Hier zeigen wir einen neuen Assay kalt Nozizeption in Drosophila - Larven zu studieren. Dieser Test verwendet eine speziell angefertigten Peltier Sonde, die eine Brenn schädliche Kältereiz Anwendung und führt zu einer quantifizierbaren kalt spezifischen Verhaltensweisen. Diese Technik wird weiter zelluläre und molekulare Präparation von kalter Nozizeption ermöglichen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wie Organismen erkennen und darauf reagieren auf schädliche Temperaturen ist noch wenig verstanden. Ferner sind die Mechanismen Sensibilisierung der sensorischen Maschinen zugrunde liegen, wie bei Patienten periphere Neuropathie oder Verletzung induzierte Sensibilisierung erfahren, nicht gut charakterisiert. Genetisch tractable Drosophila - Modell wird verwendet, um die Zellen und Gene zu untersuchen , die für schädliche Brunsterkennung, welches mehrere konservierte Gene von Interesse ergeben. Es ist wenig bekannt, aber über die Zellen und Rezeptoren wichtig für schädliche Kälte Erkundung. Obwohl nicht Drosophila nicht längere überleben Exposition gegenüber kalten Temperaturen (≤10 ° C), und vermeidet kühlen, lieber wärmere Temperaturen in Verhaltenspräferenztests, wie sie fühlen und möglicherweise schädliche Kältereize vermeiden wurde erst vor kurzem untersucht worden.
Hier beschreiben wir, und charakterisieren, die erste schädliche Kälte (≤10 ºC) Verhaltenstest inDrosophila. Mit diesem Tool und Test zeigen wir einen Ermittler, wie man qualitativ und quantitativ kalt nocizeptives Verhalten beurteilen. Dies kann unter normalen / gesunden Kulturbedingungen durchgeführt werden, oder vermutlich im Zusammenhang mit der Krankheit, Verletzung oder Sensibilisierung. Ferner kann dieser Assay für die Larven gewünschten Genotypen ausgewählt aufgebracht werden, die thermosensation auswirken könnten, Schmerzen oder nozizeptive Sensibilisierung. Da Schmerz ist ein hoch konservierter Prozess, unter Verwendung dieser Tests zum weiteren thermischen Nozizeption studieren wird wahrscheinlich wichtiges Verständnis der Schmerzprozesse in anderer Spezies aufzuzulesen, einschließlich Wirbeltiere.
Einleitung
Drosophila hat sich als sehr nützlich für die Identifizierung von neuen Genen konserviert und neuronaler Schaltkreise sein , das komplexe Verhalten zugrunde liegen. Flies liefern eine hoch entwickelte genetische Toolkit und ein vereinfachtes Nervensystems , die 1, für die präzise genetische Manipulation und neuronaler erlauben 2, 3, 4 , um die zellulären und molekularen Grundlagen der Nozizeption 5, 6, 7 zu sezieren. Larven sind besonders ....
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Protokoll
1. Herstellung von Larvae
- Heben Sie Aktien oder genetische Kreuzungen in einem 25 ° C Inkubator.
- Wenn ein Kreuz Kultivierung verwendet 20-25 jungfräuliche Weibchen und Männchen 15-20 pro Fläschchen regelmäßige cornmeal Fliegen Medien enthält. Lassen Sie Weibchen Eier legen für etwa 48 Stunden, bevor sie in ein neues Fläschchen von Lebensmitteln zu übertragen.
- 4-5 Tage nach der Eierlegens, sammeln 3. Larvenstadium des gewünschten Genotyps durch vorsichtiges einen Strom von Wasser in die breiartige Nahrung und Larven, spritz- und den Inhalt in eine mittlere, saubere Petrischale gießen (60 mm x 15 mm).
- Als näc....
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Ergebnisse
Drosophila - Larven bewegen sich mit einer peristaltischen Bewegung , die gelegentliche Pausen umfasst, Kopf dreht, und Änderungen in der Richtung 22. Als Reaktion auf die fokale Anwendung eines schädlichen Kältereiz jedoch Larven zeigen eine Reihe von einzigartigen Verhalten, im Gegensatz zu den aversiven Seitenrolle schädliche Hitze und mechanische Reize. Diese Verhaltensweisen sind auch verschieden von Antworten auf sanfte Berührung <.......
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Diskussion
Der Test hier beschrieben ist, kann verwendet werden, um qualitativ und quantitativ Nozizeption oder nozizeptive Sensibilisierung in Larven von verschiedenen genetischen Hintergründen, Umwelteinflüssen zu bewerten und / oder Schäden induzierten Bedingungen. Da dieser Test für Focal Anwendung eines Kältereizes ermöglicht, mit diesem Werkzeug kann man die Funktion einer Untergruppe von peripheren sensorischen Neuronen spezifisch an kalten Temperaturen bei der Reaktion abzuschätzen. Interessanterweise scheinen diese Kälte .......
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Offenlegungen
Eine US-Patentanmeldung (CL) fehlt noch auf der Gestaltung der kalten Sonde. Weitere Informationen über Einzelheiten der kalten Sonde Teilenummern und Konstruktion, sowie zusätzliche Beratung über Werkzeugkonstruktion werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden.
Danksagungen
Wir danken Sarah Wu und Camille Graham für die kritische Lektüre des Manuskripts frühen Phasen des kalten Sondentest, der Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegen Aktien und Galko lab Mitglieder zu entwickeln. Diese Arbeit wurde durch die NIH NRSA (NIH F31NS083306) zu HNT, und von NIH R01NS069828, R21NS087360 und University of Texas MD Anderson Clark Stipendium in der Grundlagenforschung zu MJG unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kalte Sonde | Pro-Dev Engineering | Sonderanfertigungen auf Anfrage | Teilenummern und Konstruktionsdetails können auf Anfrage bereitgestellt werden |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Enbuilt Gehäuse | Teilenummern und Konstruktionsdetails können auf Anfrage bereitgestellt werden |
| Zeiss Stemi 2000 Mikroskop | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industrie. | A20500 | |
| Schott Dual Schwanenhals 23 Zoll faseroptischer Lichtleiter | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Pinzette | FST | FS-1670 | Wird zum Sortieren und Handhaben von Larven verwendet. Achten Sie darauf, die Pinzettenspitzen leicht zu glätten und abzustumpfen, um das Risiko zu verringern, die Larven versehentlich zu durchstechen oder zu verletzen |
| Pinsel | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Wird zum Sortieren und Handhaben von Larven verwendet. Hilfreich ist es, wenn der Pinsel während des Gebrauchs feucht ist. |
| 35 mm x 10 mm Petrischale aus Polystyrol | Falcon | 351008 | |
| 60 mm x 10 mm Petrischale aus Polystyrol | Falcon | 351007 | |
| Stück schwarzes Vinyl (mindestens 2 Zoll x 2 Zoll) | Wird verwendet, um Kontrast zu schaffen und Larven auf die Kältesonde auszurichten | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatel | Fisher Scientific | 14-357Q | Wird zum Bewegen von Lebensmitteln |
| verwendet Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Wird zum Trocknen der Larven und zur Kältesonde bei überschüssiger Feuchtigkeit |
Referenzen
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila....
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Nachdrucke und Genehmigungen
