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Developmental Biology

5-एमसी डॉट ब्लाट परख डीएनए मेथिलिकेशन लेवल ऑफ़ चॉन्ड्रोसाइट डिडिएफेनिफिकेशन Published: May 17, 2017 doi: 10.3791/55565
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 2,6, 2, 2, 1,2
1Guangzhou Medical University, 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 3Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 5Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Shantou University Medical College

Summary

हम 5-मेथिलसीटोसिन (5-एमसी) डॉट ब्लोट के आधार पर डीएनए मेथिलिकेशन को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हमने chondrocyte dedifferentiation के दौरान 5-एमसी स्तर निर्धारित किया था। एसीआई उपचार में chondrocyte phenotype को शीघ्रता से निर्धारित करने के लिए यह सरल तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

फाइब्रोब्लास्टिक chondrocytes में हाइलाइन चांड्रोसाइट्स का ब्योरा अक्सर इन विट्रो में चॉन्ड्रोसाइट्स के मोनोलेयर विस्तार के साथ होता है । Chondrocytes के वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तर को chondrocyte phenotype के नुकसान के लिए एक उपयुक्त बायोमार्कर माना जाता है। हालांकि, विभिन्न प्रयोगात्मक विधियों के आधार पर परिणाम असंगत हो सकते हैं। इसलिए, chondrocyte dedifferentiation के दौरान वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सटीक, सरल, और तेज़ तरीका स्थापित करना महत्वपूर्ण है।

वर्तमान जीनोम चौड़ा मेथिलिकेशन विश्लेषण तकनीक बड़े पैमाने पर बिसल्फाइट जीनोमिक अनुक्रमण पर भरोसा करती है। बायसफ़ाइट रूपांतरण के दौरान डीएनए गिरावट के कारण, इन तरीकों के लिए आम तौर पर बड़े नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है। वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तरों को मापने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले अन्य तरीकों में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) शामिल हैं। हालांकि, एचपीएलसी जीनोमिक डीएनए के पूर्ण पाचन की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, एचपीएलसी की निषेधात्मक रूप से उच्च लागत मेंस्ट्रिपर्स एचपीएलसी के व्यापक आवेदन को सीमित करता है।

इस अध्ययन में, जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) मानवीय क्रॉन्ड्रोसाइट्स से अलग-अलग संख्याओं के साथ निकाले गए थे। मेथिलैशन-विशिष्ट डॉट ब्लोट परख का उपयोग करते हुए जीडीएनए मेथिलैलेशन स्तर का पता लगाया गया था। इस डॉट ब्लाट दृष्टिकोण में, मैथिलेटेड डीएनए युक्त एक जीडीएनए मिश्रण को सीधे एक एन + झिल्ली पर देखा गया था जो पहले खींची गई परिपत्र टेम्पलेट पैटर्न के अंदर एक बिंदु के रूप में देखा गया था। अन्य जेल वैद्युतकणसंचलन-आधारित ब्लूटिंग दृष्टिकोण और अन्य जटिल ब्लोटिंग प्रक्रियाओं के मुकाबले, डॉट ब्लॉट विधि महत्वपूर्ण समय बचाता है। इसके अलावा, डॉट बोट्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5-एमसी एंटीबॉडी का उपयोग करके पूरे डीएनए मेथिलैलेशन स्तर का पता लगा सकते हैं। हमने पाया है कि डीएनए मेथिलैशन स्तर मोनोलायर उप-संस्कृतियों के बीच मतभेद है, और इसलिए चोंद्रासाइट डिटेफेक्शनेशन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है। 5-एमसी डॉट ब्लाक एक विश्वसनीय, सरल और तेजी से तरीका है जो सामान्य डीएनए मेथिलिकेशन स्तर का मूल्यांकन करने के लिए हैई क्रॉन्ड्रोसाइट फेनोटाइप

Introduction

ऑटोलॉगस चॉन्ड्रोसाइट इम्प्लांटेशन (एसीआई) एक अपेक्षाकृत नई, अत्याधुनिक प्रक्रियात्मक कार्टिलेज दोष 1 , 2 के उपचार के लिए है। एसीआई में महत्वपूर्ण कदमों में से एक इन विट्रो में मोनोलयर संस्कृति के माध्यम से चांड्रोसाइट्स का प्रवर्धन है। प्रवर्धन के दौरान, संकर चोंद्रोसाइट्स आसानी से अपने फेनोटाइप खो देते हैं और डीडीआई उपचार 3 , एसीआई उपचार के परिणाम का अनुकूलन करने के लिए, चोंद्रेसाइट dedifferentiation की सीमा प्रतिस्थापन से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए। Chondrocytes की स्थिति निर्धारित करने के लिए आर्थिक और तेज़ तरीका स्थापित करना जरूरी है I हाल ही में, डीएनए मेथिलैशन और चांड्रोसाइट डिसीफाइनेशन के बीच के सम्बन्ध ने 4 , 5 , 6 के बारे में ज्यादा ध्यान आकर्षित किया है। डीएनए मेथिलिकेशन क द्वारा प्रक्रिया हैआईआईएच मिथाइल समूहों को डीएनए में जोड़ दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप साइटोसिन अवशेषों के 5-मेथिलसायटोसिन (5-एमसी) में रूपांतरण होता है।

Chondrocyte dedifferentiation में डीएनए मेथिलिकेशन के जीव विज्ञान को स्पष्ट करने के लिए, पहला कदम है चांड्रोसाइट्स के डीएनए मेथिलिकेशन स्तर का मूल्यांकन करना, जो अभी तक चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। डीएसए मेथाइलेशन 7 , 8 का विश्लेषण करने के लिए बीसफ़ाफाइट जीनोमिक अनुक्रमण सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। इस परख में, bisulfite रूपांतरण डीएनए गिरावट का कारण बनता है, और इस प्रकार नमूने की एक पर्याप्त मात्रा परख के लिए प्रदान किया जाना चाहिए। इसके अलावा, उच्चतर प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) का उपयोग वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तर 9 , 10 का अनुमान लगाने के लिए किया गया है। हालांकि, एचपीएलसी विश्लेषण जीनोमिक डीएनए पाचन की आवश्यकता है। इसके अलावा, उन्नत और महंगा प्रायोगिक उपकरणों की आवश्यकता है। इसलिए, उच्च लागत के अतिरिक्त, इन प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं समय पर विपक्ष हैंuming। एंटी-5-एमसी एंटीबॉडी अब वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं, जिसने जटिल जीनोम से 5 एमसी युक्त जीनोमिक डीएनए के प्रतिरक्षा ब्लूटिंग की संभावना पैदा कर दी है।

इस रिपोर्ट में, हमने मोनोलेयर संस्कृतियों की एक श्रृंखला में विकसित हुए चांड्रोसाइट्स से जीनोमिक डीएनए निकाला। हमने विभिन्न अंकों के साथ मानव चॉन्ड्रोसाइट्स में 5-एमसी सामग्री का मूल्यांकन करने के लिए एक डॉट ब्लॉट परख का इस्तेमाल किया। हमने पाया है कि उच्च-वर्गीकृत chondrocytes में 5-एमसी सामग्री को कम ग्रेड डिडिफाइनेशन के साथ चॉन्ड्रोसाइट्स की तुलना में बढ़ाया गया था। इसके अतिरिक्त, हमने अंतर-निर्धारण स्थिति और 5-एमसी स्तरों के बीच एक संबंध की पहचान की। अंत में, हमने बताया कि 5-एमसी सामग्री में परिवर्तन chondrocyte phenotype से जुड़े थे। इसलिए, 5-एमसी डॉट ब्लाट परख एक विश्वसनीय, सरल और तेजी से विधि है जो डीएनए मेथिलिकेशन स्तर को चांड्रोसाइट्स में पहचानती है।

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Protocol

इस अध्ययन को शेन्ज़ेन द्वितीय पीपुल्स हॉस्पिटल के मानव आचार समिति ने मंजूरी दे दी थी।

1. मानव कलात्मक कार्टिलेज ऊतक संग्रह और Chondrocyte संस्कृति

  1. सामग्री की तैयारी
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पूरक डुलबेको के संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) माध्यम तैयार करें। 1 मिलीग्राम / एमएल collagenase द्वितीय, 0.25% trypsin-EDTA, फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), और एक सेल झरनी (40 सुक्ष्ममापी नायलॉन) तैयार करें।
  2. मानवीय कार्टिकेज टिशू कलेक्शन
    1. आघात के बाद दाता रोगियों के घुटने के जोड़ों से जोड़ कार्टिलेज को अलग करें। सभी प्रतिभागियों से सूचित सहमति प्राप्त करें
    2. 1 मिमी मिमी 3 मिलीलीटर में एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करते हुए टुकड़े टुकड़े करना और बुने हुए उपास्थि से 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेशज़ II के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए डाइजेस्ट क्रोन्ड्रोसाइट्स डाइज करें।
    3. परिणामी सीएल फ़िल्टर करेंएल निलंबन एक सेल झरनी (40 सुक्ष्ममापी) के माध्यम से और पीबीएस के साथ दो बार धो।
    4. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के पूरक के साथ डीएमईएम में 20,000-30,000 कोशिकाओं / सेमी 2 के घनत्व पर एक हेमोसाइटेटोमीटर और बीजों के साथ गणना करें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में संस्कृति
  3. Monolayer chondrocyte विस्तार
    1. 0.25% trypsin-EDTA और 6,600 कोशिकाओं / सेमी 2 की घनत्व पर री-प्लेट का उपयोग करके उप-मिलाकर कोशिकाओं का फसल सप्ताह में दो बार मध्यम बदलें।
    2. छह परिच्छेद तक के लिए मोनोलायर में कल्चर क्रोन्ड्रोसाइट्स और 1, 2, 3, 4 और 5 के पैराग्राफ पर आकलन करें।

2. जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) एक्सट्रैक्शन

  1. कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 500 μL lysis बफर (15 मिमी ट्राइस पीएच 8.0, 10 एमएम ईडीटीए पीएच 8.0, 0.5% एसडीएस, 200 माइक्रोग्राम / एमएल आरएनएज़ ए) प्रति 10 मिलियन कोशिकाओं में रिसास्पेेंड लें। पिपेटिंग और तेजी से उलटाव के द्वारा कोशिकाओं को रिज़स्पेेंड करें, और फिर 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेते हैं।
  2. एकोशिका lysate के 160 μg / एमएल की एकाग्रता पर डीडी प्रोटीनेस के और मिश्रण को सख्ती से उलटा। 55 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे सेते
  3. ट्रिस पीएच 7.9 संतृप्त फिनोल में एक मात्रा जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोमॉल अल्कोहल (25: 24: 1) नमूना के लिए। भंवर या लगभग 20 एस के लिए अच्छी तरह से हाथ से नमूना हिला
  4. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना 13,000 × जी में अपकेंद्रित्र ऊपरी जलीय चरण को निकालें और परत को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. फिनोल को हटाने के लिए और शीर्ष जलीय चरण को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए क्लोरोफॉर्म के बराबर मात्रा के साथ निकालें।
  6. 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 8.0 के 0.1 नमूना मात्रा और 100% इथेनॉल के 2 संस्करण जोड़कर डीएनए की गति बढ़ाएं।
  7. जीडीएनए को कम करने के लिए रात -20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को स्टोर करें।
  8. नमूना को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG से गोली जीडीएनए पर रखें।
  9. नमूना को 70% इथेनॉल के साथ तीन बार धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंटीफ्यूज लें।
  10. सतह पर तैरनेवाला निकालेंध्यान से और फिर वायु शुष्क 10 एमएम ट्रिएस पीएच 8.0, 0.1 एमएम ईडीटीए में डीएनए को फिर से खोलें।

3. डीएनए मेथिललेशन प्रोफाइलिंग

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, जीनोमिक डीएनए के कुल 500 एनजी का उपयोग करके bisulfite रूपांतरण प्रतिक्रिया करने के लिए एक डीएनए मेथिलिकेशन किट का उपयोग करें। एल्यूशन बफर (50 एनजी / μL) के 10 μL में एल्यूट करें।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक व्यावसायिक किट का उपयोग करके डीएनए मेथिलैलेशन प्रोफाइलिंग करें।

4. डॉट ब्लाट विश्लेषण

  1. डीएनए (1 प्रति नमूना प्रति मिलीग्राम) 0.1 एम NaOH में 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए डाइनटेक्ट करें बर्फ पर 1 एम एन 4 4 ओएसी के साथ डीएनए को बेअसर करना, और फिर दो गुना कमजोर पड़ जाए। एन + झिल्ली पर धारावाहिक पतला जीनोमिक डीएनए के स्पॉट 2 μL।
  2. 30 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली को हटा दें
  3. 1 घंटे के लिए टीबीएस-टी में 5% बीएसए में एन + झिल्ली को भिगोकर गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करें। एक प्रतिक्रिया के रूप में 10 सेमी पेट्री डिश का उपयोग करेंकमरे के तापमान पर आयन कक्ष
  4. टीबीएसटी में 5 मिनट में तीन बार धोने के बाद, टीबीएस-टी में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक माउस एंटी -5-मैथिलेसिटोसिन (5-एमसी) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1: 1,000) से रात भर में आते हैं।
  5. टीबीएस-टी में 5 मिनट में तीन बार झिल्ली को धोएं, और उसके बाद एक द्वितीयक एंटीबॉडी से एचआरपी-संयुग्मित भेड़ विरोधी माउस इम्युनोग्लोबुलिन-जी (आईजीजी) (1: 5,000) टीबीएस-टी में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
  6. टीबीएस-टी में 5 मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोएं
  7. एंजाइम सब्सट्रेट को झिल्ली तक जोड़ें और 5-10 मिनट तक सेवन करें निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक रसायनमिन्सिसेंस किट का उपयोग करते हुए माध्यमिक एंटीबॉडी संकेत को विज़ुअलाइज़ करें।

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Representative Results

Chondrocytes 6 (पी 6) के लिए एक monolayer में सुसंस्कृत थे। चॉन्ड्रोसाइट्स ने मोनोलेयर संस्कृति के उत्तरार्ध के साथ प्रगतिशील फेनोटाइपिक परिवर्तन दिखाए। पी 0 क्रॉन्ड्रोसाइट आकारिकी दौर था, जबकि कोशिकाओं को बेहद पीस गया और पी 6 ( चित्रा 1 ) तक लगातार मार्गों के साथ चपटा हुआ था। यह आकारिकी परिवर्तन chondrocyte dedifferentiation प्रक्रिया की विशिष्ट है। इस बीच, गर्मी के नतीजे के परिणाम से संकेत मिलता है कि सीपीजी साइटों के सामान्य मेथिलिकेशन स्तर में लंबे समय तक उपसंस्कृति बढ़ गई है। 5-एमसी डॉट धब्बा विश्लेषण ने आगे दिखाया कि उच्च सीपीजी मेथिलिकेशन स्तर के साथ chondrocyte प्रसार ( चित्रा 2 )। इन परिणामों ने आम तौर पर वृद्धि हुई मेथिलिकेशन स्तरों और चोंड्रोसाइट डेफिफ़्रेंसेशन के बीच एक सहयोग का सुझाव दिया।

आकृति 1
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चित्र 2
चित्रा 2: चंड्रोसाइट्स के जीडीएनए का 5-एमसी-विशिष्ट डॉट ब्लोट परख। जीनोमिक डीएनए को अलग-अलग संख्याओं के बाद अलग-अलग चौंड्रोसाइट्स से अलग किया गया था। प्रगतिशील रूप से 5 एमसी के स्तर को बढ़ाया गया। 200 एनजी, 100 एनजी, 50 एनजी और 25 एनजी जीडीएनए प्रति डॉट लोड किए गए थे। ( ए ) 5-एमसी-विशिष्ट डॉट धब्बा की छवि; ( बी ) ImageJ द्वारा डॉट तीव्रता विश्लेषण इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इन विट्रो में चांड्रोसाइट डिटेफेक्शनेशन, उपास्थि दोष की मरम्मत 11 , 12 के इलाज में एसीआई के परिणाम से गंभीर रूप से समझौता करता है। एसीआई परिणाम को अनुकूलित करने के लिए, डिफिफेन्फेनिएटेड क्रोंड्रोसाइट 13 के प्रयोग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। अध्ययन ने सुझाव दिया है कि सामान्य डीएनए मेथिलिकेशन स्तर चौंड्रोसाइट dedifferentiation 4 , 6 की सीमा के साथ जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, नैदानिक ​​आवेदन के पहले chondrocytes के सामान्य डीएनए मेथिलिकेशन स्थिति का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय और तेजी से विधि स्थापित करना अनिवार्य है।

डीडीए मेथिलिकेशन के सामान्य स्तर को डीडीएफ़िनेएटेड मानव क्रोंड्रोसाइट्स में पता लगाने के लिए, हम 5-एमसी स्तर को क्रमशः पारित क्रोन्ड्रोसाइट्स में माप सकते हैं। 5-एमसी बीसफ़ाइट उपचार द्वारा विकृति के प्रतिरोधी है। टी का उपयोग करके डीएनए साइटोसाइन मेथिलैशन पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए इस संपत्ति का शोषण किया गया थावह bisulfite अनुक्रमण दृष्टिकोण 14 बीसफ़ाफाइट जीनोमिक अनुक्रमण और मेथिलैशन-संवेदनशील प्रतिबंध पाचन डीएनए मेथिलिकेशन 15 , 16 के पता लगाने के लिए सोने की मानक तकनीकों के रूप में माना गया है। ये दृष्टिकोण एकल बेस-जोड़ी रिजोल्यूशन के साथ 5-एमसी की पहचान कर सकते हैं। हालांकि, bisulfite अनुक्रमण की सबसे बड़ी कमी Bisulfite रूपांतरण के दौरान डीएनए गिरावट है। यदि इस दृष्टिकोण का उपयोग चोंद्रासाइट डिस्फाएक्शनेशन के आकलन के लिए किया गया था, तो इसका परिणाम एसीआई के लिए प्रचारित चांड्रोसाइट्स का होगा। एचपीएलसी, वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन स्तरों को मापने के लिए एक और व्यावहारिक तरीका है, लेकिन यह केवल एचपीएलसी उपकरण वाले प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त है। इस प्रकार, बड़े नमूना संस्करणों या आधुनिक उपकरणों की आवश्यकता सामान्य नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में नियमित रूप से 5-एमसी स्तर के परीक्षण के लिए इन तरीकों को अव्यवहारिक बनाता है।

5 एमसी एंटीबॉडी की वाणिज्यिक उपलब्धता की संभावना को पता लगाने के लिए प्रदान करता हैडॉट ब्लोट परख का उपयोग करके सामान्य डीएनए मेथिलिकेशन स्तर। अन्य ब्लोटिंग तकनीकों के मुकाबले, 5-एमसी डॉट ब्लोट एक आसान प्रक्रिया है, जिसके लिए जीडीएनए और न ही वैद्युतकणसंचलन की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, साधन मध्यम सुसज्जित प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं। इसलिए, 5-एमसी डॉट ब्लोट विधि डीएनए मेथिलिकेशन परख के वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में लागू होनी चाहिए।

इस रिपोर्ट में, हम 5-एमसी स्तर और चोंड्रोसाइट डेसिफिफिकेशन के बीच एक संघ की पहचान करते हैं; 5-एमसी के स्तर में वृद्धि हुई उपसंस्कृति पारित होने के साथ बढ़ी है। हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि 5-एमसी मोनोलेयर चोंड्रोसाइट विस्तार की स्थितियों के कारण वसूली में गहराई से शामिल हो सकता है। महत्वपूर्ण बात, हमें पाया गया कि 5-एमसी के उच्च स्तर के क्रोंड्रोसाइट फेनोटाइप के नुकसान से जुड़े थे, जो एडीआई के विस्तृत आवेदन को उपास्थि दोषों की मरम्मत के लिए रोकता है। इसलिए, हमारे अध्ययन के नतीजे बताते हैं कि 5-एमसी डॉट मुहैया करना हद तक की सीमा को मापने के लिए एक विश्वसनीय तरीका हो सकता हैChondrocyte dedifferentiation, विशेष रूप से जब बड़ी संख्या में नमूने और जीडीएनए की छोटी मात्रा का विश्लेषण किया जाना है।

डीएनए मेथिलिकेशन विश्लेषण के लिए डॉट ब्लॉट मैनेजमेंट को लागू करने के लिए, महत्वपूर्ण मुद्दा जिसे डीएनए नमूना की गुणवत्ता माना जाना चाहिए। इसलिए, डॉट ब्लोट के माध्यम से 5-एमसी का पता लगाने में महत्वपूर्ण चरण जीनोनासी जीडीएनए निकासी चरण है। हम सुझाव देते हैं कि जीडीएनए एकाग्रता और शुद्धता को अधिकतम करने के लिए शोधकर्ता एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीडीएनए निकासी किट का उपयोग करें। इसके अलावा, डीएनए नमूना एक नायलॉन झिल्ली पर लोड किया जाना चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा यह सुनिश्चित करना है कि डीएनए नमूना स्थिर और नायलॉन झिल्ली द्वारा पूरी तरह से अवशोषित कर दिया गया है।

जिस तकनीक का हम यहां वर्णन करते हैं वह हमें कम से कम लागत पर कई एशेज ले जाने का अवसर देता है। इस दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त लाभ परख करने के लिए सरल और किफायती उपकरणों पर निर्भरता है और परिणामों को व्याख्यायित करना है। इसके अलावा, यह रिश्तेदार की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है2 या अधिक नमूनों के बीच वैश्विक मेथिलिलेशन स्तरों में अंतर। हालांकि, डीएनए मेथिलिकेशन स्तरों के सटीक मात्रा का ठहराव के लिए या एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम की सीपीजी मेथिलिकेशन स्थिति निर्धारित करने के लिए इस परख का इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। इसके अलावा, इस विधि में संवेदनशीलता सीमित है, क्योंकि मेथिलिकेशन स्थिति को 50 डीएनजी से नीचे जीडीएनए नमूनों में सही ढंग से नहीं देखा जा सकता है। यद्यपि यह विधि वैश्विक डीएनए मेथिलिकेशन के गुणात्मक विश्लेषण प्रदान करती है, हालांकि गलत तरीके से सकारात्मक परिणामों को जन्म दिया जा सकता है, अगर यह अनुचित तरीके से किया जाता है।

संक्षेप में, 5-एमसी डॉट ब्लोट एक विश्वसनीय, सरल और तेज़ तरीका है जो सामान्य डीएनए मेथिलैशन स्तर का पता लगाने के लिए है जो क्ंड्रोसाइट फ़िनोटाइप का मूल्यांकन करता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

यह काम निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित था: चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 815721 9 8; नंबर 81260161; संख्या 81000460); गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, चीन (सं। 2015 ए 3030313772); चीन पोस्टडोक्चरल साइंस फाउंडेशन फंडेड प्रोजेक्ट (संख्या 2013M530385); गुआंगडोंग प्रांत, चीन (नं .2016314) की मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन; शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाएं (सं। JCYJ20160301111338144; सं। JSGG20151030140325149; सं। JSGG20140519105550503; सं। जीजेएचजेड20130412153906739; नहीं JCYJ20140414170821160; सं .जेसीवायजे20140414170821200)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Gibco Inc. 11965–092 Warm in 37 °C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS) HyClone Inc. SH30256.01B D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
FBS Gibco Inc. 10099-141
0.25% Trypsin/EDTA Gibco Inc. 25200-056
1% Penicillin-Streptomycin Gibco Inc. 15140-122
Chloroform Mallinckrodt 4440
Isoamyl Alcohol Sigma I-3643
Phenol Gibco BRL 15513-039
Proteinase K Gibco BRL 24568-2
TAE buffer  Bio Whittaker 16-011V
Distilled Water Gibco BRL 15230-170
1 M Tris-HCl Biosharp Inc. BL514A
Tween20 Biotopped Inc. C58H114O26
BSA Proliant Inc. 68700
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hemocytometer ISOLAB Inc. 075.03.001
Falcon 100 mm dish Corning 353003
Centrifuge Tubes TPP AG 91050 Gamma-sterilized
High-speed centrifuge Eppendorf 5804R
ThermoMixer MIULAB MTH-100
Carbon dioxide cell incubator Thermo scientific 3111
Chemi-imaging Analyse System UVITEC Cambridge ALLIANCE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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5-एमसी डॉट ब्लाट परख डीएनए मेथिलिकेशन लेवल ऑफ़ चॉन्ड्रोसाइट डिडिएफेनिफिकेशन<em&gt; विट्रो में</em
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Jia, Z., Liang, Y., Ma, B., Xu, X.,… More

Jia, Z., Liang, Y., Ma, B., Xu, X., Xiong, J., Duan, L., Wang, D. A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro. J. Vis. Exp. (123), e55565, doi:10.3791/55565 (2017).

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