细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，可由多种细胞应激因素诱导。本文描述了诱导细胞衰老的实验方案以及检测衰老标志物的方法。
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本文内容
摘要
摘要
在细胞应激或损伤的条件下，增殖中的细胞可启动一种特定程序，引发长期的细胞周期停滞状态，称为细胞衰老。衰老细胞在机体衰老过程中以及持续培养条件下会逐渐积累。 体外衰老细胞影响多种生物学过程，包括胚胎发育、组织修复与再生、肿瘤抑制以及衰老。衰老细胞的特征包括但不限于衰老相关β-半乳糖苷酶活性升高（SA-β-gal）；p16INK4Ap53 和 p21 水平升高；DNA 损伤水平增加，包括 γ-H2AX；衰老相关异染色质灶（SAHF）的形成；以及获得衰老相关分泌表型（SASP），后者特征为分泌多种促炎性细胞因子和信号分子。本文中，我们描述了在培养细胞中诱导复制性衰老和DNA损伤诱导性衰老的实验方案。此外，我们介绍了利用多种衰老相关标志物监测衰老表型的技术，包括SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、γ-H2AX 和 SAHF 染色，以及细胞周期调控因子和 SASP 因子的蛋白和 mRNA 水平的定量方法。这些方法可应用于不同模型和组织中衰老状态的评估。
引言
半个多世纪前，Hayflick 及其同事描述了未转化细胞在培养中只能进行有限时间的增殖1。长期培养人成纤维细胞会导致细胞停止增殖，但这些细胞仍具有代谢活性，这种现象被称为细胞衰老。衰老在抑制肿瘤发生方面可能具有有益作用，但也可能带来不利影响，因为它被认为会促进随年龄增长而出现的再生能力下降2,3。研究表明，随着人类年龄增长，衰老细胞会在组织中积累4，并被发现参与多种生物学过程，包括胚胎发育、伤口愈合、组织修复以及与年龄相关的炎症反应2。
细胞在培养过程中持续传代会诱导复制性衰老，这种现象与端粒缩短和基因组不稳定性相关。多种细胞应激因素，包括DNA损伤和癌基因，也可导致细胞衰老3。由端粒缩短以外因素引起的衰老通常被称为应激诱导性衰老或早衰，通常依赖于p16INK4A/Rb信号通路5。尽管增殖中的未转化细胞通常呈梭形，衰老细胞则具有一些特定特征，例如扁平且体积增大的形态，以及升高的衰老相关β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）（图1 & 2
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方案
1. 诱导复制性衰老
- 解冻低传代人二倍体成纤维细胞（例如， WI-38 和 IMR-90）或其他细胞系。
注意：此处使用了人二倍体成纤维细胞，但这些方案也可用于评估其他细胞类型的衰老，例如内皮细胞、上皮细胞或间充质干细胞。由于不同细胞类型的增殖速率或生长条件存在差异，培养条件可能需要针对具体细胞类型进行优化。
注意：细胞应处于增殖状态，并呈现纺锤形形态（参见 图1 示意图及 图2 例如）。理想情况下，细胞的群体倍增水平（PDL）应为 <实验开始时使用第30代细胞，以避免可能存在的复制性衰老细胞。- 使用以下公式计算细胞的群体倍增水平（PDL）：PDL = log(Nf/N0)/log₂，其中 Nf 是最终的细胞数量 N0 是接种细胞的初始数量21.
- 在添加了10%胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养WI-38细胞。
- 在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养IMR-90细胞。
- 所有细胞均在 ....
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结果
图2 - 6 展示SA-的代表性结果β-gal 染色；染色检测 γ-γH2AX 和 SAHF；p16 蛋白水平的检测INK4A、p21和p53；以及衰老相关分子的mRNA和蛋白质水平。升高的SA-β-gal染色可检测复制性衰老和DNA损伤诱导的衰老。同时观察衰老过程中出现的形态学变化：与增殖状态下的成纤维细胞呈梭形相比，衰老细胞体积增大、形态变扁平。在本实验范式中，细胞于电离辐射（IR）暴露后7天进行染色，并提取RNA和蛋白质。若在IR暴露后延长等待时间，可能获得更显著的结果即 10天）。每种条件和实验设置均需确定最佳实验条件。这些结果具有代表性，当使用其他方法诱导衰老时，也可检测到这些标志物。
对于图6，所列出的基因名称对应于CXCL1 （GROα）、CXCL2（GRO.......
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讨论
在此，我们描述了利用人二倍体成纤维细胞进行复制性衰老和DNA损伤诱导衰老的方法。此外，还包括多种衰老相关蛋白的蛋白质和mRNA水平的定量技术，以及SA-β-半乳糖苷酶染色和DNA损伤标志物γ-H2AX的免疫染色。这些实验方案可广泛用于评估衰老表型 体外 和 体内，尽管在鉴定衰老特征时存在诸多注意事项 体内20其他细胞可能表达衰老标志物，即使它们并非真正的衰老细胞。例如，破骨细胞和巨噬细胞就具有较高的β-半乳糖苷酶活性32,33此外，许多癌细胞中p16表达上调INK4A 34细胞也可能积累DNA损伤（例如， γ-H2AX 焦点），且不应处于衰老状态。SASP 因子也可能在多种正常的生理或病理条件下被上调，而这些条件可能涉及也可能不涉及衰老细胞。因此，在评估细胞衰老时，应联合使用多种衰老标志物 体内.
尽管在20.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院衰老研究所的院内研究计划资助。作者谨此感谢 Myriam Gorospe 和 Kotb Abdelmohsen 就细胞衰老问题提出的诸多有益讨论，并感谢 Kotb Abdelmohsen 对手稿的审阅。我们同时感谢实验室成员，特别是 Douglas Dluzen 对手稿的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% Tris-甘氨酸凝胶 | Invitrogen | XP00160BOX | |
| 酸-苯酚 ChCl3 | Ambion | AM9720 | |
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠抗体 | Invitrogen | A11031 | 1:300 稀释度 |
| 细胞刮刀 | 康宁公司 | 3008 | 细胞刮刀 |
| ECL 抗小鼠 HRP 标记抗体 | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus 蛋白质印迹底物 | 皮尔斯 | 32132 | ECL |
| DAPI | 分子探针 | MP01306 | 储存液：5 mg/mL，溶于 dH₂O2O |
| GAPDH 抗体 | 圣克鲁斯 | sc-32233 | 1:1,000 - 5,000 稀释度 |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| 组蛋白H3二甲基化K9单克隆抗体 | Abcam | 1220 | 1:500 稀释度 |
| 人IL-6 Quantikine ELISA检测 | R&研发系统 | D6050 | |
| 人IL-8 Quantikine ELISA检测 | R&D系统 | D8000C | |
| 人GROα Quantikine ELISA检测 | R&D系统 | DRG00 | |
| N-N-二甲基甲酰胺 | Sigma | D4551 | DMF |
| p16 单克隆抗体 | BD 生物科学 | 51-1325gr | 1:500 稀释度 |
| p21 单克隆抗体 | Millipore | 05-345 | 1:750 稀释度 |
| p53 单克隆抗体 | Santa Cruz | sc-126 | 1:500 稀释，克隆株 DO-1 |
| 磷酸化-H2AX（Ser139）FITC偶联抗体 | 细胞信号传导 | 9719 | 1:2,000 稀释度 |
| 功率 SYBR Green PCR 主混合液 | 应用生物系统公司 | 4367659 | |
| 预染蛋白质分子量标准 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0374 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭剂 | Invitrogen | P36930 | |
| PVDF膜 | 赛默飞世尔科技 | 88518 | |
| 衰老 ββ-半乳糖苷酶染色试剂盒 | 细胞信号传导 | 9860 | |
| TRIzol | Ambion/Life Tech | 10296028 |
参考文献
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F.
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