כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר
במאמר זה
סיכום
תקציר
החולדה היא מודל חייתי חשוב המשמש במחקר לב וכלי דם, תאי חולדה חולדה משמשים באופן שגרתי לניתוח במבחנה של המנגנונים המולקולריים של התקדמות מחלות לב וכלי דם כגון היפרטרופיה לבבית, פיברוזיס וטרשת עורקים. למרות מספר ניסיונות עם הצלחה משתנה נעשו לפתח שורות תאים נצח מן המערכת הלב וכלי הדם כדי להבין את המנגנונים הסלולר, תאים ראשוניים מציעים סביבה טבעית קרוב יותר in vivo עבור מחקרים כאלה. לכן, מעבדות שונות העובדות על סוג תא מסוים פיתחו פרוטוקולים לבודד סוגים בודדים של תאי חולדה מעניינים של עניין. פרוטוקול המאפשר בידוד של יותר מסוג תא אחד, עם זאת, חסר. כאן פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של באיכות גבוהה סוגי תאים לב גדולים (cardiomyocytes, תאי האנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת ומאפשרתR לניתוחים סלולריים. זה מאפשר שימוש יעיל ביותר של המשאבים הזמינים, אשר עשוי לחסוך זמן ולצמצם עלויות מחקר.
מבוא
מודלים מכרסמים כבר זמן רב שימשו כלים כדי להרחיב את ההבנה שלנו של פיזיולוגיה לב וכלי דם בבריאות ומחלות. 1 למרות שמודלים אלו מאפשרים לנו להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלה ברמת האורגן ולנתח את הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של סוכני תרופה שונים המשמשים לטיפול במחלות לב וכלי דם, הבנה של המנגנונים המולקולריים של התפתחות מחלות לב וכלי דם ותרומתו של גורם מסוים סוג התא דורש שימוש במודלים תרבות תאים חוץ גופית . לשם כך פותחו קווי תאים שונים הנפתחים ממערכת הלב וכלי הדם; 2 , 3 עם זאת, תאים מבודדים טרי טרי הם פיזיולוגית ופונקציונלית רלוונטי יותר רקמות חי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
החקירה תואמת את המדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה שפורסמו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים בארה"ב (פרסום NIAH 85-23 1985) ואושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת גיסן. עכברים Wistar גברים בוגר במשקל 200-200 גרם שימשו במחקר זה.
1. מעוקר
- לפחות יום אחד לפני ההליך הוא להתבצע, החיטוי כל כלי ניתוח, טיפים פיפטה, ו pipettes פסטר לשמש בהליך בידוד על 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
2. הכנת מדיה ופתרונות <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הליך הבידוד גורם תשואה של 70-80% קיימא, בצורת מוט, cardiomyocytes מופשטים ( תרשימים 2A ו 2C ) שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים מתוכננים. ב cardiomyocytes המעבדה שלנו משמשים באופן שגרתי לניתוח Ca 2 + איתות. איור 5A מראה סידן תאיים [Ca 2 + ] תנודה אני בתגובה איסכמיה / reperfusion cardiomyocytes טעון עם Fura-AM (5 מיקרומטר). איור 5 ב מראה ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה, פרוטוקול לשחזור לבידוד ותרבויות של myocytes לב, תאי האנדותל, fibroblasts מתואר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד בו זמנית באיכות גבוהה של סוגי תאים עיקריים של רקמת לב, כלומר cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts לעומת סוג אחד בלבד התא. שלב קריטי בהליך הבידוד הוא העיכול הנכון של רקמת הלב. אם העיכול אינו שלם, מספר גדול של myocytes עדיין ניתן להשיג אבל האיכות שלהם היא גרועה מאוד והם בעיקר hypercontracted ו עגול ( איור 2 ב ) ואין ערך בניסויים. יתר על כ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
מחברים אין מה להכריז.
תודות
התמיכה הטכנית של L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas ו- A. Weber מודה בהכרת תודה. המחברים מבקשים גם להודות לד"ר א. מרטינסון על הוכחות מקיפות לקריאה ועריכה בשפה של כתב היד. המחקר נתמך על ידי אוניברסיטת ג 'סן Anschubsfinanzierung מענק מ' אסלאם וד 'Gündüz.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אנטי-vWF | סנטה קרוז ביוטק. | SC-14014 | |
| סידן כלורי | Merck | 102378 | |
| קרניטין | סיגמא-אולדריץ' | C0283 | |
| קולגנאז סוג II | וורת'ינגטון | LS004176 | |
| קריאטין | סיגמא-אולדריץ' | C0780 | |
| D-גלוקוז | Merck | 108342 | |
| Dil-AC-LDL | Thermo Scientific | L3484 | |
| תמיסת EDTA (0.2 מ') | Biochrome AG | L2113 | |
| תמיסת הטמעה | Citiflour | AF1-25 | |
| מדיום תאי אנדותל MV2 | PromoCell | C-22022 | |
| סרום עגל עוברי (FCS) | Biochrome AG | S0615 | |
| Gentamicin | Serva Chemicals | 47991 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| איזופלורן | אבוט | TU 061219 | |
| למינין | Roche/Sigma | 11243217001 | |
| M199 בינוני | Thermo Scientific | 11150059 | |
| M199 בינוני (אבקה) | Biochrome AG | T061 | |
| מגנזיום סולפט | סיגמא-אולדריץ' | 63138 | |
| נוגדן CD31 נגד חולדות עכבר (TLD-3A12) | Thermo Scientific | MA1-81051 | |
| תמיסת NaCl (0.9%), סטרילי | ב. בראון | ||
| חרוזי IgG של עכבר פאן (Dynabeads)Thermo | Scientific | 11041 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 4% Solution | Santa Cruz Biotech. | sc-281692 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | תרמו סיינטיפיק | 15070-063 | |
| מאגר פוספט מלח (PBS) 1x | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| חומרים מתכלים מפלסטיק | Greiner Bio-One | ||
| אשלגן כלורי | Merck | 4933 | |
| אשלגן דימימן פוספט | Merck | 7873 | |
| נתרן כלורי | Merck | 6404 | |
| תמיסת נתרן הידרוקסיד (2 N) | Merck | 109136 | |
| סטרילי מערכת סינון | Thermo Scientific | 5660020 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| TO-PRO | Thermo Scientific | T3605 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| מים, סטרילי | B. Braun |
מקורות
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristic....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
