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Immunology and Infection

रैपिड न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस के लिए एक ऑल-ऑन-चिप विधि रक्त के एक बूंद से सीधे विश्लेषण

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 1, 1, 5, 3,4,6,7
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

यह आलेख पूरे रक्त से ऑन-चिप न्युट्रोफिल अलगाव को एकीकृत करके और एकल माइक्रोफ्लिडिक चिप पर कैमोटैक्सिस परीक्षण को एकीकृत करके तेजी से न्युट्रोफिल केमोटेक्सिस परख की विस्तृत पद्धति प्रदान करता है।

Abstract

न्युट्रोफिल प्रवासन और केमोटाक्सिस हमारे शरीर की प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए महत्वपूर्ण हैं। वास्तविक समय की विज़ुअलाइजेशन, रासायनिक एकाग्रता ढाल बनाने की सटीक नियंत्रण, और अभिकर्मक और नमूना खपत को कम करने के कारण माइक्रोफ्ल्यूइडिक डिवाइस का उपयोग न्युट्रोफिल प्रवासन और केमोटाक्सिस की जांच के लिए किया जाता है। हाल ही में, संपूर्ण रक्त से सीधे एकीकृत और आसानी से संचालित माइक्रोफ्लुइडिक केमोटाक्सिस विश्लेषण प्रणालियों को विकसित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक शोधकर्ताओं द्वारा एक बढ़ते प्रयास किए गए हैं। इस दिशा में, न्युट्रोफिल के चुंबकीय नकारात्मक शुद्धि और छोटे रक्त के नमूने नमूनों से कीमोटाक्सिस परख को एकीकृत करने के लिए पहली सर्व-पर-चिप विधि विकसित की गई थी। यह नई पद्धति 25 मिनट में तेजी से नमूना-टू-न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस परीक्षण की अनुमति देती है। इस पेपर में, हम इस ऑल-ऑन-चिप चीमोटेक्सिस परख के लिए विस्तृत निर्माण, संचालन और डेटा विश्लेषण पद्धति प्रदान करते हैं, जिसमें समस्या निवारण रणनीतियों, लिमिTations और भविष्य दिशाओं न्युट्रोफिल केमोतोक्सिस परख के प्रतिनिधि परिणाम इस सब-ऑन-चिप विधि का उपयोग करते हुए, एक परिभाषित chemoattractant, N -Formyl-Met-Leu-Phe (एफएमएलपी), और एक पुरानी अवरोधक फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी) रोग से थूक का परीक्षण कर रहे हैं। यह विधि कई सेल प्रवासन संबंधी जांच और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों पर लागू होती है।

Introduction

कोमोटेक्सिस, घुलनशील रासायनिक एकाग्रता ढाल के लिए निर्देशित सेल प्रवास की प्रक्रिया, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 , 2 , 3 , ऊतक विकास 4 और कैंसर मेटास्टेसिस 5 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं में गंभीर रूप से शामिल है। न्युट्रोफिल सबसे प्रचलित सफेद रक्त कोशिका सबसेट हैं और शरीर की सहज मेजबान रक्षा कार्यों को सक्षम करने के साथ ही अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 6 , 7 की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। न्युट्रोफिल उच्च-विनियमित केमोटेक्टिक मशीनरी से लैस हैं जो इन गतिशील प्रतिरक्षा कोशिकाओं को रोगजनक व्युत्पन्न केमोटाटेन्टेंट्स ( जैसे एफएमएलपी) और मेजबान-व्युत्पन्न केमोटाटेन्टेंट्स ( जैसे इंटरल्यूकेन -8) के माध्यम से 8 के माध्यम से दिये गये हैं। न्यूट्रोफिल प्रवासन और केमोटाक्सिस विभिन्न शारीरिक समस्याओं में मध्यस्थता हैऔर रोग जैसे कि सूजन और कैंसर 1 , 9 इस प्रकार, न्युट्रोफिल केमोटेक्सिस का सटीक आकलन न्युट्रोफिल जीव विज्ञान और संबंधित रोगों के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक पढ़ाता है।

व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले परंपरागत केमोटेक्सिस एल्स ( जैसे ट्रान्सवेल परख 10 ) की तुलना में, माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस सटीक नियंत्रित रासायनिक ढाल पीढ़ी और लघुरूप 11 , 12 , 13 के कारण सेल प्रवासन और केमोटाक्सिस के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए महान वादा दिखाते हैं। पिछले दो दशकों में या तो, विभिन्न जैविक कोशिका प्रकारों, खासकर न्युट्रोफिल 11 के केमोटाक्सिस के अध्ययन के लिए विभिन्न माइक्रोफ़्लुइड उपकरणों का विकास किया गया है। महत्वपूर्ण प्रयास स्टेटियोमोरॉर्पोरेटिकल जटिलता में न्युट्रोफिल प्रवासन को दर्शाने के लिए समर्पित था माइक्रॉफ़्लुइडिक उपकरणों 14 , 15 में कॉन्फ़िगर किए गए मैजिक ग्रेडियेंट। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके न्युट्रोफिल द्वारा दिशानिर्देशित फैसले का अध्ययन करने के लिए दिलचस्प रणनीतियां भी विकसित की गईं। जैविक रूप से उन्मुख अनुसंधान के अलावा, माइक्रोवेसिफाईडिक डिवाइस के अनुप्रयोगों को 17 , 18 , 1 9 के रोग मूल्यांकन के लिए नैदानिक ​​नमूनों का परीक्षण करने के लिए बढ़ा दिया गया है। हालांकि, कई माइक्रोफ़्लुइडिक उपकरणों का उपयोग विशेष शोध प्रयोगशालाओं तक सीमित है और रक्त के नमूनों की बड़ी मात्रा से लम्बी न्यूट्रोफिल अलगाव की आवश्यकता है। इसलिए, पूरे रक्त 20 , 21 , 22 की एक बूंद से सीधे न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस विश्लेषण के लिए एकीकृत माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस विकसित करने की बढ़ती प्रवृत्ति रही है ,Ef "> 23 , 24

इस दिशा में, एक ऑल-ऑन-चिप विधि विकसित की गई थी जो कि एक एकल माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस 25 पर चुंबकीय नकारात्मक न्यूट्रॉफ़िल शुद्धि और बाद में कीमोटाक्सिस परख को एकीकृत करता है। यह सब-ऑन-चिप विधि में निम्नलिखित उपन्यास विशेषताएं हैं: 1) पिछले ऑन-चिप रणनीतियों के विपरीत जो आसंजन-आधारित सेल कैप्चर या सेल आकार-आधारित फ़िल्टरिंग 20 , 22 द्वारा रक्त से न्यूट्रोफिल को अलग करती है, इस नई विधि में उच्च परमिट होता है शुद्धता, पूरे रक्त के छोटे संस्करणों से neutrophils के चुंबकीय पृथक्करण के साथ ही chemoattractant उत्तेजना पर केमोटाक्सिस माप; 2) सेल डॉकिंग संरचना रासायनिक ढाल चैनल के निकट न्युट्रोफिल की प्रारंभिक स्थितियों को संरेखित करने में मदद करती है और एकल सेल ट्रैकिंग के बिना सामान्य केमोटेक्सिस विश्लेषण परमिट देती है; 3) न्युट्रोफिल अलगाव और केमोट का एकीकरणएकल माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस पर अक्ष का परख 25 मिनट में तेजी से नमूना-से-परिणाम केमोटाक्सिस विश्लेषण परमिट करता है जब प्रयोगात्मक कदमों के बीच कोई रुकावट नहीं होती है।

यह अख़बार इस सब-ऑन-चिप चीमोटाक्सिस परख के निर्माण, संचालन और डेटा विश्लेषण पद्धति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यह पेपर न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस के लिए रोगी से एक ज्ञात पुनः संयोजक केमोएट्रेटेंटेंट और जटिल रसायनयुक्त नमूने का परीक्षण करके विकसित विधि के प्रभावी उपयोग को दर्शाता है, जिसके बाद समस्या निवारण रणनीतियों, सीमाओं और भविष्य के दिशा-निर्देशों पर चर्चा की गई है।

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Protocol

सभी मानव नमूना संग्रह प्रोटोकॉल मनिटोबा विश्वविद्यालय, विन्निपेग में संयुक्त-फैकल्टी रिसर्च एथिक्स बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस निर्माण ( चित्रा 1 ए )

  1. डिजाइन और प्रिंट पारदर्शिता मुखौटा
    1. डिवाइस को डिज़ाइन के रूप में विस्तृत रूप से पहले 25 चित्र 1 ए देखें
      नोट: डिवाइस में दो परतें शामिल हैं पहली परत (4 सुक्ष्ममापी ऊंचाई), कोशिका डॉकिंग बाधा चैनल को ढाल चैनल के बगल में कोशिकाओं को फँसाने के लिए परिभाषित करता है। दूसरी परत (60 माइक्रोन उच्च), ग्रेड लोडिंग, रासायनिक प्रवेश जलाशयों और कचरा आउटलेट के लिए ढाल बनाने वाले चैनल, बंदरगाह और चैनल को परिभाषित करता है। संरेखण के निशान दो परतों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। दूसरी परत के लिए, ऊपर की ओर सर्पिल इनपुट चैनल की लंबाई और चौड़ाई क्रमशः 60 मिमी और 200 माइक्रोन है; डाउनस्ट्रीम की लंबाई और चौड़ाईसाँप इनपुट चैनल क्रमशः 6 मिमी और 280 माइक्रोन है।
    2. उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रिंटर का उपयोग करके एक पारदर्शिता मुखौटा में पहली और दूसरी परत की विशेषताओं को प्रिंट करें।
      नोट: मुद्रण संकल्प डिजाइन में न्यूनतम सुविधाओं पर निर्भर करता है। वर्तमान डिजाइन में, 32,000 डीपीआई 10 माइक्रोन न्यूनतम फीचर के लिए चुना गया था।
  2. सिलिकॉन वफ़र को साफ करें
    1. प्लाज्मा क्लीनर में सिलिकॉन वेफर में 3 रखें। 3 मिनट के लिए वैक्यूम लागू करें
    2. प्लाज्मा शक्ति चालू करें और स्तर को उच्च स्तर पर सेट करें 30 मिनट के लिए सिलिकॉन वेफ़र का इलाज करने के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा का उपयोग करें
    3. प्लाजमा क्लीनर को बंद करें और सिलिकॉन वफ़र निकालें; सिलिकॉन वेफर डिवाइस ढालना fabricating के लिए तैयार है।
  3. एक क्लीनरूम सुविधा में फोटोलिथोग्राफी द्वारा पहली परत का निर्माण
    नोट: निर्माण के आधार पर सटीक निर्माण मापदंड अलग-अलग हो सकते हैं।
    1. 10 एमएल एसयू -8 2025 को 10 एमएल SU-डिजाइन किए फोटो्रेसिस्ट तैयार करने के लिए ग्लास ब्रेकर में 8 2000। बुलबुले गायब होने तक 10 मिनट तक धुएं के हुड में मिश्रण छोड़ दें।
    2. उचित चक के साथ स्पिनर पर साफ सिलिकॉन वेफर रखें और सिलिकॉन वेफर को स्थिर करने के लिए वैक्यूम को लागू करें।
    3. सिलिकॉन वफ़र के केंद्र पर फोटो्रेसिस्ट मिश्रण के 3 एमएल को ध्यान से डालें। 5 एस के लिए 500 आरपीएम पर स्पिन फिर 30 के लिए 3,000 आरपीएम पर स्पिन सिलिकॉन वेफर पर अंतिम 4 माइक्रोन मोटाई फोटो्रेसिस्ट कोटिंग प्राप्त करने के लिए।
    4. स्पिनर से सिलिकॉन वेफर को सावधानीपूर्वक हटायें और 95 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए एक हॉटप्लेट पर सिलिकॉन वफ़र सेंकना।
    5. सावधानीपूर्वक एक मुखौटा संरेखण पर सिलिकॉन वेफर रखें और यूवी एक्सपोज़र का समय 6 एस तक सेट करें चिपचिपा टेप का उपयोग करते हुए एक पारदर्शी कांच प्लेट पर पहली परत के पारदर्शिता मुखौटा को ध्यान से संलग्न करें।
    6. धीरे से संरेखित करने के लिए संलग्न मुखौटा के साथ पारदर्शी ग्लास प्लेट रखें और सिलिकॉन वेफर के साथ मुखौटा संरेखित करें। सी का खुलासा करेंसेल डॉकिंग संरचना के पैटर्न के लिए यूवी के लिए लॅक्सीन वेफर
    7. गिलास प्लेट को ध्यान से हटा दें और उजागर सिलिकॉन वेफर को बाहर निकालें। 4 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस के लिए एक हॉटप्लेट पर सिलिकॉन वेफर सेंकना
    8. सिलिकॉन वफ़र को एक धूआं हुड पर स्थानांतरित करें और इसे एक गिलास पैन में रखें, जिसमें SU-8 डेवलपर शामिल है। धीरे से 30 एस के लिए इसे हिला
    9. ताजा एसयू -8 डेवलपर का उपयोग करते हुए सिलिकॉन वेफर को साफ करें, इसके बाद आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) द्वारा धुएं हुड के अंदर। धूआं हुड के अंदर नाइट्रोजन गैस द्वारा सिलिकॉन वेफर सूखी; पहली परत तैयार है।
  4. पहली परत पर दूसरी परत बनाते हैं।
    1. पहली परत पर संरेखण के निशान को कवर करने के लिए चिपकने वाला टेप का उपयोग करें। स्पिनर की वैक्यूम चक पर पहली परत के साथ सिलिकॉन वेफर को सावधानीपूर्वक रखें और सिलिकॉन वेफर को स्थिर करने के लिए वैक्यूम को लागू करें।
    2. सिलिकॉन वेफर पर एसयू -8 2025 फोटो्रेसिस्ट के 3 एमएल डालो। 5 एस के लिए 500 आरपीएम पर सिलिकॉन वेफर को स्पिन करें फिर 30 के लिए 2000 आरपीएम पर स्पिन करेंसिलिकॉन वेफर पर एक अंतिम 60 माइक्रोन मोटाई photoresist कोटिंग प्राप्त करने के लिए।
    3. स्पिनर से सिलिकॉन वेफर को सावधानीपूर्वक हटा दें और उसे हॉटप्लेट में स्थानांतरित करें; सेंकना 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए
    4. पहले परत पर संरेखण चिह्नों को बेनकाब करने के लिए चिपकने वाली टेप को धीरे से हटा दें। 6 मिनट के लिए एक हॉटप्लेट और सेंकना पर 95 डिग्री सेल्सियस पर सिलिकॉन वेफर रखें
    5. एक मुखौटा संरेखण पर सिलिकॉन वेफर को सावधानी से रखें और यूवी एक्सपोज़र का समय 18 सेकेंड सेट करें।
    6. चिपकने वाली टेप का उपयोग करते हुए पारदर्शी ग्लास प्लेट पर दूसरी परत के पारदर्शिता मुखौटा को ध्यान से संलग्न करें।
    7. संरेखण के लिए संलग्न मुखौटा के साथ कांच प्लेट को सावधानी से रखें, और संरेखण के निरीक्षण सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके क्रॉसिंग संरेखण के अंकों से सिलिकॉन वेफर पर मुखौटा और पहली परत संरेखित करें।
    8. सेल लोडिंग और ग्रेडिएंट चैनलों के पैटर्न के लिए यूवी को फोटो्रेसिस्ट लेपित सिलिकॉन वफ़र का पर्दाफाश करें।
    9. कांच की प्लेट को ध्यान से हटा दें और सिलिकॉन डब्ल्यू बाहर निकालेंafer। एक हॉटप्लेट पर 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सिलिकॉन वेफर सेंकना और फिर सिलिकॉन वफ़र को अन्य 9 5 डिग्री सेल्सियस हॉट प्लेट तक ले जाएं और 6 मिनट के लिए सेंकना करें।
    10. धूआं हुड के सिलिकॉन वेफर को स्थानांतरित करें और इसे एसयू -8 डेवलपर युक्त गिलास पैन में रखें। धीरे से यह 6 मिनट के लिए हिला
    11. ताजा एसयू -8 डेवलपर का इस्तेमाल करते हुए सिलिकॉन वफ़र को साफ करें और उसके बाद आईपीए का उपयोग धूमिल हुड के अंदर करें।
    12. धूमिल हुड के अंदर नाइट्रोजन गैस का उपयोग करके सिलिकॉन वफ़र सूखी। एक हॉटप्लेट पर सिलिकॉन वेफर रखें और 30 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर मोल्ड को ढक ले; दूसरी परत तैयार है।
  5. मास्टर मोल्ड सतह संशोधन
    नोट: नर-लिथोग्राफी में मोल्ड से पॉलीडिमैथाइलसिलॉक्सेन (पीडीएमएस) रिलीज की सुविधा के लिए एसओ -8 ढालना के लिए एक सीलनाइजेशन सतह संशोधन चरण लागू किया गया है।
    1. एक माइक्रोप्रोप्टेट टिप में 10 μL ट्रइडकैफ्लोरो-1,1,2,2-टेट्राहाइड्रोक्टोक्टील (ट्राइक्लोरोसेलीन) समाधान लें। माइक्रोमैपिपेट टिप को 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में रखोNd ट्यूब की टोपी ढीला।
    2. एक desiccator के अंदर ट्यूब और एसयू -8 पैटर्न वाला सिलिकॉन वेफर रखें और 1 घंटे के लिए वैक्यूम लागू करें; मुखौटा ढालना PDMS डिवाइस के निर्माण के लिए तैयार है।
  6. PDMS डिवाइस बनाना।
    1. प्लास्टिक बीकर में 40 ग्राम PDMS बेस और 4 जी इलाज एजेंट को मिलाकर PDMS समाधान तैयार करें। एक पेट्री डिश में तैयार एसयू -8 मास्टर ढालना रखें और ध्यान से मोल्ड पर 44 ग्राम PDMS समाधान डालें।
    2. एक डिसेकेटर में पेट्री डिश रखें और 20 मिनट के लिए PDMS समाधान के लिए वैक्यूम को लागू करें। फिर ओटीन में पेट्री डिश रखें और पीडीएमएस को 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
    3. पकाना के बाद, पेट्री डिश बाहर ले जाओ और इसे एक साफ बेंच पर रखें। एसयू -8 मोल्ड से पीडीएमएस स्लैब को सावधानी से कटकर छील कर दें।
    4. एक 3 मिमी व्यास छिद्रक का उपयोग करके सेल लोडिंग पोर्ट को घुमाएं। एक 6 मिमी व्यास छलनी का उपयोग करके रासायनिक प्रवेश जलाशयों और कचरा आउटलेट को पंच करें।
    5. इस पर धूल निकालेंचिपकने वाला टेप का उपयोग करते हुए PDMS स्लैब की सतह प्लाज्मा मशीन में PDMS स्लैब और एक साफ ग्लास स्लाइड रखें। 3 मिनट के लिए वैक्यूम को लागू करें
    6. प्लाज्मा शक्ति चालू करें और स्तर को उच्च स्तर पर सेट करें धीरे से वायु वाल्व और पीएलडीएस स्लैब को प्लास्माथेट करें और 3 मिनट के लिए ग्लास स्लाइड समायोजित करें
    7. प्लाज्मा की शक्ति को बंद करें और निर्वात छोड़ दें। सावधानी से पीडीएमएस स्लैब और चिमटी के माध्यम से कांच की स्लाइड को बाहर निकालें।
    8. ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर तुरंत PDMS स्लैब (चैनल संरचनाओं का सामना-डाउन) के साथ रखें; धीरे से PDMS स्लैब को कांच पर बांड के लिए दबाएं। विआयनीकृत पानी के साथ तुरंत microfluidic चैनल भरें; माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस निर्माण और विधानसभा को पूरा कर लिया गया है।

2. माइक्रोफ़्लुइडिक सेल माइग्रेशन परख तैयार

  1. माइक्रोफ़्लुइड डिवाइस तैयार करना
    1. स्टॉक फाइब्रोनेक्टिन समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) के 50 μL को 950 से घटाकर 50 माइक्रोग्राम / एमएल फाइब्रोनिक्टिन समाधान तैयार करें81; एल डुलबेको के फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (डीपीबीएस) एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर।
    2. 9 एमएल रॉसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट माध्यम (आरपीएमआई -1640) और आरपीएमआई -1640 का 1 एमएल 4% गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए) के मिश्रण से माइग्रेशन माध्यम तैयार करें।
    3. डिवाइस से विआयनीकृत पानी निकालें
    4. आउटलेट से डिवाइस के 100 μL फ़िब्रोनेक्टिन समाधान जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए 3 मिनट की प्रतीक्षा करें कि सभी चैनल फ़िब्रोनिक्टिन समाधान से भरे हुए हैं। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक कवर पेट्री डिश में microfluidic डिवाइस रखें।
    5. डिवाइस से फाइब्रोनेक्टिन समाधान निकालें। आउटलेट से 100 μL माइग्रेशन माध्यम जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए 3 मिनट की प्रतीक्षा करें कि सभी चैनल माइग्रेशन माध्यम से भरे गए हैं।
    6. कमरे के तापमान पर एक और 1 घंटे के लिए उपकरण सेते; उपकरण तो कैमोटैक्सिस प्रयोग के लिए तैयार है।
  2. Chemotaxis प्रयोग के लिए Chemoattractant समाधान तैयार
    1. टी में 100 एनएम एफएमएलपी समाधान तैयार करेंओटल 1 एमएल प्रवासन माध्यम 1.5 एमएल ट्यूब में एफएमएलपी समाधान के साथ 5 μL स्टॉक एफआईटीसी-डेक्सट्रान (10 केडीए, 1 एमएम) मिलाएं।
      नोट: FITC-Dextran का इस्तेमाल ढाल माप के लिए किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, Rhodamine को ढाल सूचक के रूप में उपयोग करें। एफएमएलपी केमोथेट्रेंटेंट समाधान तो कैमोटैक्सिस प्रयोग के लिए तैयार है।
  3. बेदर्द नमूना तैयारी
    नोट: सीओपीडी रोगियों से थूक नमूने के ढाल द्वारा प्रेरित न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस को इस ऑल-ऑन-चिप विधि के क्लिनिकल डायग्नोस्टिक अनुप्रयोग के रूप में परीक्षण किया गया था।
    1. सीओपीडी रोगियों से थूक नमूने एकत्र करने के लिए मानव नैतिकता प्रोटोकॉल प्राप्त करें।
      नोट: हमने विन्निपेग में सात ओक्स जनरल अस्पताल में नमूनों को इकट्ठा करने के लिए मंजूरी प्राप्त की (मैनीटोबा विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित)।
    2. सभी विषयों से सूचित लिखित सहमति प्राप्त करें
    3. सीओपीडी रोगियों के सहज थूक नमूने इकट्ठा 1.5 एमएल ट्यूब में 500 μL थूक नमूना रखें।
    4. 500 μL 0.1% डि जोड़ें1.5 एमएल ट्यूब में थियोथरेइटॉल और धीरे मिश्रण। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ट्यूब रखें
    5. नमूने को 753 x ग्रा पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और फिर सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें। 5 मिनट के लिए 865 xg पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र और फिर अंतिम सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। उपयोग के पहले एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र के अंदर एकत्रित सतह पर तैरनेवाला स्टोर करें।
    6. कैमोटैक्सिस प्रयोग के लिए तैयार होने पर, थूक समाधान का पिघलना; 900 μL माइग्रेशन माध्यम को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर 100 μL स्पुतम समाधान के साथ मिश्रण करें; थूकना समाधान तो chemotaxis प्रयोग के लिए तैयार है
  4. रक्त नमूना संग्रह
    1. स्वस्थ दाताओं से रक्त के नमूने एकत्र करने के लिए एक मानव नैतिकता प्रोटोकॉल प्राप्त करें। सभी रक्त दाताओं से सूचित लिखित सहमति प्राप्त करें।
      नोट: यहां नमूनों को विन्निपेग में विक्टोरिया जनरल अस्पताल में प्राप्त किया गया (मैनिट विश्वविद्यालय में संयुक्त-फैकल्टी रिसर्च एथिक्स बोर्ड द्वारा अनुमोदित)oba)।
    2. वेनिपूनचर द्वारा रक्त का नमूना ले लीजिए और नमूना को एक EDTA लेपित ट्यूब में डाल दिया। प्रयोग से पहले एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में ट्यूब रखें।

3. ऑल-ऑन-चिप चीमोटेक्सिस परख ऑपरेशन

  1. ऑन-चिप सेल अलगाव ( चित्रा 1 बी )
    1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर 1.5 एमएल ट्यूब में 10 μL पूरे रक्त रखें।
      नोट: रक्त नमूना संग्रह का विवरण अनुभाग 2.4 में है।
    2. न्युट्रोफिल अलगाव किट (सामग्री की तालिका देखें) से 1.5 एमएल ट्यूब में 2 μL एंटीबॉडी कॉकटेल (एबी) और 2 μL चुंबकीय कण (एमपी) जोड़ें और धीरे मिश्रण; यह न्युट्रोफिल को छोड़कर रक्त में कोशिकाओं को लेबल देगा।
    3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए खून-एब-एमपी मिश्रण सेते हैं
      नोट: यह रक्त में एंटीबॉडी लेबल वाले कोशिकाओं को चुंबकीय रूप से टैग करेगा
    4. सेल लोडिंग पी के दोनों तरफ दो छोटे चुंबकीय डिस्क संलग्न करेंउपकरण के ओआरटी डिवाइस के सभी बंदरगाहों से माध्यम का आकांक्षा।
    5. सेल लोडिंग पोर्ट से धीरे-धीरे 2 μL रक्त-एब-एमपी मिश्रण को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में विंदित करें।
      नोट: चुंबकीय लेबल वाली कोशिकाओं को सेल लोडिंग पोर्ट की ओर की दीवारों में फंस जाता है जबकि न्यूट्रोफिल डिवाइस में घुसते हैं और सेल डॉकिंग संरचना में फंस जाते हैं।
    6. सेल डॉकिंग क्षेत्र पर पर्याप्त न्युट्रोफिल फंस रहे हैं जब तक कुछ मिनट रुको।
  2. Chemotaxis परख ( चित्रा 1 सी )।
    1. तापमान नियंत्रण माइक्रोस्कोप चरण 37 डिग्री सेल्सियस पर microfluidic डिवाइस रखें।
    2. 100 μL केमोएडेट्रेंटेंट समाधान (एफएमएलपी या थूक समाधान) और 100 μL माइग्रेशन माध्यम को उनके नामित इनलेट जलाशयों में दो पिपेटर्स का प्रयोग करें; यह ढाल चैनल में एक chemoattractant gradient पैदा करेगा निरंतर लामिना का प्रवाह आधारित रासायनिक मिश्रण एक प्रेस द्वारा सहायता प्रदान करता हैई संतुलन संरचना
      नोट: सीओपीडी मरीजों से थूक संग्रह का विवरण खंड 2.3 में है।
      1. मध्यम नियंत्रण प्रयोग के लिए, केवल इनलेट जलाशयों में प्रवासन माध्यम दोनों को जोड़ें।
    3. ग्रेडियेंट चैनल में FITC-Dextran की प्रतिदीप्ति छवि प्राप्त करें
    4. ImageJ सॉफ़्टवेयर को "फाइल | ओपन" कमांड का उपयोग करके छवि को आयात करें।
    5. "विश्लेषण करें | प्लॉट प्रोफाइल" आदेश का उपयोग करके ढाल चैनल पर प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल को मापें।
    6. अधिक साजिश रचने के लिए एक स्प्रेडशीट में माप डेटा निर्यात करें।
    7. डिवाइस नियंत्रित माइक्रोस्कोप मंच पर या 15 मिनट के लिए एक पारंपरिक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में डिवाइस सेते हैं।
    8. आंकड़ों के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के अंतिम स्थितियों को रिकॉर्ड करने के लिए 10X उद्देश्य का उपयोग करके ढाल चैनल की छवि।
    9. यदि आवश्यक हो, तो समय-व्यतीत माइक्रोस्कोपी द्वारा डिवाइस में सेल माइग्रेशन रिकॉर्ड करें।

4. सेल माइग्रेशन डीएटा विश्लेषण ( चित्रा -1 सी )

  1. नीचे बताए अनुसार डॉकिंग संरचना से सेल माइग्रेशन दूरी की गणना के द्वारा कैमोटैक्सिस परख का विश्लेषण करें। चित्र 1 सी देखें
  2. NIH ImageJ सॉफ़्टवेयर में छवि आयात करें (देखें 1.45)
  3. प्रत्येक सेल का केंद्र चुनें, जो कि ढाल चैनल में चले गए।
  4. अपने अंतिम पदों के लिए चयनित कक्षों के निर्देशांक को मापें। प्रारंभिक संदर्भ स्थिति के रूप में डॉकिंग संरचना के किनारे पर एक बिंदु के समन्वय को मापें
  5. स्प्रैडशीट सॉफ़्टवेयर ( जैसे एक्सेल) के लिए मापा समन्वय डेटा निर्यात करें सेल की अंतिम स्थिति और ढाल की दिशा के साथ प्रारंभिक संदर्भ स्थिति के बीच अंतर के रूप में कोशिकाओं के प्रवास की दूरी की गणना करें।
  6. दूरी को एक माइक्रोमीटर पर कैलिब्रेट करें सभी कोशिकाओं के प्रवासिक दूरी के औसत और विचलन की गणना के रूप में एक रसायन के रूप में करें।
  7. मिग की तुलना करेंछात्र की टी -टेस्ट का प्रयोग करते हुए मध्यम नियंत्रण प्रयोग के लिए एक chemoattractant gradient की उपस्थिति में राशन दूरी
  8. यदि सेल प्रवासन की समय चूक छवियों को दर्ज किया जाता है, तो सेल माइग्रेशन और केमोटाक्सिस का विश्लेषण आगे सेल ट्रैकिंग विश्लेषण 15 द्वारा किया जा सकता है।
    नोट: ऑल-ऑन-चिप चीमोटाक्सिस परख के निर्माण और प्रदर्शन के लिए आवश्यक सामग्रियों को सामग्री की तालिका में विस्तृत किया गया है।

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Representative Results

न्यूट्रोफिल को नकारात्मक रूप से पूरे रक्त की एक बूंद से सीधे माइक्रोफ्लिडिक डिवाइस में चुना जाता है। पृथक न्युट्रोफिल की शुद्धता पर-चिप गइमेंसा धुंधला द्वारा सत्यापित किया गया था और परिणामों में न्युट्रोफिल्स ( चित्रा 2 ए ) 25 के ठेठ रिंग-आकार और लोब-आकार का नाभिक दिखाया गया था। यह संपूर्ण रक्त के एक छोटे से मात्रा से उच्च शुद्धता पर प्रभावी चिप-न्युट्रोफिल अलगाव को इंगित करता है। इसके अलावा, डॉकिंग संरचना रासायनिक ढाल ( चित्रा 2 बी ) 25 लागू करने से पहले, ग्रेडिंग चैनल के बगल में कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से संरेखित कर सकती है।

ग्रेडियेंट पीढ़ी निरंतर लामिना का प्रवाह रासायनिक मिश्रण पर आधारित है, और प्रवाह इनलेट और आउटलेट समाधान के विभिन्न स्तरों से दबाव अंतर से प्रेरित होता है। कोई बाहरी पंपों की आवश्यकता नहीं है रासायनिक ग्रेडियनटी कुछ मिनटों में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में स्थापित होता है, जो कि ढाल चैनल भर में FITC-Dextran के प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफाइल की विशेषता है। ढाल कम से कम 1 घंटे के लिए स्थिर है, जो वर्तमान न्युट्रोफिल केमोटेक्सिस प्रयोग ( चित्रा -1 सी ) के लिए पर्याप्त समय है।

सेल माइग्रेशन रिसर्च के लिए ऑल-ऑन-चिप विधि के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, अकेले या एफएमएलपी ग्रेडिएंट में न्यूट्रोफिल केमोटाक्सिस की तुलना की गई थी। परीक्षण के नतीजे बताते हैं कि मध्यम नियंत्रण प्रयोग में बाधा चैनल के माध्यम से कुछ कोशिकाओं को क्रॉल किया गया था। इसके विपरीत, कई न्युट्रोफिल तेजी से बाधा चैनल के माध्यम से चले गए और 100 एनएम एफएमएलपी ग्रेडिएंट ( चित्रा 2 बी ) 25 की ओर स्थानांतरित हो गए। सेल प्रवासन परीक्षण मात्रात्मक रूप से प्रवासन दूरी द्वारा मापा जाता है, जो कि मध्यम नियंत्रण से एफएमएलपी ढाल के लिए काफी अधिक है ( 25

इसके अलावा, सीओपीडी रोगियों से स्टेमम नमूने की एक ढाल के लिए अकेले मध्यम में न्युट्रोफिल प्रवासन की तुलना करके संभावित नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए सभी-पर-चिप विधि का प्रदर्शन किया गया। परिणाम सीओपीडी स्टेमम ग्रेडिएन्ट में एक मजबूत सेल प्रवासन दिखाते हैं, जो मात्रात्मक रूप से मध्यम नियंत्रण ( चित्रा 2 बी - सी ) 25 की तुलना में काफी अधिक प्रवासिक दूरी से दर्शाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1: न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस विश्लेषण के लिए ऑल-ऑन-चिप विधि का चित्रण। ( ए ) माइक्रोफ़्लुइडिक डिवाइस का चित्रण डिवाइस में दो परतें शामिल हैं पहली परत (4 सुक्ष्ममापी) सेल को परिभाषित करता हैएल ब्लॉकिंग चैनल के बगल में कोशिकाओं को फँसाने के लिए बाधा चैनल डॉकिंग। दूसरी परत (60 माइक्रोन उच्च), ग्रेड लोडिंग, रासायनिक प्रवेश जलाशयों और कचरे के आउटलेट के लिए ढाल बनाने वाले चैनल, बंदरगाह और चैनल को परिभाषित करता है। संरेखण के निशान दो परतों के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। दूसरी परत के लिए, ऊपर की ओर सर्पिल इनपुट चैनल की लंबाई और चौड़ाई क्रमशः 60 मिमी और 200 माइक्रोन है; नीचे की ओर से साँप इनपुट चैनल की लंबाई और चौड़ाई क्रमशः 6 मिमी और 280 माइक्रोन है; ( बी ) ऑल-ऑन-चिप सेल अलगाव विधि का चित्रण; ( सी ) कैमोटैक्सिस परीक्षण का चित्रण इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि के परिणामऑल-ऑन-चिप न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस विश्लेषण 25 ( ए ) माइमफ्लिडिक चैनल में ऑल-ऑन-चिप पृथक कोशिकाओं की जीमेसा स्टीनिंग इमेज (एक 60 एक्स उद्देश्य का उपयोग करके); ( बी ) मध्यम नियंत्रण में सेल वितरण की तुलना, एक 100 एनएम एफएमएलपी ग्रेडियेंट और एक सीओपीडी स्ताम ग्रेडिएंट; ( सी ) मध्यम नियंत्रण में ढाल चैनल में औसत सेल माइग्रेशन दूरी, एक एफएमएलपी ग्रेडियेंट और सीओपीडी स्टेमम ग्रेडिएन्ट। त्रुटि सलाखों के माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि दर्शाती है * छात्र के टी- टेस्ट से पी <0.05 इंगित करता है। आंकड़े विश्व वैज्ञानिक प्रकाशन से अनुमति के साथ संदर्भ 25 से अनुकूलित किए गए थे। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

इस पत्र में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल को सीधे न्युट्रोफिल को संपूर्ण रक्त से अलग कर दिया गया है, जो कि कैमॉटोक्सिस टेस्ट के बाद किया गया था, जो कि एक एकल माइक्रोफ्लूइडिक चिप पर था। यह विधि अपने आसान संचालन, उच्च शुद्धता न्युट्रोफिल के नकारात्मक चयन, तीव्र नमूना-से-परिणाम केमोटाक्सिस परीक्षण, कम अभिकर्मकों और नमूना खपत, और सटीक सेल माइग्रेशन डेटा विश्लेषण में उपयोगी विशेषताओं प्रदान करता है। एक अनुमान के मुताबिक, निविष्टि रक्त के नमूने से कम से कम 25% न्युट्रोफिल डिवाइस में डॉकिंग संरचना में प्रभावी ढंग से प्रवेश कर चुके हैं और हमें पाया गया कि न्युट्रोफिल शुद्धता चिप पर गिम्ससा धुंधला द्वारा उच्च है।

यह सब-ऑन-चिप विकसित कीमोटेक्सिस विश्लेषण पद्धति में विभिन्न सेल प्रवासन अनुसंधान और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में बहुत संभावनाएं हैं। न्युट्रोफिल केमोटेक्सिस की तुलना में केवल एक एफएमएलपी ग्रेडिएंट के माध्यम से इस पद्धति का एक शोध अनुप्रयोग प्रदर्शित किया गया था। इसी तरह, सीओपीडी स्पा में न्युट्रोफिल केमोटाक्सिस का परीक्षण करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया जा सकता हैटम नैदानिक ​​निदान के लिए एक सेल कार्यात्मक बायोमार्कर विकसित करने का एक उदाहरण के रूप में। इस पद्धति के साथ, एक शोधकर्ता अलग-अलग केमोटाट्रेट्स को अलग-अलग या संयोजन में न्यूट्रोफिल केमोटाक्सिस का परीक्षण कर सकता है। शोधकर्ताओं ने न्युट्रोफिल केमोटेक्सिस को रोगी या जटिल नैनोट्रोफिलिस से जटिल रोगियों से संभावित रूप से बदले जाने वाले चेमोटाक्सिस प्रतिक्रिया के लिए इस पद्धति का उपयोग कर परीक्षण कर सकते हैं। यह एकीकृत ऑल-ऑन-चिप विधि विशेष रूप से अनुसंधान या नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में परीक्षण करने के लिए उपयोगी है, जिनके पास विशेष सेल संस्कृति और लाइव सेल इमेजिंग सुविधाएं नहीं हैं। परीक्षण इस प्रोटोकॉल के बाद शोधकर्ताओं या चिकित्सकों द्वारा आसानी से संचालित किया जा सकता है। अधिक उन्नत अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए, इस पद्धति से समय-व्यतीत माइक्रोस्कोपी को व्यक्तिगत सेल आंदोलन को ट्रैक करने की अनुमति मिलती है।

सामान्य तौर पर, यह सब-ऑन-चिप विधि संचालित करना आसान है और परिणाम मजबूत है। कई तकनीकी अनुस्मारक एक सफल प्रयोग को सुनिश्चित करेंगे। पहला, वेंबहुत पतली बाधा चैनल को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए ई PDMS प्रतिकृति को धीरे-धीरे कक्षा के सब्सट्रेट पर प्लाज्मा बाँध के दौरान दबाया जाना चाहिए। दूसरा, सेल लोडिंग पोर्ट में मध्यम के वाष्पीकरण रासायनिक ढाल को परेशान कर सकता है। यह किमोटाक्सिस परीक्षण के दौरान सेल लोडिंग पोर्ट को सीलिंग टैब के साथ कवर करने के लिए अनुशंसित है। तीसरा, रक्त के नमूने को धीरे-धीरे डिवाइस पर लोड किया जाना चाहिए ताकि उच्च दबाव से बचा जा सके जो किमोटाक्सिस प्रयोग से पहले बाधा चैनल पर कोशिकाओं को धक्का दे सकते हैं। चौथा, मौजूदा सेटिंग में, हम चैनल को प्रवेश करने से अवांछित कोशिकाओं को रोकने के लिए कैमोटैक्सिस परख के दौरान सेल लोडिंग पोर्ट से जुड़े मैग्नेट को रखने की सलाह देते हैं। वैकल्पिक रूप से, पीडीएमएस का एक अलग टुकड़ा और छेद वाले चुंबकीय डिस्क को डिवाइस के सेल लोडिंग पोर्ट के साथ गठबंधन किया जा सकता है। इस स्थिति में, सेल अलगाव के बाद डिवाइस से श्रेष्ठ पीडीएमएस भाग चुंबकीय डिस्क और फंस कोशिकाओं के साथ निकाल दिया जा सकता है।

यह सब पर- chआईपी ​​पद्धति को इसके वर्तमान सीमाओं से उबरने और अपनी क्रियाकलापों में सुधार और विस्तार करने के लिए आगे विकसित किया जा सकता है। सबसे पहले, वर्तमान डिवाइस केवल एक समय पर एकल परख की अनुमति देता है, इस प्रकार इस प्रक्रिया को सीमित करता है। कई समानांतर परीक्षण इकाइयों के साथ डिवाइस के आगे के विकास से प्रयोगात्मक थ्रूपुट आवश्यकता में सुधार होगा। दूसरा, वर्तमान प्रवाह-आधारित रासायनिक ढाल जनरेटर 1D में ढाल पीढ़ी 2 डी या 3 डी प्रवाह-मुक्त ढाल जनरेटर के आगे विकास बेहतर शारीरिक ढाल की स्थिति की नकल करेगा। तीसरा, न्युट्रोफिल के अलावा, सिद्धांत में यह सब-ऑन-चिप विधि अन्य सफेद रक्त कोशिका प्रकार जैसे टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे समान चुंबकीय सेल अलगाव किट का उपयोग कर। यह अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण होगा कि इस पद्धति को कम आवृत्ति पर रक्त कोशिकाओं की आबादी का परीक्षण करने के लिए प्रभावी ढंग से उपयोग किया जा सकता है और इन कोशिकाओं को किमोटाक्सिस परीक्षण से पहले ऑन-चिप सक्रियण और संस्कृति की आवश्यकता होती है। फिर सभी पर चिप सेल अलगाव विधि caआगे कुछ अन्य अनुप्रयोगों के लिए आगे बढ़ाया जाएगा विभिन्न बाधा चैनल मोटाई की जांच की गई और परिणामों से पता चला कि 3-4 माइक्रोन न्युट्रोफिल माइग्रेशन प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त है; यही है, यह संयुक्त रूप से प्रेरित कोशिकाओं को फंस गया और कोशिकाओं को उत्तेजना पर बाधा चैनल के माध्यम से क्रॉल करने की अनुमति दी। बाधा चैनल आयाम विभिन्न सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। अंत में, यह एकीकृत और तेज़ चीमोटाक्सिस परीक्षण, शोधकर्ताओं को प्रासंगिक नैदानिक ​​अनुप्रयोगों का पता लगाने की अनुमति देगा। क्लीनिकों में व्यावहारिक परीक्षण को सक्षम करने के लिए, एक पोर्टेबल सिस्टम विकसित किया गया है जो माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस, तापमान और स्टेज नियंत्रण, साथ ही स्मार्टफोन-आधारित ऑप्टिकल इमेजिंग और डेटा विश्लेषण मॉड्यूल को एकीकृत करता है। इस पत्र में प्रदर्शित सीओपीडी से संबंधित अध्ययन के अतिरिक्त, इस सभी-पर-चिप विधि का उपयोग करके अन्य संबंधित बीमारियों जैसे कि क्रोनिक किडनी रोग की सेल माइग्रेशन की जांच की जा रही है।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

यह काम भाग में प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (एनएसईआरसी) और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीआईएचआर) से अनुदान द्वारा समर्थित है। हम मानव विषयों से नैदानिक ​​नमूनों के प्रबंधन के लिए विन्निपेग में विक्टोरिया जनरल अस्पताल और विन्निपेग में सात ओक्स जनरल अस्पताल में क्लिनिकल इंस्टीट्यूट ऑफ एप्लाइड रिसर्च एंड एजुकेशन का धन्यवाद करते हैं। हम परख अभियान रणनीतियों के बारे में उपयोगी चर्चा के लिए डॉ। हेजिट पेरेत्ज़-सोरोका का धन्यवाद करते हैं। फिल्मांकन प्रक्रिया में उनके उदार सहयोग के लिए हम वाटरलू विश्वविद्यालय से प्रोफेसर कैरोलिन रेन और डा। ज़ियाओमिंग (कोडी) चेन का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		 Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		 Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		 R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		 STEMCELL
Technologies Inc		 19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

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References

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Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

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