Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Published: June 23, 2017 doi: 10.3791/55615
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 1, 1, 5, 3,4,6,7
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba
* These authors contributed equally

Summary

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Abstract

Nötrofil göçü ve kemotaksis, vücudumuzun bağışıklık sistemi için kritik öneme sahiptir. Mikroakışkan cihazlar, gerçek zamanlı görselleştirme, kimyasal konsantrasyon gradyanı üretiminin hassas kontrolü ve reaktif ve numune tüketiminin azaltılması gibi avantajlarından ötürü nötrofil göçünü ve kemotaksiyi araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, doğrudan doğruya kandan, mikroakışkan araştırmacılar tarafından entegre ve kolaylıkla çalıştırılan mikroakışkan kemotaks analizi sistemlerine yönelik büyüyen bir çaba gösterildi. Bu yönde, nötrofillerin manyetik negatif arıtımını ve küçük kan hacmi numunelerindeki kemotaksis tahlilini bütünleştirmek için ilk all-on-chip yöntemi geliştirildi. Bu yeni yöntem, 25 dakika içinde hızlı numune-sonuç nötrofil kemotaksisi testine izin verir. Bu yazıda, sorun giderme stratejileri üzerine bir tartışma ile bu all-on-chip chemotaxis tahlilinin detaylı inşası, işletimi ve veri analizi yöntemi sunulmaktadır.Tations ve gelecekteki yönergeler. Tanımlanmış bir kemoatraktan, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hastasından alınan balgamın bu all-on-chip yöntemini kullanarak test eden nötrofil kemotaksis testinin temsilci sonuçları gösterilmiştir. Bu yöntem birçok hücre göçüyle ilgili araştırmalar ve klinik uygulamalar için geçerlidir.

Introduction

Kemotaksis, çözünür kimyasal konsantrasyon gradiyentine yönlendirilmiş bir hücre migrasyon süreci, bağışıklık yanıtı 1 , 2 , 3 , doku gelişimi 4 ve kanser metastazı 5 dahil olmak üzere birçok biyolojik proseste kritik rol oynar. Nötrofiller, en bol beyaz kan hücresi altkümesidir ve vücudun doğal konakçı savunma işlevlerinin sağlanmasında, ayrıca adaptif bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde 6 , 7 önemli rol oynamaktadır. Nötrofiller, bu hareketli bağışıklık hücrelerinin hem patojenden türetilen kemoatraktanlara ( örn ., FMLP) ve hem de konaktan türetilen kemoatraktanlara ( örn ., Interlökin-8) karşı kemotaksis 8'e cevap verebilmelerini sağlayan oldukça düzenlenmiş kemotaktik makinelerle donatılmıştır. Nötrofil göçü ve kemotaksi çeşitli fizyolojik sorunlara aracılık ederVe inflamasyon ve kanserler 1 , 9 gibi hastalıklar. Böylece, nötrofil kemotaksisinin doğru olarak değerlendirilmesi nötrofil biyolojisi ve ilişkili hastalıkların çalışılması için önemli bir işlevsel okuma sağlar.

Yaygın olarak kullanılan kemotaksis tahlilleriyle ( örn., Transwell assay 10 ) karşılaştırıldığında, mikro akışkan cihazlar, hassas kontrol edilen kimyasal gradyan oluşumu ve minyatürleştirme sayesinde, hücre göçü ve kemotaksisin kantitatif değerlendirmesi için büyük bir vaat göstermektedir. 11 , 12 , 13 . Son yirmi yılda, farklı biyolojik hücre tiplerinin, özellikle de nötrofillerin kemotaksisini incelemek için çeşitli mikroakışkan cihazlar geliştirildi. Spatiyotik olarak kompleks che'de nötrofil göçü karakterize etmek için önemli çaba sarf edildi Mikroakışkan cihazlarda 14 , 15 yapılandırılmış olan mical gradyanlar. Nötrofiller tarafından mikroakışkan cihazlar 16 kullanılarak yönsel karar verme eğitimi için ilginç stratejiler geliştirildi. Biyolojik yönelimli araştırmanın yanı sıra, mikroakışkan cihazların uygulamaları hastalığın değerlendirilmesi için klinik örneklerin test edilmesi için genişletildi 17 , 18 , 19 . Bununla birlikte, birçok mikroakışkan cihazın kullanımı uzmanlaşmış araştırma laboratuvarlarıyla sınırlıdır ve büyük miktarda kan numunesinden uzun süre nötrofil izolasyonu gerektirir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde nötrofil kemotaksis analizi için entegre mikroakışkan cihazlar geliştiren büyümekte olan bir eğilim, tam damla bir damla 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Bu yönde, manyetik negatif nötrofil saflaştırma ve takip eden kemotaksis analizini tek bir mikroakışkan cihaz üzerinde bütünleştiren all-on-chip metodu geliştirildi. Bu all-on-chip yöntemi aşağıdaki yeni özelliklere sahiptir: 1) nötrofilleri yapışkan tabanlı hücre yakalama veya hücre boyutuna dayanan filtreleme 20 , 22 ile kandan izole eden önceki çipli stratejilerin aksine, bu yeni yöntem, Saflık, nötrofillerin küçük hacimlerde tam kandaki manyetik ayrımının yanı sıra kemoatraktan uyarımı üzerine kemotaksis ölçümü; 2) hücre yerleştirme yapısı nötrofillerin başlangıç ​​konumlarını kimyasal gradyan kanalına yakınlaştırmaya yardımcı olur ve tek hücre izlemesi olmaksızın basit kemotaks analizi yapılmasına izin verir; 3) nötrofil izolasyonu ve kemoterapiEksen tayini, deneysel adımlar arasında herhangi bir kesinti olmadığında, 25 dakika içinde hızlı örnek-sonuç kemotaksis analizine olanak tanır.

Bu yazı, all-on-chip chemotaxis testinin yapımı, çalışması ve veri analizi yöntemi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu makale, bilinen bir rekombinant kemoatraktan ve kompleks kemotaktik numuneleri hastalardan test ederek nötrofil kemotaksisi gerçekleştirmek için gelişmiş yöntemin etkin kullanımını ve bunu takiben sorun giderme stratejileri, sınırlamaları ve gelecekteki yönergeler üzerine bir tartışma ortaya koymaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm insan numunesi toplama protokolleri, Winnipeg Manitoba Üniversitesi'nde Ortak Fakülte Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı.

1. Mikroakışkan Cihaz Üretimi ( Şekil 1A )

  1. Şeffaflık maskesi tasarlayın ve yazdırın.
    1. Aygıtı daha önce ayrıntılı olarak tasarlayın 25 . Bkz. Şekil 1A .
      NOT: Cihaz iki kat içerir. İlk katman (4 μm yüksekliğinde) hücrenin yerleştirme bariyer kanalını, degrade kanalın yanındaki hücreleri yakalamak için tanımlar. İkinci kat (60 μm yüksekliğindeki) gradyan oluşturan kanal, hücre yüklemesi için port ve kanal, kimyasal giriş rezervuarları ve atık çıkışı tanımlanmaktadır. Hizalama işaretleri iki katman için tasarlanmıştır. İkinci kat için sıralı serpantin giriş kanalının uzunluğu ve genişliği sırasıyla 60 mm ve 200 μm'dir; Akışaşağısının uzunluğu ve genişliğiSerpantin giriş kanalı sırasıyla 6 mm ve 280 um'dir.
    2. Birinci ve ikinci katman özelliklerini, yüksek çözünürlüklü bir yazıcı kullanarak şeffaflık maskesine basın.
      NOT: Baskı çözünürlüğü, tasarımdaki minimum özelliklere bağlıdır. Mevcut tasarımda, minimum 10 μm boyutunda minimum 32.000 dpi seçilmiştir.
  2. Silisyum gofreti temizleyin.
    1. Plazma temizleyicisine 3 inç silikon gofret yerleştirin. 3 dakika vakum uygulayın.
    2. Plazma gücünü açın ve seviyeyi YÜKSEK olarak ayarlayın. 30 dakika süreyle silikon gofreti muamele etmek için oksijen plazma kullanın.
    3. Plazma temizleyicisini kapatın ve silikon gofreti çıkarın; Silikon gofret cihaz kalıbının imalatı için hazırdır.
  3. Bir temiz oda tesisinde fotolitografi ile ilk katmanı hazırlayın.
    NOT: Kesin imalat parametreleri imalat tesisine bağlı olarak değişebilir.
    1. 10 mL SU-8 2025'i 10 mL SU-8 2000'de tasarlanmış bir foto rezistansı hazırlamak için bir cam kırıcıda. Kabarcıklar kaybolana kadar karışımı duman kaputunda 10 dakika bırakın.
    2. Temizlenmiş silikon gofreti uygun torna aynası ile eğiriciye dikkatlice yerleştirin ve silikon gofreti hareketsiz hale getirmek için vakum uygulayın.
    3. Dikkatle silikon gofretin merkezine 3 mL fotorezist karışım dökün. 500 rpm'de 5 sn hızında döndürün. Daha sonra, silikon gofret üzerinde son 4 μm kalınlıkta bir fotorezist kaplama elde etmek için 3000 rpm'de 30 saniye boyunca döndürün.
    4. Silindirli gofreti eğiriciden dikkatlice çıkarın ve 95 ° C'de 4 dakika boyunca bir ocak plakasında silikon gofreti fırında pişirin.
    5. Silikonlu gofreti bir maske ayarlayıcıya dikkatlice yerleştirin ve UV'ye maruz kalma süresini 6 saniyeye ayarlayın. Yapışkan bant kullanarak saydam bir cam plaka üzerine birinci katın asetat maskesini dikkatlice takın.
    6. Ekli maske ile şeffaf cam plakayı hafifçe hizalayıcıya yerleştirin ve maskeyi silikon gofretle hizalayın. Si'yi açığa vurmaHücre yuvası yapısını şekillendirmek için UV'ye licon wafer yerleştirin.
    7. Cam plakayı dikkatlice çıkarın ve maruz kalmış silikon levhayı çıkarın. Silikon gofreti, 95 ° C'de 4 dakika boyunca bir ocak gözüne fırında pişirin.
    8. Silikonlu gofreti bir duman davlumbazına aktarın ve SU-8 geliştiricisini içeren bir cam kaba yerleştirin. 30 saniye boyunca hafifçe çalkalayın.
    9. Silikonlu gofreti, tazyikli davlumbazın içindeki SU-8 geliştiricisini takiben izopropil alkol (IPA) kullanarak temizleyin. Duman kaputunun içindeki azot gazı ile silikon gofreti kurutun; Ilk kat hazır.
  4. İlk katmanda ikinci katmanı hazırlayın.
    1. İlk katmandaki hizalama işaretlerini örtmek için yapışkan bant kullanın. İlk tabakalı silikonlu gofreti eğiricinin vakum mandreline dikkatle yerleştirin ve silikon gofreti hareketsiz hale getirmek için vakum uygulayın.
    2. Silikon gofret üzerine 3 mL SU-8 2025 fotorezisti dökün. Silikon gofreti 500 rpm'de 5 saniye döndürün. Daha sonra 2000 dev / dak'da 30S ile silikon gofret üzerinde son 60 μm kalınlıkta bir fotorezist kaplama elde edildi.
    3. Silikon gofreti döndürücüden dikkatlice çıkarın ve bir ısı plakasına aktarın; 65 ° C'de 2 dakika fırında pişirin.
    4. İlk katmandaki hizalama işaretlerini ortaya çıkarmak için yapışkan bandı hafifçe çıkarın. Bir ısıtma plakasına silikon gofret koyun ve 6 dakika boyunca 95 ° C'de fırında.
    5. Silikonlu gofreti bir maske ayarlayıcıya dikkatlice yerleştirin ve UV pozlama süresini 18 saniyeye ayarlayın.
    6. Yapışkan bant kullanarak şeffaf cam plaka üzerine ikinci tabakanın saydamlık maskesini dikkatlice takın.
    7. Ekli maske ile birlikte cam plakayı dikkatlice hizalayıcıya yerleştirin ve hizalayıcı denetim mikroskopunu kullanarak çapraz hizalama işaretleri ile maskeyi ve ilk katmanı silikon gofret üzerinde hizalayın.
    8. Hücre yükleme ve degradasyon kanallarını şekillendirmek için UV'ye fotorezist kaplı silikon gofreti maruz bırakın.
    9. Cam plakayı dikkatlice çıkarın ve silikonu çıkarın wafer. 65 ° C'de 2 dk'lık bir ısı plakası üzerine silikonlu gofret fırında pişirin ve daha sonra başka bir 95 ° C'lik sıcak plaka üzerine silikonlu gofreti aktarın ve 6 dakika fırında pişirin.
    10. Silisyum gofreti duman kabına aktarın ve SU-8 geliştiricisini içeren bir cam kaba koyun. Bunu hafifçe 6 dakika sallayın.
    11. Silikonlu gofreti, taze SU-8 geliştiricisini kullanarak ve ardından davlumbazın içinde IPA ile temizleyin.
    12. Duman kaputunun içindeki azot gazı kullanarak silikon gofreti kurutun. Bir ısıtma plakası üzerine silikon gofret yerleştirin ve sert kalıp 150 ° C'de 30 dakika pişirin; Ikinci kat hazır.
  5. Ana kalıp yüzey modifikasyonu.
    NOT: Yumuşak litografide kalıptan polidimetilsiloksan (PDMS) serbest bırakılmasını kolaylaştırmak için SU-8 kalıba bir silanasyon yüzey değiştirme adımı uygulanır.
    1. Bir mikropipet ucu içinde 10 uL tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil (triklorosilan) solüsyonu alın. Mikro pipet ucunu 15 mL'lik bir plastik tüp içine yerleştirin.Tüpün kapağını gevşetin.
    2. Tüp ve SU-8 desenli silikon gofreti bir desikatör içine yerleştirin ve vakumu 1 saat boyunca uygulayın; Maske kalıp PDMS cihaz imalatı için hazırdır.
  6. PDMS cihazını hazırla.
    1. Plastik bir behere 40 gr PDMS tabanı ve 4 gr sertleştirici madde karıştırılarak PDMS solüsyonu hazırlayın. Hazırlanmış SU-8 ana kalıbı bir Petri kabına yerleştirin ve kalıba 44 gr PDMS çözeltisi dökün.
    2. Petri kabını bir desikatöre yerleştirin ve 20 dakika süreyle PDMS solüsyonunu boşaltmak için vakum uygulayın. Daha sonra Petri kabını bir fırına yerleştirin ve 2 saat boyunca 80 ° C'de PDMS'yi tedavi edin.
    3. Pişirdikten sonra, Petri kabını çıkarın ve temiz bir tezgah üzerine yerleştirin. Dikkatle PDMS döşeme SU-8 kalıp kesme ve soyma.
    4. 3 mm çapında bir delici kullanarak hücre yükleme portunu delin. 6 mm çapında bir delici kullanarak kimyasal giriş rezervuarlarını ve atık çıkışını delin.
    5. Üzerindeki tozu çıkarın.Yapışkan bant kullanarak PDMS levhanın yüzeyini. PDMS levhasını ve temiz bir cam slaytını plazma makinesine yerleştirin. Vakumu vakit 3 dk uygulayın.
    6. Plazma gücünü açın ve seviyeyi YÜKSEK olarak ayarlayın. Hava valfını yavaşça ayarlayın ve PDMS levhasını ve cam slaydını 3 dakika boyunca plazma ile işleme sokun.
    7. Plazma gücünü kapatın ve vakumu açın. PDMS levhasını ve cam slaydı cımbızla dikkatlice çıkarın.
    8. PDMS levhasını (kanal yapıları aşağı bakacak şekilde) cam slaytın üzerine derhal yerleştirin; Cama yapıştırmak için PDMS levhasına hafifçe bastırın. Mikroakışkan kanalı hemen deiyonize su ile doldurun; Mikroakışkan aygıt imalatı ve montajı tamamlanır.

2. Mikroakışkan Hücre Geçiş Testi Hazırlama

  1. Mikroakışkan aygıt hazırlığı.
    1. 950'ye kadar stok fibronektin solüsyonundan (1 mg / mL) 50 μL seyrelterek 50 μg / mL fibronektin solüsyonu hazırlayın81; Biyogüvenlik kabininde Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS).
    2. 9 mL Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI-1640) ve% 4 sığır serumu albumin (BSA) ile 1 mL RPMI-1640 karıştırarak göç ortamı hazırlayın.
    3. Deiyonize suyu cihazdan çıkarın.
    4. Cihaza 100 μL fibronektin solüsyonu ilave edin. Tüm kanalların fibronektin çözeltisi ile dolduğundan emin olmak için 3 dakika bekleyin. Mikroakışkan cihazı kapalı bir Petri kabına oda sıcaklığında 1 saat süreyle yerleştirin.
    5. Fibronektin solüsyonunu cihazdan çıkarın. Prizden 100 μL geçiş ortamı ekleyin. Tüm kanalların geçiş medyasıyla dolu olduğundan emin olmak için 3 dakika bekleyin.
    6. Cihazı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin; Cihaz daha sonra kemotaksis denemesi için hazırdır.
  2. Kemotaksis deneyi için kemoatraktan çözeltisi preparatı.
    1. 100 nM fMLP çözeltisi hazırlayın1 mL migrasyon ortamı. 1.5 mL tüp içinde fMLP çözeltisi ile 5 μL stok FITC-Dekstran (10 kDa, 1 mM) karıştırın.
      NOT: Degrade ölçümü için FITC-Dextran kullanılır. Alternatif olarak degradasyon göstergesi olarak Rhodamine kullanın. FMLP kemoatraktan çözeltisi daha sonra kemotaks deneyi için hazırdır.
  3. Balgam numunesinin hazırlanması.
    NOT: KOAH hastalarından balgam numunesi gradiyenti ile indüklenen nötrofil kemotaksis, bu all-on-chip yönteminin klinik tanı uygulaması olarak test edilmiştir.
    1. KOAH hastalarından balgam numuneleri toplamak için bir insan etik protokolü edinin.
      NOT: Winnipeg'deki Seven Oaks Genel Hastanesinde (Manitoba Üniversitesi tarafından onaylanan) numune toplamak için onaylar aldık.
    2. Bilgilendirilmiş yazılı onay formlarını tüm konulardan elde edin.
    3. KOAH hastalarının spontan balgam numunelerini toplayın. 1,5 mL tüp içine 500 mcL balgam örneği yerleştirin.
    4. 500 uL% 0.1 di1.5 mL tüp içinde tiyotreitol ilave edin ve hafifçe karıştırın. Tüp 37 ° C'de 15 dakika su banyosuna yerleştirilir.
    5. Numuneyi, 753 xg'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı toplamayın. Süpernatantı 865 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve son süpernatanı toplayın. Toplanan süpernatanı, kullanmadan önce bir -80 ° C dondurucuda saklayın.
    6. Kemotaksis denemesi için hazır olunca, balgam çözeltisini çözdürün; 900 mcL migrasyon ortamını 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve biyogüvenlik kabini içinde 100 μL balgam karışımı ile karıştırın; Balgam çözeltisi daha sonra kemotaksis deneyi için hazırdır.
  4. Kan örneği toplanması.
    1. Sağlıklı bağışçılardan kan örnekleri toplamak için bir insan etik protokolü edinin. Bilgilendirilmiş yazılı onay formlarını tüm kan bağışçılarından edinin.
      NOT: Burada örnekler Winnipeg'deki Victoria Genel Hastanesi'nde (Manit Üniversitesi, Ortak Fakülte Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır)OBA).
    2. Kan örneğini damar tıkanıklığı ile alın ve numuneyi bir EDTA kaplı tüp içine koyun. Deneyden önce tüpü biyogüvenlik kabininde tutun.

3. Tümüyle çipte Kemotaksis Testi Çalışması

  1. Çip üstü hücre izolasyonu ( Şekil 1B ).
    1. Biyogüvenlik kabini içinde 1.5 mL'lik bir tüpe 10 mcL tam kanı yerleştirin.
      NOT: Kan örneğinin toplanması ile ilgili ayrıntılar bölüm 2.4'te verilmiştir.
    2. 1.5 mL tüp içine nötrofil izolasyon kitinden (materyal tablosuna bakın) 2 μL antikor kokteyli (Ab) ve 2 μL manyetik parçacıklar (MP) ekleyin ve hafifçe karıştırın; Bu, nötrofiller haricinde kandaki hücreleri işaretleyecektir.
    3. Kan-Ab-MP karışımını oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Bu, kandaki antikor etiketli hücreleri manyetik olarak etiketleyecektir.
    4. Hücrenin iki tarafına iki küçük manyetik disk takın.Cihazın ortası. Ortamı, cihazın tüm portlarından aspire edin.
    5. Hücre yükleme limanından mikro-akışkan cihaza yavaşça 2 mcL'lik kan-Ab-MP karışımı pipetleyin.
      NOT: Manyetik olarak işaretlenmiş hücreler, hücre yükleme portunun yan duvarlarına sıkışırken nötrofiller cihaza akar ve hücre yerleştirme yapısında sıkışırlar.
    6. Yeterli nötrofiller hücrenin yerleştirme alanına sıkışana kadar birkaç dakika bekleyin.
  2. Kemotaksis tahlili ( Şekil 1C ).
    1. Mikroakışkan cihazı 37 ° C'de sıcaklık kontrollü mikroskop sahnesine yerleştirin.
    2. İki pipetleyici kullanarak belirlenmiş giriş rezervuarlarına 100 μL kemoatraktan solüsyonu (fMLP veya balgam solüsyonu) ve 100 μL migrasyon ortamı ekleyin; Bu, gradyan kanalında, sürekli bir laminer akışa dayalı kimyasal karışımın, bir basınç uygulamanın yardımıyla bir kemoatraktan gradyanı oluşturacaktırE dengeleme yapısı.
      NOT: KOAH'lı hastalardan alınan balgam toplama detayları 2.3. Bölümde verilmiştir.
      1. Orta kontrol deneyi için, sadece giriş haznelerinin her ikisine de göç ortamı ekleyin.
    3. Gradient kanalında FITC-Dextran'ın floresan görüntüsünü elde edin.
    4. "File | Open" komutunu kullanarak görüntüyü ImageJ yazılımına aktarın.
    5. "Analyze | Plot Profile" komutunu kullanarak degrade kanalı boyunca floresans yoğunluğunu ölçün.
    6. Daha fazla çizim yapmak için ölçüm verilerini bir elektronik tabloya verin.
    7. Cihazı, sıcaklık kontrollü mikroskop aşamasında veya 15 dakika geleneksel hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
    8. Degrade kanalı, hücrelerin veri analizi için son konumlarını kaydetmek için 10X'lik bir objektif kullanarak görüntüler.
    9. Gerekirse, zaman atlamalı mikroskopi ile cıhazdaki hücre göçünü kaydedin.

4. Hücre Göçü DAta Analizi ( Şekil 1C )

  1. Kemotaksis tahlilini aşağıda tarif edildiği gibi yerleştirme yapısından hücre göç mesafesini hesaplayarak analiz edin. Bkz. Şekil 1C .
  2. Görüntüyü NIH ImageJ yazılımına alın (ver 1.45).
  3. Degrade kanala hareket eden her hücrenin merkezini seçin.
  4. Seçilen hücrelerin son konumları için koordinatlarını ölçün. Kenetleme yapısının kenarındaki bir noktanın koordinatını başlangıç ​​referans konumu olarak ölçün.
  5. Ölçülen koordinat verilerini elektronik tablo yazılımına aktarın ( örn. Excel). Hücrenin son konumu ile degrade yönü boyunca başlangıçtaki referans konumu arasındaki fark olarak hücrelerin göç mesafelerini hesaplayın.
  6. Bir mikrometreye kadar olan mesafeyi kalibre edin. Tüm hücrelerin migrasyon mesafesinin ortalama ve sapmasını, kemotaksisin bir ölçüsü olarak hesaplayın.
  7. Mig karşılaştırOrtam kontrol deneyi için bir kemoatraktan degrade varlığında, Student t testini kullanarak rasyon mesafesi.
  8. Hücrenin göç zamanlama görüntüleri kaydedilirse, hücre göçü ve kemotaksis, hücre izleme analizi 15 ile daha da analiz edilebilir.
    NOT: Tüm yongada kemotaksis tahlilini oluşturmak ve gerçekleştirmek için gerekli materyaller, malzeme tabloda ayrıntılı olarak verilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nötrofiller mikroflüidik aygıta doğrudan tam damla bir damla seçilir. İzole edilmiş nötrofillerin saflığı çip üzerinde Giemsa boyaması ile doğrulandı ve sonuçlar nötrofillerin tipik halka şeklindeki ve lob şeklindeki çekirdeklerini gösterdi ( Şekil 2A ) 25 . Bu, küçük bir hacimdeki tüm kandan yüksek saflıkta etkili bir çipte nötrofil izolasyonu olduğunu gösterir. Ayrıca, yerleştirme yapısı, kimyasal gradyan ( Şekil 2B ) 25 uygulamadan önce degrade kanalı yanındaki hücreleri etkin bir şekilde hizalayabilir.

Gradient üretimi, sürekli laminer akışlı kimyasal karıştırma esasına dayanır ve akışlar, giriş ve çıkış çözümlerinin farklı seviyelerindeki basınç farkıyla yönlendirilir. Harici pompalar gerekmez. Kimyasal gradyanT, gradient kanalı boyunca FITC-Dextran'ın floresans yoğunluğu profili ile karakterize edilen mikro akışkan aygıta birkaç dakika içinde kurulur. Degrade, mevcut nötrofıl kemotaksis deneyı için yeterli zaman olan en az 1 saat sabittir ( Şekil 1C ).

Hücre göçü araştırması için all-on-chip yönteminin kullanımını göstermek için, tek başına veya fMLP gradyanında nötrofil kemotaksis karşılaştırıldı. Test sonuçları, orta kontrol deneyinde bariyer kanalı boyunca sürünen az hücrenin olduğunu gösterdi. Aksine, birçok nötrofil bariyer kanalından hızla taşındı ve 100 nM fMLP gradyanına doğru göç etti ( Şekil 2B ) 25 . Hücre migrasyon testi, fMLP gradiyenti için orta kontrole kıyasla önemli ölçüde daha yüksek olan göç mesafesi ile nicel olarak ölçülür ( 25 .

Ayrıca, potansiyel klinik uygulamalar için, tek başına ortamdaki nötrofil migrasyonu ile KOAH hastalarındaki balgam numunesi gradiyenti karşılaştırılarak on chip yöntemi gösterildi. Sonuçlar, kantitatif olarak orta kontrol ( Şekil 2B - C ) 25'e kıyasla belirgin olarak daha yüksek göç mesafesi ile belirtilen KOAH balgam gradyanına güçlü bir hücre göçü gösterdi.

Şekil 1
Şekil 1: Nötrofil kemotaksis analizi için all-on-chip yönteminin gösterimi. ( A ) Mikroakışkan cihazın illüstrasyonu. Cihaz iki kat içerir. İlk kat (4 μm yüksekliğinde) celDegrade kanalı yanındaki hücreleri yakalamak için bariyer kanalı yerleştirme. İkinci kat (60 μm yükseklik) degrade üretme kanalı, hücre yüklemesi için port ve kanal, kimyasal giriş rezervuarları ve atık çıkışı tanımlar. Hizalama işaretleri iki katman için tasarlanmıştır. İkinci kat için sıralı serpantin giriş kanalının uzunluğu ve genişliği sırasıyla 60 mm ve 200 μm'dir; Sırasıyla serpantin giriş kanalının uzunluğu ve genişliği 6 mm ve 280 um'dir; ( B ) Tümüyle çipli hücre izolasyon yönteminin illüstrasyonu; ( C ) Kemotaksis testinin illüstrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Temsilci sonuçlarıÇip üzerinde nötrofil kemotaks analizi 25 . ( A ) Mikroakışkan kanaldaki all-on-chip yalıtılmış hücrelerin Giemsa boyama görüntüsü (60X objektif kullanılarak); ( B ) orta kontroldeki hücre dağılımı, 100 nM fMLP gradyanı ve bir KOAH balgam gradyanının karşılaştırılması; ( C ) Ortam kontrolundaki gradyan kanalındaki ortalama hücre göç mesafesi, bir fMLP gradyan ve bir KOAH balgam gradyan. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını (SEM) gösterir. * Öğrencinin t testinden p <0.05'i belirtir. Rakamlar, referans 25'den World Scientific Publishing'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, doğrudan tek bir mikroakışkan yonga üzerinde kemotaksis testi ile tam kandan nötrofilleri doğrudan izole etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem, kolay çalışması, yüksek saflıktaki nötrofillerin negatif seçimi, hızlı numuneden sonuç toplayan kemotaks testi, indirgenmiş reaktifler ve numune tüketimi ve doğru hücre göç verileri analizi için yararlı özellikler sunar. Kaba bir tahmini olarak, giren tam kan örneğindeki nötrofillerin en az% 25'i aygıttaki yerleştirme yapısına etkili bir şekilde girdi ve çip üzerinde Giemsa boyaması ile nötrofil saflığının yüksek olduğunu bulduk.

Bu geliştirilmiş all-on-çip kemotaks analizi yöntemi, çeşitli hücre göç araştırma ve klinik uygulamalarda büyük bir potansiyele sahiptir. Bu yöntemin bir araştırma uygulaması, ortamdaki nötrofil kemotaksisin bir fMLP gradyanı ile karşılaştırılmasıyla gösterildi. Benzer şekilde, bu yöntem COPD spu'sundaki nötrofil kemotaksisini test etmek için kullanılabilirKlinik tanı için hücre işlevsel bir biyolojik belirteç geliştirmenin bir örneği olarak tümü. Bu yöntemle bir araştırmacı, farklı kemoatraktanlara tek tek veya kombinasyon halinde nötrofil kemotaksisini kolayca test edebilir. Araştırmacılar, hastalardan alınan kompleks kemotaktik faktörlere karşı nötrofıl kemotaksiyi test edebilir veya hastalıklı hastalardaki nötrofilleri bu yöntemle potansiyel olarak değiştirilmiş kemotaksis yanıtı için test edebilir. Bu entegre all-on-chip yöntemi, özel hücre kültürü ve canlı hücre görüntüleme olanakları bulunmayan araştırma veya klinik laboratuvarlarda testi yapmak için özellikle yararlıdır. Test, bu protokolü takiben araştırmacılar veya klinisyenler tarafından kolayca kullanılabilir. Daha gelişmiş araştırma uygulamaları için bu metot, zamanaşımı mikroskopisinin bireysel hücre hareketini izlemesine olanak tanır.

Genel olarak, bu tüm-on-chip yöntemi çalıştırmak kolaydır ve sonuç sağlamdır. Birkaç teknik hatırlatma daha başarılı bir denemeyi sağlayacaktır. İlk önceÇok ince bariyer kanalına zarar vermemek için plazma yapıştırma sırasında PDMS replikası sınıf alt tabakasına yavaşça bastırılmalıdır. İkincisi, ortamın hücre yükleme limanında buharlaştırılması kimyasal gradyanı bozabilir. Kemotaksis testi sırasında hücre yükleme deliğini sızdırmaz tıkaçla kaplaması önerilir. Üçüncü olarak, kemotaks testinden önce hücreleri bariyer kanalı üzerinden itebilecek yüksek basıncı önlemek için, kan örneği yavaşça cihaza yüklenmelidir. Dördüncüsü, mevcut ayarda, istenmeyen hücrelerin kanala girmesini önlemek için kemotaksis tahlilinde mıknatısları hücre yükleme portuna tutturmanızı öneririz. Alternatif olarak, bir delikli ve manyetik diskler tutturulmuş ayrı bir PDMS parçası, cihazın hücre yükleme portuna hizalanabilir. Bu durumda, manyetik diskler ve yakalanan hücrelerin bulunduğu üstteki PDMS kısmı, hücre izolasyonundan sonra cihazdan çıkarılabilir.

Bu all-on-chIp yöntemi, mevcut sınırlamalarını aşmak ve işlevselliklerini geliştirmek ve geliştirmek için daha da geliştirilebilir. Birincisi, mevcut cihaz yalnızca bir seferde tek bir tahlil yapılmasına izin vermekte ve böylece verimliliği sınırlamaktadır. Cihazın çoklu paralel test üniteleri ile daha da geliştirilmesi, deneysel üretim gereksinimini artıracaktır. İkincisi, akımla akışa dayalı kimyasal gradyan jeneratörü 1D'de gradyan oluşumunu sınırlar. 2D veya 3D akışsız gradyan jeneratörlerinin daha da geliştirilmesi, fizyolojik eğim koşullarını daha iyi taklit eder. Üçüncü olarak, nötrofillere ek olarak, prensip olarak bu all-on-chip yöntemi, benzer manyetik hücre izolasyon kitleri kullanılarak T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri gibi diğer beyaz kan hücresi türlerini test etmek için kullanılabilir. Bu yöntemin daha düşük frekanstaki kan hücresi popülasyonlarını ve kemotaks testinden önce çip üzerinde aktivasyon ve kültür gerektiren hücreleri test etmek için etkili bir şekilde kullanılabilir olup olmadığını incelemek önemlidir. Ardından, tümleşik çip yalıtımı yöntemi caBazı diğer uygulamalar için daha da uzatılabilir. Farklı bariyer kanalı kalınlığı test edildi ve sonuçlar nötrofıl göç deneyinde 3-4 um en uygun olduğunu gösterdi; Yani uyarılamayan hücreleri yeterince sıkıştırdı ve uyarıldıklarında hücrelerin bariyer kanalı boyunca taranmasına izin verdi. Bariyer kanalı boyutu farklı hücre tipleri için optimize edilmelidir. Son olarak, bu entegre ve hızlı kemotaks testi, araştırmacıların ilgili klinik uygulamaları keşfetmelerini sağlayacaktır. Kliniklerdeki pratik testleri etkinleştirmek için, mikroakışkan cihaz, sıcaklık ve etap kontrolü ile akıllı telefon tabanlı optik görüntüleme ve veri analiz modüllerini birleştiren taşınabilir bir sistem geliştirildi. Bu yazıda gösterildiği gibi KOAH ile ilgili çalışmanın yanı sıra, kronik böbrek hastalığı gibi diğer ilgili hastalıkların hücre göçü, bu all-on-chip yöntemi kullanılarak test edilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinden (CIHR) hibeler tarafından desteklenmektedir. Winnipeg'daki Victoria Genel Hastanesi'ndeki Uygulamalı Araştırma ve Eğitim Klinik Enstitüsüne ve Winnipeg'taki Seven Oaks Genel Hastanesine, insan deneklerinden klinik örnekleri yönettikleri için teşekkür ediyoruz. Tahlil operasyon stratejileri hakkında yararlı tartışmalar için Dr. Hagit Peretz-Soroka'ya teşekkür ederiz. Çekimler sürecine cömertçe destek verdikleri için Waterloo Üniversitesi'nden Profesör Carolyn Ren ve Dr. Xiaoming (Cody) Chen'e teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		 Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)		 Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		 R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		 STEMCELL
Technologies Inc		 19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).

Tags

İmmünoloji Sayı 124 Mikroakışkan yonga nötrofil hücre izolasyonu kemotaksis kan mikroakışkanlar
Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y.,… More

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter