Summary
En metod för att förbereda insekt celler och infektera dem med baculovirus för att produktion av rekombinanta mCD1d proteinand generera mCD1d tetramers.
Abstract
CD1 proteiner utgör en tredje klass av antigen-presenterande molekyler. De är cellytan glykoproteiner, uttryckt i cirka 50-kDa glykosylerat tunga kedjor som noncovalently är förknippade med beta2-mikroglobulin. De binder fett snarare än peptider. Även om deras struktur bekräftar likheten mellan CD1 proteiner till MHC klass I och klass II antigenpresenterande molekyler är mCD1d spåret relativt smal, djup och mycket hydrofoba och har två bindande fickor istället för flera små fickor beskrivs för klassiska MHC- kodade antigen-presenterande molekyler. Baserat på deras aminosyra sekvenser, ger en sådan hydrobphobic spår en idealisk miljö för bindning av lipid antigener.
Det Naturliga mördar-T (NKT) celler använder sin TCR att känna igen glykolipider bundna till eller presenteras av CD1d. T-celler reaktiva med lipider presenteras av CD1 har varit inblandade i skyddet mot autoimmuna och smittsamma sjukdomar och i tumören avslag. Således är förmågan att identifiera, rena och spåra svar CD1-reaktiva NKT celler av stor betydelse. Den generationen av tetramers av alfa Galactosyl Ceramide (en-Galcer) med CD1d har betydande insikt i biologi NKT celler. Tetramers konstrueras från andra CD1 molekyler har också genererat och dessa nya reagenser har kraftigt utökad kunskap om funktioner av lipid-reaktiva T-celler, med potentiell användning i övervakningen svaret på lipid-baserat vaccin och vid diagnostisering av autoimmuna sjukdomar och andra behandlingar.
Protocol
I. Tina Celler
Ta den frusna flaskan med TN5 celler, och tina den i en 37 ° C vattenbad. Tillsätt 5 ml insekt Express medium (Invitrogen, katalognummer-10.486) i 25 cm 2 TC kolv. Observera att Express fem kommer utan Glutamin, behöver lägga till 10 ml 100X glutamin penna streptokocker eller Glutamin ensam till ett LT medier. Lägg TN5 celler i det och inkubera i 30 minuter i en 27 ° C inkubator. Sedan aspirera på medellång med DMSO försiktigt utan att störa cellerna sitter på undersidan av kolven. Tillsätt 5 ml Fresh medium.
II. Växer och expanderar Celler
Övervaka celler varje dag. När kolven är nästan 70% konfluenta, ta de celler i suspension genom att banka kolven på båda sidor och överföra celler till 175cm 2 kolv genom att tillsätta 21 ml Insect uttrycka medelstora och 5 ml cellodling. Varje T175 kolv bör ha ca 25-30ml medium som en slutlig volym. Split sammanflytande kolv (ca 1 milj / ml konc.) 1 / 4 eller 1 / 5 efter behov. Låt inte cellerna växa över. Räkna antalet passager som du har delat upp cellerna. Växer inte under passage nummer 30 eftersom det kan orsaka cellernas åldrande resulterar cellslys. När du når önskad volym vid koncentration av 1 miljon / ml, infektera cellerna.
Jag odlar i allmänhet upp till 2 till 2,5 liter, som vanligtvis uppgår till sjuttio 175cm 2 kolvar och ca. 25 till 30 ml / flaska eller fem 1-litersflaskor Erlenmeyer och ca. 400ml till 500 ml i varje kolv
Notera: Du kan antingen växa celler i T-175 kontakten tätning kolv eller Corning Erlenmeyerkolv. Växande celler i E-kolvar är snabbare och enklare.
III. Titering viruset genom Slutpunkt utspädningsmetoden
- Tavla 3000-5000 celler per brunn i plan botten 96 brunnar i 200ul av Express fem SFM medium. Låt cellerna lösa vid 27 ° C i minst 30 minuter.
- Gör seriell utspädning av baculovirus lager. Man bör göra 1 / 10 utspädning i en rad av 96 och U bottenplatta, använda 250ul per brunn. Spädningar görs i Express Fem SFM medium.
- Med hjälp av en flerkanalig pipett ett fast belopp (oftast 20 ul) av olika spädningar till cellerna.
- Kultur vid 27 ° C i 7 dagar. För att undvika avdunstning från kanten rader, wrap kanterna av plattan med parafilm.
- Efter 7 dagar, kontrollera plattan och bestämma vilken utspädning av virus ger en 50% infektion - halv brunnarna på detta virus koncentration är smittade). Använd sedan en formel för att beräkna titer, som uttrycks i PFU / ml (PFU-plack forming units). Formeln finns i de flesta baculovirus manualer.
IV. Infektera cellerna
Det är mycket viktigt att veta den exakta titer av virus. Tillsätt önskad mängd virus. För viral stamberedning cellerna ska smittas vid mångfald Infection (MOI) av högst 1 (1pfu till 1High Fem cell) högre MOI leder till produktion av virala mutationer. För protein produktion är vanliga mängden MO1 5-10.
Exempel:
Den titer av mCD1d baculovirus = 1X108 PFU / ml
Lägg MOI = 1 (för att förstärka viruset) = 20x10 ^ 6 celler / kolv / 1x10 ^ 8 PFU / ml = 200 UL / kolv
MOI = 5 till 10 (för protein produktion) = 1 ml till 2ml För 20x10 ^ 6 celler / kolv
Dag 4 efter smittotillfället, titta på de infekterade cellerna. De borde tas bort, flytande, svullna och bildar korv.
V. Återställa supernatanterna
Ta mediet från infekterade kolvar, och transport till 250ml blått lock Falcon Spinning flaskor. De kan autoklaveras och återanvändas. Fyll flaskorna jämnt och centrifugera cellerna i Sorvall GSA rotorn vid 200rpm, 20 minuter, 4 ° C. Samla supernatanten och fortsätt för ytterligare rening.
VI. Rening av rekombinanta mCD1d
- Dialys och Koncentration i 150mm Natrium fosfatbuffert (pH 7,4)
- Genom att Ni-NTA agaros Kromatografi, eluera proteinet mCD1d + B2M med 150mm natriumfosfat 200 mM Immidazole
- Kör avsaltning kolumn med 20mm Tris HCl pH8 buffert för att bli av Immidazole
- Kör Kromatografi anjonbytare med MonoQ kolumnen för att undanröja de återstående föroreningar.
- Koncentrera till 1mg/ml med YM 30 koncentrator (Millipore)
- Bira enzymatisk biotynlation av mCD1d enligt tillverkarens protokoll (aviditet)
- Den fria biotin elimineras genom S200 kolumn (storlek uteslutning Chromatograpy) med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH7.4. I genomsnitt 2 till 3 MGS av biotynlated protein kan erhållas från 2 liter supernatant
- Produktion av en-Galcer CD1d tetramer.
För att ladda CD1d molekyl med en-Galcer, lösligt biotynlated CD1d-B2m inkuberas över natten vid rumstemperatur med tre gånger molar utöver a-Galcer, löst i 0,5% Tween -20 i PBS, O.9% natriumklorid. Tetramers genereras genom att blanda en-Galcer laddad CD1d monomerer med 4 gånger molar än PE - konjugerad streptavidin och inkubation under 4 timmar i rumstemperatur. Förvaras vid 48 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta förfarande, visas det hur du initierar, växa, infektera insekter celler och hur titer de baculovirus använda dessa celler. De viktigaste aspekterna av detta förfarande är underhåll av celler och att veta den exakta titer av baculovirus. När du har genererat CD1 tetramers, kan de användas som ett kraftfullt verktyg för analys av glykolipiden reaktiva T-celler. Baculovirus system används också ofta för att producera rekombinanta proteiner, inklusive MHC klass II tetramers så detta förfarande har ett mycket bredare tillämplighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
