Lazerler sıklıkla DNA hasarına hücre tepkisinin çalışmada kullanılır. Bununla birlikte, normal koşullar altında, aralık, sıklık, ve çarpışmalar çoğaltma çatal nadiren karakterize lezyonlar üretir. Burada, lazer lokalize kol içi çapraz bağlar ile bu parametrelerin belirlenmesini sağlayan bir yaklaşım açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Lazer Lokalize Psoralen adüktlerinin Tek Molekül Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
DNA hasarı yanıt (DDR) yaygın olarak canlı hücreler lazer mikro ışın demeti radyasyonu ile indüklenen çift iplik kırılmaları (DSB'ler) çalışmalarında karakterize edilmiştir. DDR kol içi çapraz bağlantılar DNA (ICLs) de dahil olmak üzere kovalent DNA modifikasyonları bozucu sarmalı için, hem de tanımlanmamıştır. Biz canlı hücrelerin çekirdeklerinde, immunotagged psoralenler laser fotoaktivasyon tarafından lokalize ICLs tarafından uyarılan DDR, inceledik. yaklaşımlı dağıtım ve çoğaltma çatal karşılaşmalar hakkında temel sorulara cevap bulmak amacıyla, biz iki diğer teknolojilerle lazer yerelleştirme birleştirdi. DNA, elyaf genellikle kısa darbeler sırasında eklenen nükleosit analoglarının immünofloresansla replikasyon çatalları ilerleyişini görüntülemek için kullanılır. Immunoquantum noktalar yaygın tek bir molekül görüntüleme için kullanılmıştır. yeni bir yaklaşım ise, lazer lokalize ICLs taşıyan hücreler DNA lifler mikroskop lamı üzerine yayılır. Etiketlenmiş ICLs immunoquantum noktalar ve inci ile görüntülenirE arası lezyon mesafeleri tespit edilmiştir. ICLs ile Çoğaltma çatal çarpışmalar görülebilir ve farklı karşılaşma desenler belirlendi ve miktarı belirlenir.
Giriş
DNA, ek olarak, bu oksidatif metabolizma tarafından üretilen endojen radikal türleri tarafından saldırıya vb radyasyon, ultraviyole ışık, çevresel toksinler, yanma ürünleri gibi eksojen maddeler sürekli saldırı altındadır. Bunların hepsi, kimyasal veya fiziksel olarak DNA 1 bütünlüğünü bozmak için potansiyele sahiptir. genomunda pertübasyonlar lezyon onarımında yer alan proteinleri ve mikroRNA binlerce değilse, yüzlerce, DNA hasarına (DDR), bir işe ve post-translasyonel modifikasyonlar kaskadını aktive edebilirler, hücre döngüsü, apoptoz, yaşlanma ve inflamatuar yolların düzenlenmesi 2.
DDR ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Dig-TMP hazırlanması 1.
- 50 mg (0.18 mmol) 8-trımetılpsoralen'dır 4'-klorometil-4,5' , ve bir kuru 25 mL'lik yuvarlak 590 mg (2.7 mmol) 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanedi-amin karıştırın nitrojen altında bir şişeye -Dip. 12 saat için 10 ml toluen ve geri akış ekleyin. Indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı içerisinde çözücüden çıkarın.
- Silika jel üzerinde flaş kolon kromatografisiyle artığı arıtın. (: 1: 0.5, 9), kloroform, metanol ve% 28 amonyak çözeltisi ile sütun elute. düşük basınç altında bir döner buharlaştırıcı çözücü buharlaşır ve geri saf 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Lazer lokalize Dig-TMP (Şekil 1A) ICLs psoralen ile bağlantılı Dig-etiketine karşı immünofloresansla görüntülenebilir. Lazer, herhangi bir konturun bir alanda vurmaya yönelik olmasına rağmen, şeritler hücrelerde "doğal" biçimleri değildir ve yasal sinyalleri kolayca Primer ya da sekonder antikor ile spesifik olmayan bağlanma için eserler ayırt edilebilir. Mükemmel özgüllük daha az antikorlar kullanılırken bu özellik yararlıdır. Dig-TMP ICLs bir şerit DDR, y-H2A.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Lazer lokalizasyon teknolojisi parlak alan mikroskopisi de görebilir çekirdekleri yapışan hücrelerin kullanımını gerektirmektedir. Böyle polilisin veya kolajen veya daha fazla kompleks karışımlar olarak hücre yapıştırma preparatları ile cam yüzeyine, örneğin primer lenfositler, ya da AD293 olarak gevşek bir şekilde yapışık kültürlenmiş hücreler gibi yapışmayan hücreler, takmak için çalışılmıştır. bu tedaviler yüzeye hücreleri bağlamak olsa bile, genellikle çok zor çekirdekleri içine odaklanmak için yapım yuvarlak kalmak.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu araştırma (Z01 AG000746-08) ve Fanconi Anemisi Araştırma Fonu Yaşlanma üzerine NIH, Ulusal Enstitüsü İntramural Araştırma Programı tarafından kısmen desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Digoxigenin NHS esteri | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Kloro-psoralen | Berry ve Ortakları | PS 5000 | |
| diaminoglikol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioksa-1,13-tridekanediamin |
| Kloroform | Akros Organikler | 423550040 | |
| Metanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Amonyum çözeltisi | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plakaları | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass cam kolon 24/40, 100 mL | Chemglass Yaşam Bilimleri | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 eğirme diski konfokal mikroskop, otomatik kademe ve çevre kontrol odası ve plaka tutucu ile donatılmıştır | Perkin Elmer | Volocity Yazılımı | |
| Micropoint Galvo | Andor Teknolojileri | ||
| boya hücresi | Andor Teknolojileri | MP-2250-2-365 | |
| 365 boya | Andor Teknolojileri | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm cam botomm plakalar 1.5 lamel , 10 mm cam çapı, kaplamasız | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| mikroskop slaytları | Yeni Gelen Tedarik | Parçası # 5070 | Yeni Silan |
| Slaytları Fare anti BrdU antikoru (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 40'ta 1 |
| Sıçan anti BrdU Antikoru (CldU) | Abcam | ab6326 | 200'de 1 & nbsp; |
| Tavşan anti Dig antikoru | ThermoFisher Scientific | 710019 | 200'de 1 |
| Q-dot 655 keçi anti Tavşan IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 5.000'de 1 |
| AF647- keçi anti Sıçan IgG | Jackson İmmünoresearch | 112-605-167 | 100'ü 1 arada |
| AF488-keçi anti fare IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 100'ü 1 arada |
| Zeiss epifloresan mikroskop A200 | Zeiss | Axiovision yazılımı | |
| Q-dot 655 filtre | Chroma | 39107 |
Kaynaklar
- Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).
- Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
