Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Published: April 1, 2017 doi: 10.3791/55498
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

Summary

Vi præsenterer her protokoller for affinitetsoprensning af proteinkomplekser og deres separation ved blå nativ PAGE, efterfulgt af protein korrelation profilering ved anvendelse etiket fri kvantitativ massespektrometri. Denne metode er nyttig til at løse interactomes i distinkte proteinkomplekser.

Introduction

I celler, de fleste proteiner udfører deres funktioner gennem forbigående protein-protein-interaktioner eller ved dannelse af stabile protein-aggregater. Karakterisering proteininteraktioner er afgørende for fuldt forstå cellulære processer. Affinitetsoprensning i kombination med massespektrometri (AP-MS) er en af ​​de mest almindeligt anvendte strategier til at identificere native protein-interaktioner. Væsentlige forbedringer i instrument kapaciteter opnået i de seneste ti år har gjort denne fremgangsmåde ekstremt kraftfuld. Det er vigtigt at bemærke, at interaktionerne identificeret ved AP-MS eksperimenter, indbefatter en blanding af direkte og indirekte sammenhænge mellem agn og byttedyr. Desuden ofte proteiner deltage i flere forskellige komplekser inden for samme cellulære kontekst, som kan have forskellige biologiske roller, og derfor interaktionskandidater, som er identificeret ved AP-MS kan udgøre en blanding af forskellige protein-samlinger eller funktionelle enheder. Det er ikke muligt at udledesådan topologisk information a priori fra mono-dimensionelle lister over proteiner der genereres af simple AP-MS eksperimenter. Imidlertid kan teknikken udnyttes yderligere at definere arkitekturen af ​​proteinkomplekser ved at kombinere det med en eller flere metoder til at løse disse enheder.

For at løse topologien af ​​protein interaktioner identificeret ved AP-MS, har flere strategier blevet anvendt. En fremgangsmåde er at udføre iterative AP-MS forsøg under anvendelse byttedyr identificeret i en tidligere runde af forsøg som lokkemad 1. Selvom meget informativ, dette er en ganske arbejdskrævende opgave både eksperimentelt og analytisk. Protein tværbinding i kombination med massespektrometri anvendes i stigende grad til at udlede topologisk information om proteinkomplekser 2, 3, 4, 5. Men computational analyse af tværbundne peptider stadig en udfordrende opgave og dermed er flaskehalsen i arbejdsgangen. Fremkomsten af MS-spaltelige tværbindingsreagenser bør lette kortlægning af aminosyreresterne, der er i tæt nærhed i interagerende proteiner 6, 7. Et andet alternativ er at kombinere affinitetsoprensning med kendte ortogonale separationsteknikker 8, 9. Kromatografisk fraktionering ved gelfiltrering eller ionbytning eller saccharosegradientfraktionering er også for nylig blevet anvendt i kombination med kvantitativ massespektrometri til at beskrive multiproteinkomplekser på et system-plan, for at omgå den komplekse isolation trin 10, 11, 12, 13. Blå nativ polyacrylamidgelelektroforese (BN-PAGE) har været almindeligt anvendt tilundersøge native protein-interaktioner, typisk dem, der involverer mitokondriske membran proteinkomplekser 14. Denne adskillelse teknik blev også for nylig anvendes i kombination med etiket-frit protein kvantificering og korrelation profilering, ikke kun på mitokondrielle komplekser 15, 16, 17, men også for optrevling andre proteinkomplekser fra hele celler 18, 19. Vi antager, at kombinationen af ​​affinitetsrensning med efterfølgende native fraktioneringstrin tilgange og kvantitativ MS bør give en nyttig strategi til løsning af flere proteinkonstruktioner indeholdende et særligt protein.

Her beskriver vi en fremgangsmåde, der kombinerer generiske epitopbaseret affinitetsoprensning med blå nativ polyacrylamidgelelektroforese af de isolerede komplekser, efterfulgt af kvantitativ masse spectrometry og protein korrelation profilering, for at løse de mange samlinger et protein kan være involveret i. Vi anvender musen embryonale stamceller, hvor et protein af interesse fusioneret til et epitopmærke udtrykkes fra det endogene locus for at opnå tæt på fysiologisk overflod og sikre en effektiv native kompleks isolation. Denne tilgang optrevler de multiple interaktioner et protein indgriber i, at løse dem i særskilte enheder baseret på deres sammenligningstabeller profiler, mens ikke kræver mere arbejde end konventionelle geLC-MS 20.

Protocol

1. Isolering af Native proteinkomplekser ved FLAG Affinitetsoprensning

  1. præparater
    1. Oprettet et 37 ° C vandbad i optøning cellepelleten.
    2. Køle ned en mikrocentrifuge til 4 ° C.
    3. Placere flere mikrocentrifugerør af forskellig størrelse (1,5 ml, 15 ml) og en homogenisator i is.
    4. Fremstilling af 10 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) og holde i is. Lige før anvendelse af puffer, tilsættes 10 pi 1 M DTT og en knust tablet af EDTA-fri proteaseinhibitorer.
  2. Fremstilling af antistof-koblede perler
    BEMÆRK: antistof-coatede perler kan fremstilles op til en uge i forvejen og opbevares i køleskab indtil de skal bruges. Protein G har højere affinitet end protein A for de fleste arter immunoglobulin undertyper, bortset kanin IgG, til hvilket protein A har højere affinitet.
    1. Vask 50 pi Protein G-belagte magnetiske kugler: Overførsel 50 &# 956 L af perleopslæmningen til et mikrocentrifugerør, anbringes glasset i magneten at indsamle perlerne på siden af ​​røret og fjerne væsken. Resuspendere perlerne i 0,5 ml PBS-0,01% Tween-20.
    2. Glasset anbringes i magneten at indsamle perlerne på siden af ​​røret og fjerne væsken. Resuspendere perlerne i 40 pi PBS-0,01% Tween-20. Tilsæt 10 ug (10 pi 1 mg / ml stamopløsning) af M2 anti-FLAG-antistof. Inkuber med rotation i 20 minutter ved stuetemperatur.
    3. Glasset anbringes i magneten at indsamle perlerne på siden af ​​røret og fjerne væsken. Vask perlerne med 0,5 ml PBS-0,01% Tween-20.
    4. Til tværbinding af antistoffet til perlerne vaskes perlerne to gange med 1 ml 0,2 M triethanolamin pH 8,2. Derefter resuspendere perlerne i 1 ml 20 mM DMP (dimethyl pimelimidate) i 0,2 M triethanolamin pH 8,2 (DMP opløsning skal fremstilles frisk umiddelbart før brug). Inkuber med rotation ved stuetemperatur i 30 min. Glasset anbringes i magneten. Fjern supernatanten og resuspender perlerne i 0,5 ml 50 mM Tris-HCI pH 7,5. Inkuber med rotation ved stuetemperatur i 15 min.
    5. Vask perlerne 3 gange med 0,5 ml PBS-0,1% Tween-20. Lad perler i den sidste vask indtil de skal bruges.
  3. FLAG-baserede affinitetsoprensning
    BEMÆRK: Pas på ikke at forlade perlerne uden buffer for en længere periode. Alle buffere og rør skal opbevares i is på alle tidspunkter. Den følgende protokol er optimeret til oprensning af proteinkomplekser fra 2-5 x 10 8 celler (10-20 mg protein lysat), der udtrykker endogene niveauer af et FLAG-mærket protein 20.
    1. Tø cellepelleten i et vandbad ved 37 ° C, indtil det begynder at smelte. Tage røret ud af badet, slyng den forsigtigt, indtil pelleten er fuldstændig optøet, og straks placere røret indeholdende cellesuspensionen på is.
    2. Tilsæt 5 ml iskold lysepuffer(Indeholdende DTT og proteaseinhibitorer) til cellesuspensionen og hvirvel for at blande. Inkuber i is i 10 min.
    3. Overfør lysatet til en kold Dounce homogenisator. Lyse med 20-30 slag ved hjælp af den stramme støder (indtil der ikke er mærkbar viskositet). Overfør homogenatet til kolde mikrocentrifugerør.
    4. Centrifuge ved 18.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
    5. Overfør det klarede lysat til en ren kold rør. Lad 50 ul lysat bag. Læs 35 pi alikvot af lysatet til måling proteinkoncentration og overvåge oprensning.
    6. Fjern PBS-0,1% Tween-20 fra perlerne. Resuspendere perlerne med 1 ml af lysatet og blandes med resten af ​​lysatet. Inkuber blandingen i et roterende hjul ved 4 ° C i 1-2 timer.
    7. Indsamle perlerne på siden af ​​røret med magneten. Indsamle en 30 pi alikvot af supernatanten og kassér resten af ​​supernatanten. Resuspendere perlerne i 0,5 ml IPP150 buffer (10 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% NP-40) ved pipettering 4-6 gange. Overførsel til et 1,5 ml kold rør.
    8. Gentag vaske med 0,5 ml IPP150 puffer to gange mere.
    9. Vask perler tre gange med 0,5 ml FLAG native elueringspuffer (20 mM Bis-Tris pH 7, 20 mM NaCl, 0,02% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM ε-aminocapronsyre). Med den sidste vask, overføre perlerne til en ny kold rør. Fjern buffer grundigt.
    10. Resuspendere perlerne i 100 pi 200 pg / ml 3x FLAG-peptid i nativ elueringsbuffer. Inkuber ved 4 ° C i 10 minutter under forsigtig rotation.
    11. Indsamle perlerne med magneten og overføre supernatanten til en kold nyt rør.
    12. Gentag trin 1.3.10-1.3.11 to gange. Pool alle eluaterne.
    13. Koncentrer eluatet ned til 25 pi i en centrifugal filterenhed (10 kDa nominel molekylvægtgrænse cut-off, PSE) ved centrifugering ved 10.000 xg ved 4 ° C. Overføre den koncentrerede eluat til en ny kold rør og tilsættes 50% glycerol for en slutkoncentration på 5%. Den koncentrerede eluat kan opbevares ved 4 ° C natten, hvis det kræves.

2. Blå Native SIDE

  1. præparater
    1. Forbered 1 L 1x indfødte SIDE anodebuffer, 1x indfødte SIDE Mørkeblå Cathode Buffer og 1x indfødte SIDE Lyseblå Cathode Buffer.
    2. Fjern kammen af ​​en forstøbt 3-12% nativ PAGE-gel og vask af brøndene to gange med 1x nativ PAGE Mørkeblå Cathode Buffer. Fyld brøndene med 1x indfødte SIDE Mørkeblå Cathode Buffer. Opsæt gelen i driften tank, men ikke tilføjer Mørkeblå katode Buffer til katoden (inde) kammer.
  2. Elektroforetisk løb
    1. Forberede prøven: Til de 25 pi koncentreret eluat tilføje passende volumen 4x native prøvepåsætningsbuffer og 0,5% G-250 prøve additiv til slutkoncentrationer på 1 x og 0,005% hhv.
    2. Indlæse prøven og native molekylvægtmarkører efterlader en tom brønd between dem. Belastning 10-20 pi 1x native prøvepåsætningsbuffer i alle de tomme brønde.
    3. Fylde katoden (indeni) kammer med 200 ml 1x nativ PAGE Mørkeblå Cathode Buffer omhyggeligt for ikke at forstyrre prøverne. Fyld anoden (udenfor) kammer med 550 ml 1x nativ PAGE Anode Buffer.
    4. Køre gelen ved 150 V i 30 minutter. Stop kørslen, skal du fjerne Mørkeblå Cathode Buffer med en serologisk pipette og erstatte med 1x Light Blue Cathode Buffer. Fortsæt flugt i 60 min. Gelen kan køres ved stuetemperatur eller ved 4 ° C; temperaturen kan have en virkning på protein-kompleks struktur.
  3. Gel farvning
    1. Åbne gelkassetten og kassere en af ​​kassettens plader. Gelen forbliver fastgjort til den anden kassette plade. Overføre gelen i en bakke eller en beholder indeholdende tilstrækkelig fikseringsopløsning (40% methanol, 2% eddikesyre) for at dække gelen og inkuber i 30 minutter med forsigtig rystning.
    2. Fjern fiksativ solution og tilsæt vand nok til at dække gelen. Gelen kan scannes til fremtidig reference.

3. massespektrometri Analyse

Bemærk: bør udføres Alle efterfølgende trin i en laminær strømning om muligt at sikre renlighed af prøverne. Alle opløsninger skal fremstilles med HPLC-kvalitet vand. Diskuter denne protokol med massespektrometri laboratorium, der foretager analysen.

  1. præparater
    1. Placer en konisk bund plade med 96 brønde oven på en anden plade med 96 brønde for at opsamle affaldet. Gennembore bunden af ​​brøndene i den koniske bund 96 brønde med en 21 G nål.
    2. Vask brøndene i gennemboret med 96 brønde.
      1. Tilsæt 200 pi af 50% acetonitril-0,25% myresyre til brøndene i den hullede plade. Inkubér pladestabelen i et rysteapparat i 10 min.
      2. Centrifuger ved 500 xg i 1 min, således at væsken strømmer gennem huller i affaldsindsamling plade. Kassér waste væske.
      3. Gentag trin 3.1.2.1-3.1.2.2 to gange mere.
      4. Fyld brøndene i gennemboret plade med 96 brønde med 150 pi 50 mM ammoniumbicarbonat (frisk gjort).
    3. Vask brøndene i en centrifugal filtrering plade med 96 brønde.
      1. Placer en normal 96-brønds plade under centrifugal filtrering plade til opsamling af affald. Tilsæt 200 pi af 50% acetonitril-0,25% myresyre til hver brønd i centrifugalfiltreringsenheden plade.
      2. Centrifugeres pladestabelen ved 200 xg i 1 min. Kassér affaldet.
      3. Gentag trin 3.1.3.1-3.1.3.2 to gange mere.
  2. Gel udskæring og i gel fordøjelse
    BEMÆRK: Mens udskære gel, identificere og gøre et notat af gelen skive justeret til hver af proteinstandarder. Protein- standarder kan anvendes til at estimere omtrentlige molekylvægte for alle gelskiver.
    1. Placer gelen med glaspladen på en ren overflade. Skær den vognbane indeholdering prøven i 48 identiske skiver (1,5 mm x 5 mm). Skær hver skive i 2-3 mindre stykker (undtagen de sidste fem skiver i toppen af ​​gelen) og placere hver skive sekventielt i en brønd af gennemboret og vasket med 96 brønde.
    2. Tilsæt 50 uL acetonitril til hver brønd. Inkubér pladen under omrystning i 30-60 min. Væsken fjernes ved centrifugering som i trin 3.1.2.2.
    3. Tilsæt 200 pi 2 mM TCEP i 50 mM ammoniumbicarbonat til hver brønd. Inkubér pladen under omrystning i 30 minutter ved stuetemperatur. Væsken fjernes ved centrifugering som i trin 3.1.2.2.
    4. Tilsæt 200 pi 4 mM iodacetamid i 50 mM ammoniumbicarbonat til hver brønd. Inkubér pladen under omrystning i 30 min ved 37 ° C i mørke. Væsken fjernes ved centrifugering som i trin 3.1.2.2.
    5. Tilsæt 150 pi af 50 mM ammoniumbicarbonat plus 50 pi acetonitril og inkubere pladen med omrystning i 30 minutter ved stuetemperatur. Gentag dette vasketrin ens mange gange som nødvendigt, indtil alle de blå farve fjernes fra gelstykker.
    6. Dehydrere gelstykker ved tilsætning af 200 pi af ren acetonitril og inkuberes med omrystning ved stuetemperatur i 20 minutter, indtil gelstykkerne er hvide og uigennemsigtige. Fjerne acetonitril.
    7. Tilsæt 150 pi 0,001 mg / ml trypsin (sekventeringskvalitet) i kold 50 mM ammoniumbicarbonat til hver brønd. Inkubér pladen under omrystning ved 37 ° C i 2 timer. Efter 1 time kontrollere, gelstykkerne er dækket med væske; hvis dette ikke er tilfældet, tilføje en anden 50-100 pi 50 mM ammoniumbicarbonat. Efter 2 timer ved 37 ° C, fortsætte fordøjelsen ved 25 ° C natten over.
    8. Placer en ren konisk bund plade under gelen indeholdende plade, som sikrer korrekt orientering af pladerne. Indsamle væsken indeholdende peptiderne ved centrifugering ved 200 xg i 1 min.
    9. Placer peptider-indeholdende plade i en centrifugal fordamper og fordampe væsken med udøvelsen than næste trin.
    10. Tilsæt 150 pi af 50% acetonitril-0,25% myresyre til gelstykkerne. Inkuberes med omrystning ved 37 ° C i 30 minutter.
    11. Opsamling af væsken ind i det delvist tørrede plade fra trin 3.2.9 ved centrifugering ved 200 xg i 1 min. Fortsætte afdampning af peptider indeholdende plade samtidig udfører det næste trin.
    12. Gentag trin 3.2.10-3.2.11.
    13. Tilsæt 200 pi af ren acetonitril til hver brønd i pladen indeholdende gelstykker. Inkuber under omrystning ved stuetemperatur i 15 minutter.
    14. Samle væsken i peptider indeholdende plade ved centrifugering ved 200 xg i 1 min.
    15. Sørge slutkoncentrationen af ​​acetonitril i alle brønde er over 55%. Hvis det er nødvendigt, tilføje ekstra ren acetonitril.
    16. Overfør peptidopløsningerne til den vaskede centrifugal filtrering plade. Placer en ren konisk bundplade nedenunder at indsamle peptiderne. Centrifugeres pladestabelen ved 200 xg i 1 min.
    17. Evaporspiste væsken i den koniske bund plade indtil brøndene er helt tørre. Pladen kan dækkes med en silicone låg og opbevaret ved -20 ° C på dette tidspunkt.
    18. Re-opløse peptider i 32 pi 0,5% myresyre under kraftig omrystning i 15 minutter. Tilføje 8 pi 400 mM ammoniumbicarbonat og inkuberes under kraftig omrystning i 15 minutter. Centrifugeres pladen ved 200 xg i 1 min. Dæk med et silikone låg og opbevar pladen ved -20 ° C indtil massespektrometrianalyse.
  3. massespektrometri
    BEMÆRK: Analyser peptider på en høj opløsning massespektrometer under anvendelse af fremgangsmåder, der er forenelige med shotgun proteomics. Dataafhængig erhvervelse er den mest almindeligt anvendte LC-tandem MS sat op til denne type analyse og bør optimeres til effektiv peptididentifikation, minimere overflødige sekventering og kandidatudvælgelse løbet baggrundsstøj. Massespektre i det første trin masseanalyse scanning (MS1) registreres i profil tilstand. Det anbefalesed til fortrinsvis vælge dobbelt og tredobbelt ladede ioner til andet trin masseanalyse (MS2). En masse vifte af m / z 400-1,600 er egnet til at identificere de fleste peptider mellem 8-30 aminosyrer rækkevidde. Her, er en protokol til analyse under anvendelse af en Orbitrap massespektrometer billede.
    1. Injicer 20 pi prøve pr analyse ved hjælp af autosampler på en nanoLC-MS / MS-system. Afsalte og koncentrere peptider på en omvendt fase-C18-søjle (100 um id, 2 cm).
    2. Separate peptider på en analytisk C18-søjle (75 um id, 15 cm) under anvendelse af en 30 min lineær gradient af 4-28% acetonitril / 0,1% myresyre ved 300 nL / min.
    3. Analyser peptider i et massespektrometer med en top 10 dataafhængig erhvervelse metode med følgende parametre: m / z området 380-1,600, opløsning 30.000 ved m / z 400, isolation bredde på 2 Th, dynamisk udstødelse på ± 10 ppm i 45 s , automatisk target forstærkningsregulering ved 1 x 10 6 til MS og 5.000 for MS / MS, maksimal injektionstid 150 ms for MS og100 ms for MS / MS.

4. Data Analysis

  1. Protein identifikation og kvantificering ved hjælp MaxQuant
    1. Brug den gratis MaxQuant software til at identificere og kvantificere proteiner i hver gelfraktion fra massespektrometri rådata.
      BEMÆRK: MaxQuant virker på data genereret af data-afhængige erhvervelse shotgun proteomics tilgange. De MS-data fra de blå native gelfraktioner bør analyseres i batch som separate eksperimenter og ikke som brøkdele af et eksperiment kombinerer alle gelskiver. Kontroller iBAQ værdi feltet ved støkiometri beregninger. Detaljerede protokoller til databasesøgning og protein kvantificering under anvendelse MaxQuant er beskrevet i 21, 22.
  2. Protein profil analyse ved hjælp Perseus
    1. Brug den gratis software Perseus at vise migrationen profiler af de identificerede proteiner og sammenligne dem ved hjælp afStatistisk analyse.
      BEMÆRK: Generel dokumentation om, hvordan man bruger Perseus er tilgængelig på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. En prøve datasæt er til rådighed som supplerende data.
    2. Upload proteingroups.txt fil returneret af MaxQuant analyse indeholder proteinet identifikationer og kvantificering værdier for alle gelfraktioner. Befolke intensitetsværdierne til Main (Figur 1). En matrix vises som indeholder alle protein-identifikationer i rækker, med gelfraktioner som kolonner.
    3. Fjern poster svarende til revers hits, proteiner kun identificeret ved stedet og potentielle kontaminanter ved at vælge Filter rækker baseret på kategoriske kolonne i Filter rækker rullemenu (figur 2).
    4. Normalisere fraktion intensiteterne af hvert protein tværs profilet mod det totale protein intensitet ved at vælge Opdel i rullemenuen Normalize, derefter Sum (figur 3). En ny mATRIX vises.
    5. Vise migration profil plots af alle proteiner ved at vælge Profile Plot i Visualisering rullemenu (figur 4).
    6. Vælg Filter rækker baseret på gyldige værdier i filteret rækker rullemenu. Indtast 1 i antallet af gyldige værdier, der kræves.
    7. Udføre hierarkisk klyngedannelse af identificerede proteiner på tværs af alle blå native gelfraktioner ved at vælge Hierarkisk klyngedannelse i Clustering / PCA rullemenu. Fjerne markeringen i Kolonner træet (Figur 5). Klyngerne visualiseres i en varme-kortet i fanen Clustering siden af matricen (figur 6).
    8. Lokalisere klyngen indeholdende bait-proteinet i dendrogrammet. Andre komponenter i klyngen repræsenterer proteiner co-migrerer med agn og er derfor potentielle interagerende proteiner / underenheder af det samme kompleks.

figur 1 r /> Figur 1. Skærmbillede af Perseus data upload vindue. Figuren viser ilægning proteinidentifikation og kvantificering data i Perseus. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2. Skærmbillede af Perseus vindue til filtrering af registreringer svarende til forureninger, reverse hits og proteiner identificeret ved site. Udvælgelse Filter rækker ved kategoriske kolonne åbner et nyt vindue for at udvælge de protein-firmaer skal fjernes fra datasættet. Klik her for at se en større version af dette tal.

/55498fig3.jpg"/>
Figur 3. Skærmbillede af Perseus normalisering vindue. Valg Divide i menuen Normalisering åbner et nyt vindue, med forskellige muligheder. Udvælgelse Sum opdeler intensitetsværdien af ​​et protein i hver fraktion med den samlede intensitet af dette protein på tværs af alle fraktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 4
Figur 4. Skærmbillede af Perseus viser migration profil plots. Proteiner kan vælges i nedenstående matrice profilerne for at fremhæve deres tilsvarende profil. Værktøjslinien kan bruges til at redigere og eksportere profiler. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 5. Skærmbillede af Perseus hierarkisk klyngedannelse vindue. Figuren viser indstillingerne for hierarkisk klyngedannelse af proteiner under anvendelse af Manhattan (L1) afstand metric. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Skærmbillede af Perseus viser dendrogram og protein intensiteter Heatmap. Arbejdsgangen på højre side af hovedpanelet viser hvert trin udføres, og den resulterende matrix, og kan bruges til at fortryde nogen trin. Arbejdsgangen kan også forgrene fra enhver mellemliggende matrix. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Beregning af relativ støkiometri
    1. Vælg de underenheder af et protein kompleks baseret på deres samarbejde clustering med agn protein og afgrænse peak profil (er), hvor de vises.
    2. Brug iBAQ værdier, der returneres af MaxQuant analyse for hver subunit i hver fraktion separat og normalisere med den tilsvarende agn iBAQ værdi i at fraktion.
    3. Plotte normaliserede iBAQs for agn og protein komplekse underenheder tværs fraktionerne af den valgte top og anvende lineær regression. Beregne relative mængde af kompleks subunit at lokkemad ved at sammenligne tendenserne i deres normaliserede iBAQ værdier.
  2. Estimering af protein-kompleks størrelse
    1. Brug proteinstandarder at beregne forudsagte molekylvægte for justeringstransportanordningeme blå native gelskiver fra prøven lane. Ud fra disse generere en lineær regressionsmodel ved at afbilde gelskiver i x-aksen og molekylvægte i y-aksen. Bruge modellen til at estimere den observerede molekylvægtområde af proteinet kompleks (er) baseret på blå native skive (r), hvorfra de blev identificeret.

Representative Results

Arbejdsgangen af Affinitetsoprensning Blå native protein Correlation profilering af massespektrometri (ABC-MS) strategi er afbildet i figur 7. Native proteinkomplekser omkring et protein af interesse isoleres ved affinitetsoprensning under anvendelse af antistoffer mod en epitop-tag (i dette tilfælde FLAG) og kompetitiv eluering. Komplekserne løses af BN-PAGE, og hele gelbanen udskæres i 48 sektioner, og forberedt til shotgun LC-MS / MS. Kvantitativ MS oplysninger bruges til at generere en migration profil for hver identificeret protein på tværs af blå native adskillelse. Proteiner, der interagerer for at danne et særskilt kompleks display lignende profiler migration med overlejres toppe. Når et protein af interesse deltager i mere end én samling multiple toppe observeret i sin vandring profil, i betragtning af de sub-komplekser er inden opløsningsevne af det blå nativ gel. En systematisk sammenligning af migration profiler kan opnås ved protein korrelation profilering anvendelse hierarkisk klyngedannelse. Dendrogrammet og topintensiteterne for alle fraktioner visualiseres i en varme-kort, hvilket letter identifikationen af interagerende proteiner, der hører til forskellige proteinkomplekser (figur 8).

Vi brugte denne strategi til at analysere de interagerende partnere MTA2, en kerne underenhed af NuRD kromatin remodeling kompleks 20. Som vist i figur 9, migration profil MTA2 vises to toppe af distinkte intensiteter mellem 700 kDa og 1,2 MDa, med den nedre massetop vise højere overflod. Andre NuRD core underenheder, herunder Mta1 / 3, HDAC1 / 2 og Mbd3, viste identisk adskillelse mønster, omend toppene for nogle af de underenheder, nemlig Chd4, Gatad2a / b og Rbbp4 / 7, havde den inverse overflod distribution (figur 9A, B). I modsætning hertil profilen af ​​Cdk2ap1, en regulatorisk faktor, der rekrutterer NuRD komplekset til Wnt genpromotorer 23, vises kun den højere masse top (figur 9C), og det gjorde Sall4, en transskriptionsrepressor der også er blevet vist at binde NuRD 20, 24, 25. Således, fraktionering af affinitetsrensede MTA2-associerede proteiner ved blå nativ PAGE var i stand til at løse to forskellige former af NuRD kompleks.

ABC-MS tillader også identifikation af hidtil ukendte interaktører samtidig tildele dem til bestemte protein enheder. Ved undersøgelse af proteinerne klynger og fraktion intensiteter repræsenteret i en varme-map detekteret vi en stærk korrelation mellem NuRD underenheder og Wdr5, en regulatorisk underenhed af MLL methyltransferase kompleks 26, med Wdr5 udviser to migration toppe sammenfaldende med de to NuRD peaks (figur 8), hvilket tyder på en hidtil ukendt vekselvirkning mellem Wdr5 og NuRD. Vi bekræftede denne interaktion ved co-immunpræcipitering og co-migration i gelpermeationskromatografi 20.

Valget af afstand metriske beregning i den hierarkiske klyngedannelse vil påvirke formen af ​​klynger og dermed sammenhænge. Vi anbefaler, at eksperimentere med de forskellige målinger til at opnå den bedste pasform med eksisterende interaktion kendskab til protein eller kompleks af interesse. Generelt vi opnået de bedste resultater med Manhattan (L1) afstand metrisk 20. Pearson korrelation eller euklidiske afstand målinger er også blevet rapporteret til at identificere komplekser baseret på alternativ fraktioneringsteknikker 10, 11, 12.

Quantive MS-data opnået fra de blå native fraktionerne kan også anvendes til at bestemme støkiometrien af ​​proteinkomplekser. Den iBAQ (intensitet baseret absolut kvantificering) værdi tilvejebringer et mål for relative forekomst af de identificerede proteiner 27, 28. De iBAQ værdier for protein komplekse medlemmer i alle fraktionerne inden en migration profil top er normaliseret til den for bait-proteinet til opnåelse af relative mængder. De normaliserede iBAQs tværs af en profil top for et givet protein kompleks element bør følge en horisontal tendens, og tendensen værdier afspejler støkiometrien af ​​de interagerende proteiner i forhold til bait-proteinet. For en mere detaljeret fremstilling af støkiometri beregninger, se 20.

figur 7
Figur 7: Skematisk arbejdsgang sammenfatter ABC-MS sTRATEGI. Dette tal er modificeret fra 20. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 8
Figur 8. Hierarkisk klyngedannelse af BN-PAGE indvandringsprofiler for MTA2 interaktionskandidater. MTA2-associerede proteiner, blev grupperet baseret på ligheden i deres migrationsprofiler. Kun en delmængde af varmen-map indeholdende NuRD komplekset vises (indesluttet i det blå felt). Den gule boks fremhæver den stærke korrelation af Wdr5 med NuRD kompleks. De kommenterede molekylvægte blev estimeret fra migrationen afstande på proteinstandarder kører i samme gel. Denne forskning blev oprindeligt udgivet i molekylære og cellulære Proteomics 20 American Society for Biokemi og Mo lecular Biology. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 9
Figur 9. BN-PAGE migration profil NuRD underenheder og associerede proteiner. A) MTA2 og NuRD underenheder stede på et lignende intensitet mønster. B) MTA2 og NuRD underenheder med den inverse intensitetsmønster. C) MTA2 og Cdk2ap1, som kun er til stede i højere molekylvægt NuRD enhed. De kommenterede molekylvægte blev estimeret fra migration profil af proteinstandarder. Denne forskning blev oprindeligt udgivet i molekylære og cellulære Proteomics 20 American Society for Biokemi og Molekylær Biologi._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil
Supplerende data: Prøve datasæt. MaxQuant-afledte proteingroups.txt fil, der indeholder protein-identifikationer og kvantificering værdier fra en ABC-MS eksperiment. Denne forskning blev oprindeligt udgivet i molekylære og cellulære Proteomics 20 American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Her, beskriver vi anvendelsen af ​​affinitetsoprensning efterfulgt af blå nativ gelelektroforese i kombination med kvantitativ massespektrometri til at løse proteinkomplekser. Denne fremgangsmåde giver en metode til at trævle endimensionale protein interaktion lister i funktionelle proteinkonstruktioner.

Vi viser fremgangsmåden baseret på anvendelsen af ​​epitopmærkede proteiner. Men hvis en cellelinie, der udtrykker et mærket protein ikke er tilgængelig, kan en alternativ være at anvende antistoffer mod proteinet af interesse, forudsat at der er et peptid til rådighed til at opnå nativt kompetitiv eluering. Mængden af ​​udgangsmateriale og mængde af perler skal muligvis ændres afhængigt af ekspressionsniveauet af målproteinet. Vi typisk udføre denne protokol med 2-5 x 10 8 celler udgangsmateriale, og dette er tilstrækkeligt selv for proteiner med lavt ekspressionsniveau. Lyseringsbufferen sammensætning bør vælges empirisk for at opnånær at fuldføre opløsningen af ​​agn. Dette kan være en udfordring for nogle typer af proteiner, især kromatinbinding eller membranproteiner. Alternative muligheder omfatter forøgelse af mængden af salt, forudsat at proteinet kompleks under undersøgelsen er stabil i høj salt eller anvendelse af lydbehandling og / eller nuklease behandling for chromatin bindingsproteiner 20, 29. I tilfælde af membranproteiner, kan skifte detergent til DDM eller digitonin være tilrådeligt 30. I tilfælde af DNA-bindende proteiner, er det nyttigt at omfatte en nuklease, såsom Benzonase under oprensningen trin 20. Fuldstændig fjernelse af nukleinsyrer sikrer, at de detekterede interaktioner forekomme mellem proteiner og ikke er medieret af DNA.

Et kritisk element til at overveje, når du bruger denne metode er stabiliteten af ​​komplekset, der undersøges. Proceduren er lang og kan involvere preserving proteinkomplekset natten over. Vi har opnået god succes med to kromatin remodeling komplekser (D. Bode og M. Pardo, data ikke vist), men dette bør evalueres. Affinitetsrensningstrinnet kan afkortes, hvis det kræves.

Alternative teknikker, der tillader native fraktionering, såsom gelpermeationskromatografi, er ofte blevet brugt i over 50 år til at karakterisere proteinkomplekser. Vi og andre har vist, at løsningen af blå nativ PAGE er overlegen i forhold til den, der opnås ved anvendelse af gelpermeationskromatografi 20, 31, 32, 33. En anden fordel ved blå nativ PAGE er, at det ikke kræver kromatografisystemer, som er dyre, men snarere anvender protein elektroforetisk udstyr, der er udbredt i laboratorier. Med hensyn til hands-on tid, denne metode involverer ikke mere arbejde end den traditionelle geLC-MS / MS enMETODE eller offline kromatografisk fraktionering. Men som de fleste fraktionering teknikker gør, det har en grænse for deres løsning. Komplekser, der er meget homogene eller tæt i masse og form kan være uden beslutningen tilbydes af blå nativ PAGE, og dermed protokol som rapporteret her, er måske ikke være universelt vellykket i løsningen særskilte komplekser med delte underenheder. Opmuntrende, har vi haft succes med at adskille to meget ens tetrameriske komplekser deler tre underenheder (M. Pardo, manuskript under udarbejdelse).

Da massespektrometri bliver stadig mere følsom, kan detekteres selv små mængder af ikke-specifikke interaktører og forurenende stoffer i AP-MS-prøver. Den foreslåede fremgangsmåde her, er måske hjælpe til diskrimination af reelle interaktører fra baggrund forurening i affinitetsoprensning ved at fokusere opmærksomheden på proteiner med migration toppe, der falder sammen med agn migration toppe ved højere molekylvægt end den forde monomere proteiner.

Adskillige grupper har brugt fraktioneringsteknikker efterfulgt af protein korrelation profilering at afgrænse proteinkomplekser ved cellulær skala uden behov for forudgående isolation 10, 11, 12, 34. Imidlertid kan dette resultere i manglende detektering sub-støkiometrisk interaktioner. Inkorporeringen af ​​en berigning trin gennem affinitetsoprensning kan bidrage til at overvinde dette. Den her beskrevne fremgangsmåde bør være generelt egnede til at udforske topologien af ​​proteinkomplekser og optrævling de multiple komplekser et givet protein tager del i inden for samme cellulære kontekst. Strategien er enkel og modtagelig for laboratorier, der måske ikke har dyrt kromatografisk fraktionering udstyr til at løse proteinkomplekser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein G Dynabeads Life Technologies 10003D
FLAG antibody M2 Sigma-Aldrich F1804
Tween-20, protein grade, 10% solution Millipore 655206
Dimethyl pimelimidate Sigma-Aldrich 80490
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 Sigma-Aldrich T0449
3x FLAG peptide Sigma-Aldrich F4799
Vivaspin 5K NMWCO, PES Sartorius VS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel Life Technologies BN1001
20x NativePAGE Running Buffer Life Technologies BN2001
20x NativePAGE Cathode Additive Life Technologies BN2002
4x NativePAGE sample loading buffer Life Technologies BN2003
NativeMARK Life Technologies LC0725
NativePAGE 5% G-250 sample additive  Life Technologies BN2004
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene Thermo 249944
Multiscreen HTS 96-well filtration system Thermo MSDVN6550
Nunc 96-well cap natural Thermo 276002
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) Sigma-Aldrich 646547
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A/0627/17
Trypsin, sequencing grade Roche 11418475001
MaxQuant (software) N.A. N.A. http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus (software) N.A. N.A. http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goudreault, M., et al. A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).
  2. Leitner, A., et al. Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).
  3. Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. Mass spectrometry supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).
  6. Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
  7. Kao, A., et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).
  8. Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes. Methods. 61 (2), 98-104 (2013).
  9. Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase. J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).
  10. Havugimana, P. C., et al. A census of human soluble protein complexes. Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).
  11. Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).
  12. Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).
  13. Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
  14. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  15. Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).
  16. Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).
  17. Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
  18. Remmerie, N., et al. Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods. J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).
  19. Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry. Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).
  20. Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).
  21. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  22. Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
  23. Kim, J. J., et al. A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).
  24. Lauberth, S. M., Rauchman, M. A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex. J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).
  25. Miller, A., et al. Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex. Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).
  26. Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases. J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics. Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).
  29. Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners. J Proteomics. 100, 55-59 (2014).
  30. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  31. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  32. Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  33. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
  34. Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).

Tags

Biokemi Blå nativ PAGE protein korrelation profilering multiproteinkompleks affinitetsoprensning kvantitativ massespektrometri interactome AP-MS proteininteraktion
Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pardo, M., Bode, D., Yu, L.,… More

Pardo, M., Bode, D., Yu, L., Choudhary, J. S. Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling. J. Vis. Exp. (122), e55498, doi:10.3791/55498 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter