单分子分析激光定位补骨脂素加合物

摘要

激光常用于研究细胞对DNA损伤的响应。然而，激光产生的损伤位点之间的间距、发生频率及其与复制叉的碰撞情况很少被表征。本文中，我们描述了一种利用激光定点诱导链间交联的方法，可实现对这些参数的测定。

摘要

DNA损伤应答（DDR）在活细胞中通过激光微束照射诱导的双链断裂（DSBs）研究中已被广泛表征。然而，对于引起DNA螺旋扭曲的共价修饰（包括DNA链间交联（ICLs））所引发的DDR，目前了解尚不充分。我们研究了由激光光激活免疫标记的补骨脂素在活细胞核内定位的ICL所触发的DDR。为了探讨加合物分布及复制叉遭遇ICL等基本问题，我们将激光定位技术与另外两种技术相结合。DNA纤维常用于通过短脉冲期间掺入的核苷类似物的免疫荧光来显示复制叉的进展。免疫量子点则被广泛应用于单分子成像。在这一新方法中，来自携带激光定位ICL细胞的DNA纤维被铺展在显微镜载玻片上。利用免疫量子点显示标记的ICL，并测定损伤之间的间距。复制叉与ICL的碰撞可被可视化，不同类型的遭遇模式亦可被识别并定量分析。

引言

DNA持续受到辐射、紫外线、环境毒素、燃烧产物等外源性因素的攻击。此外，氧化代谢产生的内源性自由基也会对DNA造成损伤。所有这些因素都可能在化学或物理层面上破坏DNA的完整性¹。基因组的异常可激活DNA损伤应答（DDR），这是一种涉及数百乃至数千种蛋白质和微小RNA的级联反应，包括招募蛋白和翻译后修饰，参与损伤修复、细胞周期调控、凋亡、衰老以及炎症通路²。

目前我们对DNA损伤应答（DDR）的大部分认识主要来源于对双链断裂（DSB）的研究。这很大程度上得益于现有技术能够实现在活细胞基因组DNA中引入断裂，包括序列特异性的断裂³。此外，断裂位点易于募集DDR蛋白形成明显的焦点结构，可通过免疫荧光技术进行观察，这对鉴定参与应答蛋白的动力学特征和必要条件提供了极大帮助。研究DDR的一项关键技术是由Bonner及其同事所引入的，他们利用激光束在活细胞核内的"感兴趣区域"（ROI）中定向诱导产生一条带状分布的DSB⁴。实际上，这种方法形成了一个较长的蛋白聚集带，使得研究人员可通过免疫荧光鉴定DDR相关蛋白的定位。他们通过展示激光照射细胞中磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）形成的明显条带，验证了该方法的有效性。自此以后，激光诱导方法已被广泛应用于DSB引发的DDR研究中。尽管该技术....

方案

1. 地高辛标记的dUTP的制备

1. 在氮气氛围下，将50 mg（0.18 mmol）的4'-氯甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素与590 mg（2.7 mmol）的4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺混合于一个干燥的25 mL圆底烧瓶中。加入10 mL甲苯，回流反应12小时。在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂。
   1. 通过硅胶快速柱色谱法纯化残留物。以氯仿、甲醇和28%氨水溶液（9:1:0.5）作为洗脱剂洗脱色谱柱。在减压条件下使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，得到纯的4'-[N-(13-氨基-4,7,10-三氧杂十三烷)]氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素，为淡黄色粘稠液体。
   2. 在氮气氛围下，将5.5 mg（0.012 mmol）的4'-[N-(13-氨基-4,7,10-三氧杂十三烷)]氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素与5 mg（0.008 mmol）的地高辛NHS酯混合于一个干燥的圆底烧瓶中。加入0.5 mL无水二甲基甲酰胺（DMF）和3.4 µL三甲胺，在50 °C下搅拌18小时。
   3. 在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂。
   4. 用最少体积的二氯甲烷溶解残留物。将溶液以每点2 µL的量水平点样至以硅胶为固定相的制备型薄层色谱板底部。使用氯仿:甲醇:28%氢氧化铵溶液（8:1:0.1）作为展开剂进行制备型薄层色谱分离。
   5. 除板的垂直边缘外，其余部分遮蔽，用短波长254 nm紫....

结果

通过免疫荧光检测与补骨脂素连接的Dig标签，可显示激光定位的Dig-TMP（图1A）交联链（ICLs）。尽管激光可被引导至任意轮廓区域进行照射，但条带状并非细胞内的“自然”形态，因此可通过该特征将真实信号与因一抗或二抗非特异性结合导致的假象信号区分开来。当使用特异性不够理想的抗体时，这一特性尤为有用。图中展示了经典的DNA损伤应答（DDR）标志物γ-H2AX在Dig-TMP交联链条带区域的信号示例（图1B）。

激光条带中Dig标记损伤灶的免疫荧光染色无法提供有关加合物频率和间距的任何结论。为了确定这一点，细胞在引入交联（ICLs）前先与CldU共孵育24小时。针对CldU的染色可使Dig标记的损伤灶在长DNA纤维上可视化，并且比直接染色（如DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）或YOYO {1,1'-(4,4,8,8-四甲基-4,8-二氮杂十一亚甲基)双[4-[(3-甲基苯并-1,.......

讨论

激光定位技术需要使用贴壁细胞，且其细胞核在明场显微镜下可见。我们曾尝试使用细胞黏附剂（如多聚赖氨酸或胶原蛋白）或更复杂的混合物，将非贴壁细胞（如原代淋巴细胞）或松散贴壁的培养细胞（如AD293细胞）固定在玻璃表面。尽管这些处理可使细胞结合于表面，但我们发现这些细胞通常保持圆形，难以对焦至细胞核。此外，这些细胞在去除培养基后的初始洗涤步骤中常无法存活。然而，在满足贴壁细胞要求的前提下，我们已成功将多种标准细胞系以及原代细胞应用于这些研究。建议检测细胞是否存在支原体污染，我们发现此类感染会改变细胞的反应特性。

激光的焦平面非常重要。目标是将ICLs放置在细胞核内。焦平面过高，光激活会位于细胞核上方；过低则会落在玻璃表面。我们发现，在细胞质与细胞核交界处调整微分干涉差（DIC）图像的焦点清晰度较为有效。

纤维实验并不困难，但在获得可解释的结果之前需要一定的练习。正确实施该技术至关重要。激光显微切割实验回收的细胞数量较少，每个样本都会被完整地用于一张载玻片上。因此，必须最大限度提高每次实验的回收率，因为样本无法分割，也不能保留部分用于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
地高辛NHS酯	Sigma-Aldrich	11333054001
氯代补骨脂素	Berry and Associates	PS 5000
二氨基二甘醇	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺
氯仿	Acros Organics	423550040
甲醇	Fisher Scientific	A4524
氨水溶液	Sigma-Aldrich	5002
TLC板	Analtech, Inc.	P02511
Flass玻璃柱 24/40，100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2转盘共聚焦显微镜，配备自动载物台、环境控制室和培养板支架	Perkin Elmer		配备Volocity软件
Micropoint Galvo	Andor Technologies		配备氮气脉冲激光器
染料池	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365染料	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35 mm玻璃底培养皿，1.5号盖玻片，玻璃直径10 mm，未包被	Matek	P35G-1.5-10-C
显微镜载玻片	New Comer Supply	Part # 5070	新型硅烷载玻片
小鼠抗BrdU抗体（IdU）	BD Biosciences	347580	1比40
大鼠抗BrdU抗体（CldU）	Abcam	ab6326	1比200
兔抗地高辛抗体	ThermoFisher Scientific	710019	1比200
Q-dot 655山羊抗兔IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1比5,000
AF647-山羊抗大鼠IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1比100
AF488-山羊抗小鼠IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1比100
Zeiss A200正置荧光显微镜	Zeiss		配备Axiovision软件
Q-dot 655滤光片	Chroma	39107