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Immunology and Infection

Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 1, 1, 5, 3,4,6,7
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

Este artículo proporciona el método detallado de realizar un ensayo rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando el aislamiento de neutrófilos a bordo de la sangre entera y la prueba de quimiotaxis en un único chip microfluídico.

Abstract

La migración de neutrófilos y la quimiotaxis son fundamentales para el sistema inmunológico de nuestro cuerpo. Los dispositivos microfluídicos se utilizan cada vez más para investigar la migración de neutrófilos y la quimiotaxis debido a sus ventajas en visualización en tiempo real, control preciso de la generación de gradiente de concentración química y consumo reducido de reactivos y muestras. Recientemente, los investigadores microfluídicos han hecho un esfuerzo creciente para desarrollar sistemas de análisis de quimiotaxis microfluídicos integrados y fáciles de operar, directamente de sangre entera. En esta dirección, se desarrolló el primer método todo en chip para integrar la purificación negativa magnética de los neutrófilos y el ensayo de quimiotaxis a partir de muestras de pequeño volumen sanguíneo. Este nuevo método permite una rápida prueba de quimiotaxis de neutrófilos de muestra a resultado en 25 min. En este artículo, proporcionamos la construcción detallada, operación y método de análisis de datos para este ensayo de quimiotaxis todo en chip con una discusión sobre estrategias de solución de problemas, limiTaciones y direcciones futuras. Se muestran resultados representativos del ensayo de quimiotaxis de neutrófilos que prueban un quimioatrayente definido, N -formil-Met-Leu-Phe (fMLP) y esputo de un paciente con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), utilizando este método todo en chip. Este método es aplicable a muchas investigaciones relacionadas con la migración celular y aplicaciones clínicas.

Introduction

La quimiotaxis, un proceso de migración celular dirigida a un gradiente de concentración química soluble, está implicada de manera crítica en muchos procesos biológicos incluyendo la respuesta inmune 1 , 2 , 3 , el desarrollo de tejido 4 y la metástasis de cáncer 5 . Los neutrófilos son el subconjunto de glóbulos blancos más abundantes y desempeñan un papel crucial en la habilitación de las funciones innatas de defensa del huésped del cuerpo, así como en la mediación de las respuestas inmunes adaptativas 6 , 7 . Los neutrófilos están equipados con maquinaria quimiotáctica altamente regulada que permite a estas células inmunitarias móviles responder tanto a los quimioatrayentes derivados de patógenos ( por ejemplo, fMLP) como a los quimioatractores derivados del huésped ( por ejemplo, interleucina-8) a través de la quimiotaxis 8 . La migración de neutrófilos y la quimiotaxis median diversos problemas fisiológicosY enfermedades tales como inflamación y cánceres 1 , 9 . Por lo tanto, la evaluación precisa de la quimiotaxis de neutrófilos proporciona una lectura funcional importante para el estudio de la biología de neutrófilos y las enfermedades asociadas.

En comparación con los ensayos de quimiotaxis convencional ampliamente utilizados ( por ejemplo, el ensayo de transwell 10 ), los dispositivos microfluídicos son muy prometedores para la evaluación cuantitativa de la migración celular y la quimiotaxis debido a la generación de gradiente químico controlado con precisión y la miniaturización 11 , 12 , 13 . Durante las dos últimas décadas aproximadamente, se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para estudiar la quimiotaxis de diferentes tipos de células biológicas, especialmente los neutrófilos 11 . Se realizó un esfuerzo significativo para caracterizar la migración de neutrófilos Micos que se configuraron en los dispositivos microfluídicos 14 , 15 . También se desarrollaron estrategias interesantes para estudiar la toma direccional de decisiones por parte de los neutrófilos utilizando los dispositivos microfluídicos. 16 Al margen de la investigación biológicamente orientada, las aplicaciones de los dispositivos microfluídicos se han ampliado para probar las muestras clínicas para la evaluación de la enfermedad 17,18,19. Sin embargo, el uso de muchos dispositivos microfluídicos se limita a laboratorios de investigación especializados y requiere un largo aislamiento de neutrófilos de un gran volumen de muestras de sangre. Por lo tanto, ha habido una tendencia creciente del desarrollo de dispositivos microfluídicos integrados para el análisis rápido de quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre entera 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Hacia esta dirección, se desarrolló un método de todo en chip que integra la purificación de neutrófilos negativos magnéticos y el subsiguiente ensayo de quimiotaxis en un solo dispositivo microfluídico 25 . Este método todo-en-chip tiene las siguientes características novedosas: 1) en contraste con las estrategias de chip anteriores que aíslan neutrófilos de la sangre mediante la captura de células basadas en adhesión o el filtrado basado en tamaño de celda 20 , 22 , Pureza, separación magnética sobre chip de los neutrófilos de pequeños volúmenes de sangre completa, así como medición de quimiotaxis mediante estimulación quimioatrayente; 2) la estructura de acoplamiento de células ayuda a alinear las posiciones iniciales de los neutrófilos cerca del canal de gradiente químico y permite un análisis de quimiotaxis simple sin rastreo de células individuales; 3) la integración del aislamiento de neutrófilos y chemotEje en un único dispositivo microfluídico permite un análisis rápido de la quimiotaxis de muestra a resultado en 25 minutos cuando no hay interrupción entre los pasos experimentales.

Este documento proporciona un protocolo detallado para la construcción, operación y análisis de datos método de este todo-en-chip quimiotaxis ensayo. El artículo demuestra el uso efectivo del método desarrollado para realizar la quimiotaxis de neutrófilos mediante la prueba de un quimioatrayente recombinante conocido y muestras quimiotácticas complejas de pacientes, seguido por una discusión sobre estrategias de resolución de problemas, limitaciones y direcciones futuras.

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Protocol

Todos los protocolos de recolección de muestras humanas fueron aprobados por la Junta de Ética en Investigación de la Universidad de Manitoba, Winnipeg.

1. Fabricación de dispositivos microfluídicos ( Figura 1A )

  1. Diseñe e imprima la máscara de la transparencia.
    1. Diseñar el dispositivo según lo detallado previamente 25 . Véase la figura 1A .
      NOTA: El dispositivo incluye dos capas. La primera capa (4 μm de altura) define el canal de barrera de acoplamiento de células para atrapar las células junto al canal de gradiente. La segunda capa (60 μm de altura) define el canal de generación de gradiente, el puerto y el canal para la carga de células, los depósitos de entrada de productos químicos y la salida de desechos. Las marcas de alineación están diseñadas para las dos capas. Para la segunda capa, la longitud y anchura del canal de entrada de serpentina aguas arriba es de 60 mm y 200 μm, respectivamente; La longitud y el ancho de la corriente descendenteSerpentina es de 6 mm y 280 μm, respectivamente.
    2. Imprima las características de primera y segunda capa a una máscara de transparencia utilizando una impresora de alta resolución.
      NOTA: La resolución de impresión depende de las características mínimas del diseño. En el diseño actual, se eligió 32.000 dpi para una característica mínima de 10 μm.
  2. Limpie la oblea de silicio.
    1. Coloque una oblea de silicona de 3 en el limpiador de plasma. Aplicar el vacío durante 3 min.
    2. Encienda la alimentación de plasma y ajuste el nivel a HIGH. Utilice el plasma de oxígeno para tratar la oblea de silicio durante 30 min.
    3. Apague el limpiador de plasma y saque la oblea de silicio; La oblea de silicio está lista para fabricar el molde de dispositivo.
  3. Fabricar la primera capa por fotolitografía en una sala limpia.
    NOTA: Los parámetros de fabricación exactos pueden variar dependiendo de la instalación de fabricación.
    1. Diluir 10 ml de SU-8 2025 con 10 ml de SU-8 2000 en un disyuntor de vidrio para preparar el fotorresistor diseñado. Dejar la mezcla en la campana extractora durante 10 minutos hasta que desaparezcan las burbujas.
    2. Coloque cuidadosamente la oblea de silicio limpiada en la hiladora con el portabrocas adecuado y aplique el vacío para inmovilizar la oblea de silicio.
    3. Con cuidado, verter 3 ml de la mezcla de fotorresistencia sobre el centro de la oblea de silicio. Girar a 500 rpm durante 5 s. A continuación, centrifugación a 3.000 rpm durante 30 s para obtener un revestimiento de fotorresistencia final de 4 μm de grosor sobre la oblea de silicio.
    4. Retire cuidadosamente la oblea de silicio de la hiladora y hornear la oblea de silicio en una placa caliente durante 4 minutos a 95 ° C.
    5. Coloque cuidadosamente la oblea de silicio en un alineador de máscara y ajuste el tiempo de exposición UV a 6 s. Con cuidado, coloque la máscara transparente de la primera capa sobre una placa de vidrio transparente usando cinta adhesiva.
    6. Coloque suavemente la placa de vidrio transparente con la máscara adjunta en el alineador y alinee la máscara con la oblea de silicio. Exponer el siLicon a la UV para modelar la estructura de acoplamiento de la célula.
    7. Retire cuidadosamente la placa de vidrio y saque la oblea de silicio expuesta. Hornear la oblea de silicio en una placa caliente durante 4 minutos a 95 ° C.
    8. Transferir la oblea de silicio a una campana extractora y colocarla en una cacerola de vidrio que contenga el revelador SU-8. Agite suavemente durante 30 s.
    9. Limpie la oblea de silicio usando desarrollador SU-8 fresco seguido de alcohol isopropílico (IPA) dentro de la campana extractora. Seque la oblea de silicio con gas nitrógeno dentro de la campana extractora; La primera capa está lista.
  4. Fabricar la segunda capa en la primera capa.
    1. Utilice cinta adhesiva para cubrir las marcas de alineación en la primera capa. Coloque cuidadosamente la oblea de silicio con la primera capa en el mandril de vacío de la hiladora y aplique vacío para inmovilizar la oblea de silicio.
    2. Vierta 3 mL de fotorresistor SU-8 2025 en la oblea de silicio. Hacer girar la oblea de silicio a 500 rpm durante 5 s. A continuación, girar a 2000 rpm durante 30S para obtener un recubrimiento final de fotorresistencia de 60 μm de espesor sobre la oblea de silicio.
    3. Retire cuidadosamente la oblea de silicio de la hiladora y transfiérala a una placa caliente; Hornear a 65 ° C durante 2 min.
    4. Retire suavemente la cinta adhesiva para exponer las marcas de alineación en la primera capa. Coloque la oblea de silicio en una placa de cocción y hornee a 95 ° C durante 6 min.
    5. Coloque cuidadosamente la oblea de silicio en un alineador de máscara y ajuste el tiempo de exposición UV a 18 s.
    6. Con cuidado, coloque la máscara transparente de la segunda capa sobre una placa de vidrio transparente usando cinta adhesiva.
    7. Coloque cuidadosamente la placa de vidrio con la máscara adjunta en el alineador y alinee la máscara y la primera capa en la oblea de silicio mediante las marcas de alineación cruzadas usando el microscopio de inspección del alineador.
    8. Exponer la oblea de silicio recubierta con fotorresistencia a UV para modelar los canales de carga celular y gradiente.
    9. Retire cuidadosamente la placa de vidrio y saque el silicio wAfer Hornear la oblea de silicio en una placa caliente a 65 ° C durante 2 min y luego transferir la oblea de silicio a otra placa caliente 95 ° C y hornear durante 6 min.
    10. Transferir la oblea de silicio a la campana extractora y colocarla en un recipiente de vidrio que contenga el revelador SU-8. Agite suavemente durante 6 min.
    11. Limpie la oblea de silicio utilizando desarrollador SU-8 fresco seguido de IPA dentro de la campana extractora.
    12. Seque la oblea de silicio usando gas nitrógeno dentro de la campana extractora. Coloque la oblea de silicio en una placa de cocción y hornee duro el molde a 150 ° C durante 30 minutos; La segunda capa está lista.
  5. Modificación de la superficie del molde principal.
    NOTA: Se aplica una etapa de modificación de superficie de silanización al molde SU-8 para facilitar la liberación de polidimetilsiloxano (PDMS) del molde en litografía blanda.
    1. Tomar 10 μl de solución de tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil (triclorosilano) en una punta de micropipeta. Coloque la punta de la micropipeta en un tubo de plástico de 15 ml aNd aflojar la tapa del tubo.
    2. Coloque el tubo y la pastilla de silicio con patrón SU-8 dentro de un desecador y aplique el vacío durante 1 h; El molde de máscara está listo para fabricar el dispositivo PDMS.
  6. Fabricar el dispositivo PDMS.
    1. Preparar la solución de PDMS mezclando 40 g de base de PDMS y 4 g de agente de curado en un vaso de precipitados de plástico. Coloque el molde maestro SU-8 preparado en una placa de Petri y coloque cuidadosamente 44 g de solución PDMS sobre el molde.
    2. Coloque la placa de Petri en un desecador y aplique vacío para desgasear la solución de PDMS durante 20 min. A continuación, colocar la placa de Petri en un horno y curar el PDMS a 80 ° C durante 2 h.
    3. Después de hornear, saque el plato de Petri y colóquelo en un banco limpio. Cuidadosamente cortar y pelar la losa PDMS del molde SU-8.
    4. Sacar el orificio de carga de la celda con un punzón de 3 mm de diámetro. Perforar los depósitos de entrada de productos químicos y la salida de desechos usando un punzón de 6 mm de diámetro.
    5. Retire el polvo de laSuperficie de la losa PDMS utilizando cinta adhesiva. Coloque la losa PDMS y una diapositiva de vidrio limpia en la máquina de plasma. Aplicar el vacío durante 3 min.
    6. Encienda la alimentación de plasma y ajuste el nivel a HIGH. Ajustar suavemente la válvula de aire y plasmatreat la plancha PDMS y el portaobjetos de vidrio durante 3 min.
    7. Apague la energía del plasma y libere el vacío. Saque con cuidado la losa PDMS y la diapositiva de cristal con pinzas.
    8. Coloque inmediatamente la plancha PDMS (con las estructuras del canal boca abajo) en la parte superior del portaobjetos de vidrio; Presione suavemente la plancha PDMS para adherirla al cristal. Llenar el canal microfluídico con agua desionizada inmediatamente; Se completan la fabricación y el montaje del dispositivo microfluídico.

2. Preparación del ensayo de migración de células microfluídicas

  1. Preparación del dispositivo microfluídico.
    1. Preparar 50 μg / mL de solución de fibronectina mediante la dilución de 50 μl de solución madre de fibronectina (1 mg / mL) a 95081; L solución salina tamponada con fosfato Dulbecco (DPBS) dentro de un gabinete de bioseguridad.
    2. Preparar el medio de migración mezclando 9 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) y 1 ml de RPMI-1640 con albúmina de suero bovino al 4% (BSA).
    3. Retire el agua desionizada del dispositivo.
    4. Agregue 100 μl de solución de fibronectina al dispositivo desde la salida. Espere 3 min para asegurarse de que todos los canales estén llenos de solución de fibronectina. Colocar el dispositivo microfluídico en una placa de Petri cubierta durante 1 h a temperatura ambiente.
    5. Retire la solución de fibronectina del dispositivo. Añadir 100 μL de medio de migración desde la salida. Espere 3 minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos de medio de migración.
    6. Incubar el dispositivo durante 1 h más a temperatura ambiente; El dispositivo está entonces listo para el experimento de quimiotaxis.
  2. Preparación de la solución quimioatractante para el experimento de quimiotaxis.
    1. Preparar solución de fMLP 100 nM en tOtal 1 ml de medio de migración. Mezclar 5 μL de FITC-Dextrano (10 kDa, 1 mM) con la solución de fMLP en un tubo de 1,5 ml.
      NOTA: FITC-Dextran se utiliza para la medición del gradiente. Alternativamente, use Rhodamine como indicador de gradiente. La solución quimioatrayente de fMLP está entonces lista para el experimento de quimiotaxis.
  3. Preparación de la muestra de esputo.
    NOTA: La quimiotaxis de neutrófilos inducida por un gradiente de muestra de esputo de pacientes con EPOC se probó como una aplicación de diagnóstico clínico de este método todo en chip.
    1. Obtener un protocolo de ética humana para recolectar muestras de esputo de pacientes con EPOC.
      NOTA: Obtuvimos aprobaciones para recolectar muestras en el Seven Oaks General Hospital de Winnipeg (aprobado por la Universidad de Manitoba).
    2. Obtenga los formularios de consentimiento por escrito de todas las personas.
    3. Recoger las muestras espontáneas de esputo de los pacientes con EPOC. Coloque 500 μl de muestra de esputo en un tubo de 1,5 ml.
    4. Añadir 500 μl de diTiotreitol en el tubo de 1,5 ml y mezclar suavemente. Colocar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 15 min.
    5. Centrifugar la muestra a 753 xg durante 10 min y luego recoger el sobrenadante. Centrifugar el sobrenadante a 865 xg durante 5 min y luego recoger el sobrenadante final. Guarde el sobrenadante recogido dentro de un congelador de -80 ° C antes de su uso.
    6. Cuando esté listo para el experimento de quimiotaxis, descongelar la solución de esputo; Transferir 900 μL de medio de migración a un tubo de 1,5 ml y mezclar con 100 μl de solución de esputo dentro de un gabinete de bioseguridad; La solución de esputo está entonces lista para el experimento de quimiotaxis.
  4. Recolección de muestras de sangre.
    1. Obtener un protocolo de ética humana para recolectar muestras de sangre de donantes sanos. Obtenga los formularios de consentimiento por escrito de todos los donantes de sangre.
      NOTA: Aquí se obtuvieron muestras en el Victoria General Hospital de Winnipeg (aprobado por la Junta de Ética en Investigación de la Universidad de ManitOba).
    2. Recoger la muestra de sangre por punción venosa y colocar la muestra en un tubo recubierto de EDTA. Mantenga el tubo en un gabinete de bioseguridad antes del experimento.

3. Operación de Ensayo de Quimiotaxis All-on-chip

  1. Aislamiento de células en chip ( Figura 1B ).
    1. Coloque 10 μL de sangre entera en un tubo de 1,5 ml dentro de un gabinete de bioseguridad.
      NOTA: Los detalles de la recolección de muestras de sangre se encuentran en la sección 2.4.
    2. Añadir 2 μl de anticuerpo de anticuerpos (Ab) y 2 μL de partículas magnéticas (MP) del kit de aislamiento de neutrófilos (ver tabla de materiales) en el tubo de 1,5 ml y mezclar suavemente; Esto etiquetará las células en la sangre excepto los neutrófilos.
    3. Incubar la mezcla de sangre-Ab-MP durante 5 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Esto marcará magnéticamente las células marcadas con anticuerpos en sangre.
    4. Conecte dos pequeños discos magnéticos a los dos lados de la célula de carga pOrt del dispositivo. Aspire el medio de todos los puertos del dispositivo.
    5. Pipetar lentamente 2 μl de mezcla de sangre-Ab-MP en el dispositivo microfluídico desde el orificio de carga celular.
      NOTA: Las células marcadas magnéticamente quedan atrapadas en las paredes laterales del puerto de carga celular mientras que los neutrófilos fluirán hacia el dispositivo y quedarán atrapados en la estructura de acoplamiento de células.
    6. Espere unos minutos hasta que haya suficientes neutrófilos atrapados en el área de acoplamiento de la célula.
  2. Ensayo de quimiotaxis ( Figura 1C ).
    1. Coloque el dispositivo microfluídico en la etapa de microscopio con temperatura controlada a 37 ° C.
    2. Añadir 100 μl de solución quimioatrayente (fMLP o solución de esputo) y 100 μL de medio de migración a sus reservorios de entrada designados usando dos pipetas; Esto generará un gradiente quimioatrayente en el canal de gradiente por mezcla química continua basada en el flujo laminar asistida por una presiónE estructura de equilibrio.
      NOTA: Los detalles de la colección de esputo de pacientes con EPOC se encuentran en la sección 2.3.
      1. Para el experimento de control medio, sólo añada medio de migración a ambos reservorios de entrada.
    3. Adquirir la imagen de fluorescencia de FITC-Dextrano en el canal de gradiente.
    4. Importe la imagen al software ImageJ usando el comando "Archivo | Abrir".
    5. Mida el perfil de intensidad de fluorescencia a través del canal de gradiente usando el comando "Analizar | Perfil de trazado".
    6. Exporte los datos de medición a una hoja de cálculo para realizar un trazado adicional.
    7. Incubar el dispositivo en la etapa de microscopio con temperatura controlada o en una incubadora de cultivo celular convencional durante 15 min.
    8. Imagen del canal de degradado utilizando un objetivo de 10X para registrar las posiciones finales de las células para el análisis de datos.
    9. Si es necesario, registre la migración celular en el dispositivo por microscopía de lapso de tiempo.

4. Migración de celdas DAta Análisis ( Figura 1C )

  1. Analizar el ensayo de quimiotaxis calculando la distancia de migración celular de la estructura de acoplamiento como se describe a continuación. Véase la figura 1C .
  2. Importe la imagen en el software NIH ImageJ (ver 1.45).
  3. Seleccione el centro de cada celda que se movió en el canal de degradado.
  4. Mida las coordenadas de las celdas seleccionadas para sus posiciones finales. Mida la coordenada de un punto en el borde de la estructura de acoplamiento como la posición de referencia inicial.
  5. Exporte los datos de coordenadas medidos a un programa de hoja de cálculo ( por ejemplo, Excel). Calcular la distancia de migración de las células como la diferencia entre la posición final de una célula y la posición de referencia inicial a lo largo de la dirección del gradiente.
  6. Calibre la distancia a un micrómetro. Calcular el promedio y la desviación de la distancia de migración de todas las células como una medida de la quimiotaxis.
  7. Comparar el migRación en presencia de un gradiente quimioatrayente al experimento de control de medio utilizando el test t de Student.
  8. Si se registran las imágenes de lapso de tiempo de la migración celular, la migración celular y la quimiotaxis pueden analizarse adicionalmente mediante el análisis de seguimiento celular 15 .
    NOTA: Los materiales necesarios para construir y realizar el ensayo de quimiotaxis todo en chip se detallan en la tabla de materiales.

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Representative Results

Los neutrófilos se seleccionan negativamente de una gota de sangre completa directamente en el dispositivo microfluídico. La pureza de los neutrófilos aislados se verificó por medio de chip Giemsa tinción y los resultados mostraron la forma de anillo en forma de anillo y lóbulo en forma de núcleos de neutrófilos ( Figura 2A ] [ 25] . Esto indica un aislamiento eficaz de neutrófilos en chip con alta pureza a partir de un pequeño volumen de sangre entera. Además, la estructura de acoplamiento puede alinear eficazmente las células junto al canal de gradiente antes de aplicar el gradiente químico ( Figura 2B ) 25 .

La generación de gradiente se basa en el mezclado químico de flujo laminar continuo y los flujos son impulsados ​​por la diferencia de presión de los diferentes niveles de las soluciones de entrada y salida. No se requieren bombas externas. El químico gradienT se establece en pocos minutos en el dispositivo microfluídico, que se caracteriza por el perfil de intensidad de fluorescencia de FITC-Dextrano a través del canal de gradiente. El gradiente es estable durante al menos 1 h, lo cual es suficiente tiempo para el experimento de quimiotaxis de neutrófilos actual ( Figura 1C ).

Para demostrar el uso del método "all-on-chip" para la investigación de migración celular, se comparó la quimiotaxis de neutrófilos en medio solo o en un gradiente de fMLP. Los resultados de la prueba mostraron que pocas células se arrastraron a través del canal de barrera en el experimento de control de medio. Por el contrario, muchos neutrófilos rápidamente movido a través del canal de barrera y migrado hacia el 100 nM fMLP gradiente ( Figura 2B ] [ 25] . La prueba de migración celular se mide cuantitativamente por la distancia de migración, que es significativamente mayor para el gradiente de fMLP que el control de medio ( 25 .

Por otra parte, el método de todo en chip se demostró para posibles aplicaciones clínicas mediante la comparación de la migración de neutrófilos en el medio solo a un gradiente de la muestra de esputo de pacientes con EPOC. Los resultados mostraron una fuerte migración celular al gradiente de esputo de EPOC, que se indica cuantitativamente por la distancia de migración significativamente mayor en comparación con el control de medio ( Figura 2B - C ) [ 25] .

Figura 1
Figura 1: Ilustración del método all-on-chip para el análisis de quimiotaxis de neutrófilos. ( A ) Ilustración del dispositivo microfluídico. El dispositivo incluye dos capas. La primera capa (4 μm de altura) define el celL canal de barrera de acoplamiento para atrapar las células junto al canal de gradiente. La segunda capa (60 μm de altura) define el canal generador de gradiente, el puerto y el canal para la carga celular, los depósitos de entrada de productos químicos y la salida de desechos. Las marcas de alineación están diseñadas para las dos capas. Para la segunda capa, la longitud y anchura del canal de entrada de serpentina aguas arriba es de 60 mm y 200 μm, respectivamente; La longitud y anchura del canal de entrada serpentina aguas abajo es de 6 mm y 280 μm, respectivamente; ( B ) Ilustración del método de aislamiento de células todo en chip; ( C ) Ilustración de la prueba de quimiotaxis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Resultados representativos deEl todo-en-chip neutrófilo quimiotaxis análisis [ 25] . ( A ) imagen de tinción de Giemsa (utilizando un objetivo de 60X) de las células aisladas de todo en el canal microfluídico; ( B ) Comparación de la distribución celular en el control del medio, un gradiente de 100 mM de fMLP y un gradiente de esputo de EPOC; ( C ) La distancia media de migración celular en el canal de gradiente en el control del medio, un gradiente de fMLP y un gradiente de esputo de EPOC. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM). * Indica p <0,05 de la prueba t de Student. Las cifras fueron adaptadas de la referencia 25 con permiso de World Scientific Publishing. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este artículo, se describió un protocolo detallado para aislar directamente los neutrófilos de la sangre entera seguido de la prueba de quimiotaxis, todos en un único chip microfluídico. Este método ofrece características útiles en su fácil operación, selección negativa de neutrófilos de alta pureza, prueba rápida de quimiotaxis de muestra a resultado, reducción de reactivos y consumo de muestras y análisis preciso de datos de migración celular. Como una estimación aproximada, al menos el 25% de los neutrófilos de la muestra de sangre total de entrada entró efectivamente en la estructura de acoplamiento en el dispositivo y se encontró que la pureza de neutrófilos es alta por medio de la viruta Giemsa tinción.

Este método de análisis de quimiotaxis de todo-en-chip desarrollado tiene un gran potencial en diversas investigaciones de migración celular y aplicaciones clínicas. Se demostró una aplicación de investigación de este método comparando la quimiotaxis de neutrófilos en medio solo con un gradiente de fMLP. De forma similar, este método puede usarse para probar la quimiotaxis de neutrófilos en EPOC spuComo un ejemplo de desarrollo de un biomarcador funcional celular para el diagnóstico clínico. Con este método, un investigador puede fácilmente probar la quimiotaxis de neutrófilos a diferentes quimioatractores individualmente o en combinaciones. Los investigadores también pueden probar la quimiotaxis de neutrófilos a factores quimiotácticos complejos de pacientes o probar neutrófilos de pacientes enfermos para la respuesta de quimiotaxis potencialmente alterada usando este método. Este método integrado todo en un chip es particularmente útil para realizar la prueba en laboratorios de investigación o clínicos que no cuentan con un cultivo de células especializado y con instalaciones de imágenes de células vivas. La prueba puede ser operada fácilmente por investigadores o médicos siguiendo este protocolo. Para aplicaciones de investigación más avanzadas, este método permite que la microscopía de lapso de tiempo rastree el movimiento celular individual.

En general, este método todo-en-chip es fácil de operar y el resultado es robusto. Varios recordatorios técnicos asegurarán además un experimento exitoso. Primero, elLa réplica de PDMS se debe presionar suavemente sobre el sustrato de la clase durante la unión del plasma para evitar dañar el canal de barrera muy delgado. En segundo lugar, la evaporación del medio en el puerto de carga celular puede alterar el gradiente químico. Se recomienda cubrir el puerto de carga celular con una lengüeta de sellado durante la prueba de quimiotaxis. En tercer lugar, la muestra de sangre debe cargarse suavemente en el dispositivo para evitar la alta presión que puede empujar las células sobre el canal de barrera antes del experimento de quimiotaxis. En cuarto lugar, en el ajuste actual, recomendamos mantener los imanes unidos al puerto de carga de células durante el ensayo de quimiotaxis para evitar que las células no deseadas entren en el canal. Alternativamente, una pieza separada de PDMS con un orificio pasante y los discos magnéticos unidos pueden alinearse con el puerto de carga de células del dispositivo. En este caso, la parte PDMS superior con los discos magnéticos y las células atrapadas se pueden retirar del dispositivo después del aislamiento celular.

Este todo-en-chIp se puede desarrollar aún más para superar sus limitaciones actuales y para mejorar y ampliar sus funcionalidades. En primer lugar, el dispositivo actual sólo permite un único ensayo a la vez, limitando así el rendimiento. El desarrollo ulterior del dispositivo con múltiples unidades de prueba paralelas mejorará el requerimiento de rendimiento experimental. En segundo lugar, el actual generador de gradientes químicos basado en flujo limita la generación de gradiente en 1D. El desarrollo posterior de generadores de gradiente sin flujo 2D o 3D mejorará la imitación de las condiciones del gradiente fisiológico. En tercer lugar, además de los neutrófilos, este método todo en chip, en principio, puede usarse para probar otros tipos de glóbulos blancos tales como células T, células B y células NK utilizando kits de aislamiento de células magnéticas similares. Será importante estudiar si este método puede utilizarse eficazmente para probar las poblaciones de células sanguíneas a menor frecuencia y aquellas células que requieren activación y cultivo en chip antes de la prueba de quimiotaxis. A continuación, el método de aislamiento de células todo en chip caN se ampliará aún más para algunas otras aplicaciones. Se ensayaron diferentes grosores de canal de barrera y los resultados mostraron que 3-4 μm es el más adecuado para el experimento de migración de neutrófilos; Es decir, atrapó suficientemente a las células no estimuladas y permitió que las células se arrastraran a través del canal de barrera tras la estimulación. La dimensión del canal de barrera debe ser optimizada para diferentes tipos de células. Finalmente, esta prueba integrada y rápida de quimiotaxis permitirá a los investigadores explorar aplicaciones clínicas relevantes. Para permitir pruebas prácticas en clínicas, se ha desarrollado un sistema portátil que integra el dispositivo microfluídico, control de temperatura y escenario, así como módulos de imagen óptica y de análisis de datos basados ​​en teléfonos inteligentes. Además del estudio relacionado con la EPOC como se demostró en este trabajo, se está probando la migración celular para otras enfermedades relevantes, como la enfermedad renal crónica, utilizando este método todo en chip.

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Disclosures

No hay conflictos de interés que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo es en parte apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (CRSNG) y los Institutos Canadienses de Investigación de Salud (CIHR). Damos las gracias al Instituto Clínico de Investigación Aplicada y Educación en el Hospital General Victoria en Winnipeg y Seven Oaks General Hospital en Winnipeg para la gestión de muestras clínicas de seres humanos. Damos las gracias al Dr. Hagit Peretz-Soroka para la discusión útil sobre las estrategias de la operación de ensayo. Agradecemos a la profesora Carolyn Ren y al doctor Xiaoming (Cody) Chen de la Universidad de Waterloo por su generoso apoyo en el proceso de filmación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		 Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		 Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		 R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		 STEMCELL
Technologies Inc		 19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

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References

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Inmunología Número 124 Viruta microfluídica neutrófilos aislamiento celular quimiotaxis sangre microfluídica
Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre
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Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y.,… More

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

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