörler 9 , vakumlu emici kullanarak tekli sferoidleri alıp iğne dizisine yerleştirme özelliğine sahiptir. 3D biyoprintide bir iğne dizisine küre biçimlendirme konsepti , eski Japonya'da iğne dizilerinin (" kenzan " olarak bilinir) kullanılmasından esinlenmiştirÇiçek düzenleme düzenlemeleri, ikebana. Bu sistem, sferoidlerin herhangi bir konfigürasyonda tam olarak konumlandırılmasını sağlar ve bireysel sferoitler, bir 3D biyoprote edilmiş doku oluşturmak için kısa bir süre boyunca kaynaşarak sonuçlanır. Bu yöntem, bu sayede, sferoidlerin kolaylıkla manipüle edilmesine ve iskelesiz organ biyofabrasyonunun geleceği için potansiyel etkilere sahip olmasına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kardiyomiyositlerin hazırlanması
- Tanımlanan temel zar matrisi ile kaplanmış 6 yuvalı plakalar üzerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSC'ler) üretin ve kültürleyin.
- Daha önce tarif edilen yöntemler 11 , 12 kullanarak hiPSC'leri hiPSC türevi kardiyomiyositlere (hiPSC-CM'ler) ayırt edin.
- Farklılaştıktan 19 gün sonra, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle her oyuğa 2 mL Tripsin / EDTA% 0.05'lik kardiyomiyosit sostantivoek izole edin.
- Hücrenin ayrışmasını izlemek için kardiyomiyositleri optik bir mikroskop altında izleyin.
- 2 mL Tripsin inhibitörü 0.0125% kullanarak tripsin nötralize edin.
- Izole edilmiş kardiyomiyositleri boşaltın ve bir motorize pipet dolgu kullanarak bir 50 mL konik tüp içine aktarın.
- Bir pellet elde etmek için hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 250 xg'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Pelleti 5 mL Roswell Park'a tekrar süspanse edinB-27 (RPMI / B-27 hücre ortamı) ile takviye edilmiş Memorial Institute (RPMI) hücre ortamı.
- Hücre ortamındaki hücrelerin 20 μL'sini pipetleyin ve eşit miktarda% 0.4 Trypan Mavi çözeltiyle leke uygulayın.
- Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve hücre canlılığını saymak ve elde etmek için otomatik bir hücre sayacı veya manuel hemositometre kullanın.
2. Fibroblastların Hazırlanması
- İnsan kalp fibroblast (HCF) (yetişkin ventriküler tip) hücre hattını 13 başlatınız.
- HCF kültürü protokollerine uygun olarak geçiş yapın ve izole edin 13 .
- Hücre ortamındaki hücrelerin 20 μL'sini pipetleyin ve Trypan Mavisi çözeltisinin% 0.4'lük eşit miktarda lekelenmesini sağlayın.
- Yeni hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve hücre yaşayabilirliğini saymak ve elde etmek için otomatik bir hücre sayacı veya manuel hemositometre kullanın.
3. Endotel Hücrelerinin Hazırlanması
- Insan umn başlatmakAçıklandığı gibi ilik ven endotel hücresi (HUVEC) hattı. Geçiş yapın ve tarif edildiği gibi HUVEC kültürleme protokollerine uygun olarak izole edin.
- Hücre ortamındaki hücrelerin 20 μL'sini pipetleyin ve eşit miktarda% 0.4 Trypan Mavi çözeltiyle leke uygulayın.
- Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve hücre canlılığını saymak ve elde etmek için otomatik bir hücre sayacı veya manuel hemositometre kullanın.
4. Ortak kültür:
- Bir hiPSC-CM'de 50 mL'lik bir konik tüp içinde karışık hücre çözeltisi stoğu oluşturmak için RPMI / B-27 hücre ortamında üç hücre tipini (hiPSC-CM, HCFler ve HUVEC'ler) karıştırın: HCF: HUVEC hücre oranı 70:15:15 ve mL başına 165.000 hücre konsantrasyonu.
- Karışık hücre çözeltisini, çok kanallı bir pipet kullanarak, oyuk başına 200 μL ya da oyuk başına 33.000 hücre ile ultra-düşük ek 96-iyi U-alt plakalara dağıtın.
- 96 oyuklu plakaları 3 gün inkübe edin (37 ° C,% 5 karbon dioksIde,% 95 nem).
- Işık mikroskopisi altında bireysel kuyuların merkezinde ve altındaki karışık hücre çok hücreli sferoitlerin varlığını kontrol edin.
NOT: İki boyutlu bir mikroskobik projeksiyonda, bu sfero şekli dairesel görünür ( Şekil 1 ). Sferoitler, ultra-düşük bağlanma 96 delikli plakalara hücre tohumlamasından sonra 24 saat içinde oluşmalıdır. Sferoidler, 96 gözlü plakalara hücre tohumlamasından sonra 48 saat içinde atmaya başlamalıdır. Dövülmeyen sferoitler, son 3D biyoprintili kalp yamasının işlevsel olmasını sağlamak için 3D biyoprinting için kullanılmamalıdır. Connexin 43 (Cx43) ve troponin için spermlerin immünfloresansı, sfero hücresel bileşimi ve kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir 15 .
5. İskele-Özlü Kardiyak Dokuların 3D Biyoprinti
- Sferoidleri içeren plakları, iskelesiz sferoid tabanlı 3D bioprinter dergilerine yerleştirin.
- 3D bioprinter'ı açın ve 3D bioprinting yazılımını çalıştırın.
- "Auxillary", "Operation Preparation", "Inspect Mode" ve "Home Return" tuşlarına tıklayın.
- Sfero kontrolü başlatmak için "Başla" altındaki yeşil simgeyi tıklayın.
- Ekrandaki "(2) Dia (μm)" sütununun altında sferoid çaplarının görünmesini bekleyin.
- Ortalama sfero çapını en yakın 100 μm'ye çıkarmak için "Başlangıç ayarları" nı tıklayın ve yığın Z aralığına (μm) ortalama küresel dönüş çapını girin.
- "Toplam" ı tıklayın, "Katmanlar" altındaki sayı otomatik olarak yeniden ayarlanmalıdır. Ayarları onaylamak için "Uygula" yı tıklayın.
- "İğne Dizisi Haritası" nı tıklayın, "Katman No" na gidin, 3B biyoprint için istenen katmanı seçin ve bireysel küre biçimlerini seçerek ekranın solundaki haritada harita üzerinde istediğiniz 3D biyoprint tasarımını çizin. ClicK "3D bioprinting tasarımını onaylamak için" Uygula "yı tıklayın.
- İğne dizisi incelemesine başlamak için "İğne Dizi Kontrolü" nü tıklayın. İğne dizisi odak dışındaysa, kamera odağı ayarlamak için 0 ila 500 μm arasında değişen değerleri "OffsetZ (μm)" içine girin, 500 μm'den başlayan ve 100 μm ila 0 μm'lik bir azalma.
- "Muayene Parametreleri", "Tip 1" i tıklayın ve "Çap (μm)" değerini istediğiniz çap aralığına ayarlayın. "Yuvarlaklık (%)" ve "Düzgünlük (%)" değerlerini istediğiniz yüzdelere ayarlayın. Ayarları onaylamak için "Uygula" yı tıklayın.
NOT: Burada sfero çapları 450 μm ila 550 μm arasında ayarlanmıştır. "Yuvarlaklık (%)" ve "Düzgünlük (%)", her bir kürecik için bilgisayar tarafından hesaplanan değerlendirmelerdir. Burada "Yuvarlaklık (%)" için kullanılan ayarlar% 60 ve "Düzgünlük (%)" için% 70'tir. - "Durum" u tıklayın ve "Çap (μm)" değerini aynı ayara güncelleyinS önceki adımda. Ayarları onaylamak için "Uygula" yı tıklayın.
- 3D biyoprinterin memesini vakumla emerek ve bir iğne dizisindeki belirli yerlere sferoid yerleştirerek sfero başlamak için "Yığın Modu" nu ve ardından "Başlat" altındaki yeşil simgeyi tıklayın.
NOT: 81 sfero (9 küremsi x 9 küremsi) içeren bir kalp yaması için, 3B biyoprodizyonu yaklaşık 20 ila 30 dakika sürmelidir. - Biyoprintten sonra, steril forseps kullanarak, 3 boyutlu biyoprote edilmiş yama içeren iğne dizisini topla ve 150 mL RPMI / B-27 hücre ortamı içeren 250 mL steril behergreye aktar.
- 3D biyoprote edilmiş yamayı iğne dizisi ile 3 gün inkübe edin (37 ° C,% 5 karbon dioksit,% 95 nem).
6. İğne Dizi ve Doku Matürasyonundan 3D Biyopetilen Düzeltme Bırakma
- Üç gün bekletildikten sonra bir eliniz iğne dizisinin tabanında, diğeri plastik kapakta tYama, ipliğin dizisinden 3D biyoprote edilmiş yamayı çıkarmak için plastik kapağı hafifçe kaydırın.
NOT: Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yağlama işlemi, bu adımdan hemen önce iğnelere gerektiğinde uygulanabilir ve daha düzgün ve kolay bir şekilde çıkarılabilir. - Bir çift steril forseps kullanarak, üzerine 3D biyoprote edilmiş yama ile plastik kapağı kaldırın ve yama ve plastik kapağı RPMI / B-27 hücre ortamı içeren 35 mm çanağa aktarın.
- Yamayı medyaya bırakmak için forseps hala plastik kapağı tutarak, RPMI / B-27 hücre medyasındaki yama ile plastik kapağı hafifçe sallayın.
- 3D biyopetilen yamanın işlevsel olduğundan emin olmak için dayak mı edip etmediğini görselleştirmek için ışık mikroskopisi altında 3D biyoprote edilmiş yamayı inceleyin.
- 3 boyutlu biyoprote edilmiş yamayı 3 gün veya daha uzun süre 35 mm çanağında inkübe edin (37 ° C,% 5 karbon dioksit,% 95 nem).
NOT: 3 gün sonra sferoidler birbirine kaynaşır ve içindeki deliklerIğnelerin bulunduğu yama artık görünür olmamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adım 4.4'ün (ortak kültür) sonunda, yerçekimi ile küre biçimlendirmek için her kuyucuktaki hücreler ultra-düşük ek 96-kuyucuk U-alt plakalarının tabanında birikmelidir. Bu sferoitler, hiPSC-CM, HCF'ler ve HUVEC'leri içerir ve iki boyutlu projeksiyon ile dairesel görünmeleri gereken ışık mikroskopisi altında görsel olarak incelenebilir ( Şekil 1 ). 6.3. Adımın sonunda, 3D biyoprote edilmiş kardiyak yama, iğne dizisi tarafından oluşturulan iğne deliklerine bağlı olarak doku boşluklarını içermelidir ( Şekil 2 , solda). Bu noktada, sferoitler arasındaki sınırlar belirsizleşmeli ve yamaların mekanik bütünleşmesi sergileyerek kendiliğinden atılmaya başlamış olması gerekirdi. 6. adımın sonunda doku boşlukları çevreleyen doku tarafından doldurulmalıdır ( Şekil 2 , sağ), 3D biyoprote edilmiş kalp yaması bea devam etmelidirKendiliğinden.
Şekil 1 : Karışık hücre çok hücreli sferoidlerin oluşturulması. HiPSC-CM, HCFler ve HUVEC'ler, 70:15:15 hiPSC-CM: HCF: HUVEC hücre oranı ile karıştırıldı ve hücre karışımı, ultra-düşük ekli 96 gözlü U-alt plakalara dağıtıldı. 24 saat içinde, karışık hücre çok hücreli sferoitler (sol, sağ) her kuyuda bir tane meydana geldi. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Sferoidlerin mekanik bütünleşmesini gösteren kalp dokusunun oluşturulması . 3D biyoGörülebilir iğne delikleri olan iğne dizisinden çıkarıldıktan hemen sonra, basılı kalp pili (solda). Şu anda küremsiler arasındaki sınırlar belirsizleşti ve yama kendiliğinden dayanıyordu, bu nedenle küremsikler mekanik olarak bütünleşmişti. İğne dizisinden çıkarıldıktan üç gün sonra, iğne dizisinden kaynaklanan doku boşlukları çevreleyen doku (sağda) ile dolduruldu ve yama spontan atmaya devam etti. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul etmektedir: Kardiyovasküler Araştırmalar İçin Önemli olan Sihir ve Maryland Kök Hücre Araştırma Fonu (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
References
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,. , http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. Immunofluorescence Method for IHC Detection. , https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
